CS245343B1

CS245343B1 - Sposob přípravy p-difenol oxidázy

Info

Publication number: CS245343B1
Application number: CS851880A
Authority: CS
Inventors: Rudolf Apalovic; Jiri Zemek
Original assignee: Rudolf Apalovic; Jiri Zemek
Priority date: 1985-03-18
Filing date: 1985-03-18
Publication date: 1986-09-18
Also published as: CS188085A1

Abstract

Vynález sa týká sposobu přípravy enzýmu p-difenol oxidázy. Vynález rieši sposob přípravy p-difenol oxidázy kultiváciou drevokaznej huby Fomes fomentarus. Uvedeného účelu sa dosiahne tým, že izolovaný kmeň Fomes fomentarus sa kultivuje submerzne na pode s D-glukózou, kazeínom minerálnymi látkami, tiamínom, xylidínom alebo o-toluidínom v teplotnom rozmedzí 20 až 40 °C. Vynález má využitie v medicíně, klinickej biochémii a toxikologii a v analytickej chemii pri identifikácii škodlivin v prostředí.

Description

3 4 243343

Vynález sa týká spůsobu přípravy p-dife-nol oxidázy (p-difenol oxigen oxidoreduktá-za EC 1.10,3.2).

Pri príprave p-difenol oxidázy sa vychá-dza obyčajne z mikroskopických háb, napr.z Aureobasidium pullulans (Růsch R., LieseW., Berndt H.: Arch. Mikrobiol. 67, 28 /1969/)alebo Schizophyllum commune (Leonard P.j., Phillips L. E.: J. Bacteriol. 7, /1973/). Priizolácii a purifikácii uvedeného enzýmu saobyčajne frakcionujú bielkoviny získané zfermentačnej půdy zrážaním síranem amón-nym, organickými rozpúšťadlami alebo za po-užitia afinitných technik. Nevýhodou uvede-ných postupov je ich zdíhavosť, náročnostna použité materiály, predovšetkým v přípa-de přípravy afinantov.

Uvedené nedostatky rieši postup podlá vy-nálezu, využívajúci k príprave p-difenol oxi-dázy drevokazné huby druhu Fomes, ktorýpatří medzi Basidiomycetes. Podstata vyná-lezu spočívá v tom, že drevokazná huba Fo-mes fomentaru (Linne ex Fries) Kickx sakultivuje submerzne na pode zloženej z 10až 30 hmot. dielov D-glukózy, 1 až 3 dielovkazeínu, 0,5 až 12 dielov KH2PO4, 0,1 až 0,3diela NaH2PO4.12 H2O, 0,1 až 1 diel MgSO4,0,001 až 0,003 diela CuSO4, 0,0005 až 0,002diela ZnSO4, 0,0005 až 0,002 diela MnSOá,0,005 až 0,015 diela FeSO4, 0,005 až 0,015 die-la CaCl2, 0,00002 až 0,00008 diela tiamínu,0,1 až 0,001 diela xylidínu alebo o-toluidínuv 1 000 dieloch vody, pričom kultivácia pre-bieha pri 20 až 40 °C po dobu 250 až 750 ho-din za súčasného prevzdušňovania vháňa-ním vzduchu rýchlosťou 0,05 až 0,2 objemo-vého diela za minútu a v následnej izoláciiuvolnenej p-difenol oxidázy ako jedinej ex-tracelulárnej bielkoviny vysolením zrážanímorganickými rozpúšťadlami, alebo inými zná-mými postupmi. Výhodou navrhovaného postupu je jedno-duchost přípravy p-difenol oxidázy ako ajskutečnost, že na kultivačnej póde o hore-uvedenom zložení huba Fomes fomentarusuvolňuje ako jedinú enzýmaticky aktívnubielkovinu předmětný enzým do extracelu-lárneho prostredia. Příklad 1

Drevokazná huba Fomes fomentarus (Lin-ne ex Fries) Kickx kmeň 191 uložený v Zbier-ke kultur drevokazných húb Štátneho dre- várskeho výskumného ústavu v Bratislavě sakultivovala v desiatich Erlenmayerovýchbankách (objem 2 1), obsahu júcich 400 mlkultivačnej půdy zloženej z 10 g D-glukózy,1 g kazeínu, 0,5 g KH2PO4, 0,1 g NaH2PO4. . 12 H2O, 0,1 g MgSOá, 1 mg CuSO4, 5 mgZnSO4, 0,5 mg MnSO4, 5 mg FeSO4, 5 mgCaCl2, 0,02 mg tiamínu a 0,001 g o-toluidínuv 1 000 ml vody po dobu 750 hodin pri tep-lotě 20 °C na kultivačnom zariadení o frek-vencii 20 kmitov za minútu a amplitúde 25cm.

Po oddělení mycélia centrifugáciou pri 1 500 g po dobu 15 minút sa získaný super-natant zrážal síranom amónnym do nasýte-nia roztoku. Získaná zrazenina, odpovedajú-ca 4 1 kultivačnej půdy obsahovala 1,2 g biel-koviny p-difenol oxidázy o aktivitě 24 ,ukat.Příklad 2

Postupuje sa ako v příklade 1 s tým roz-dielom, že sa použil kmeň Fomes fomenta-rus 22 rovnakej zbierky, ako je uvedené vpříklade 1, ktoré sa kultivoval submerznevo fermentore o objeme 20 1, na kultivačnejpode o zložení 30 g D-glukózy, 3 g kazeínu, 2 g KH2PO4, 0,3 g Na2HPO4.12 H2O, 1 gramMgSO4, 3 mg CuSOá, 2 mg ZnSOá, 2 mg MnSOá,15 mg FeSO4, 15 mg CaCl2, 0,08 mg tiamínua 0,1 g xylidínu v 1 litri půdy pri 40 °C, podobu 250 hodin za prevzdušňovania rýchlos-ťou 0,05 1 vzduchu za minútu na 1 liter kul-tivačnej půdy.

Po odstránení biomasy sa získaný super-natant v množstve 20 1 zrážal 96 % etano-lom v objemovom pomere 1: 5. Získaná zra-zenina obsahovala 6,5 g bielkoviny, obsahu-júcej výlučné p-difenol oxidázu o aktivitě200 ^kat. Příklad 3

Postupuje sa ako v příklade 2 s tým roz-dielom, že sa kultivačná půda prevzdušňujesterilným vzduchom o rýchlosti 0,2 1 na 1liter kultivačnej půdy za minútu. Po spraco-vaní, tak ako je uvedené v příklade 2 sa zís-kalo 6,4 g bielkoviny, obsahujúcej výlučnép-difenol oxidázu o aktivitě 216 ^kat.

Vynález může nájsť široké uplatnenie vmedicíně, klinickej biochémii a toxikológiia v analytickej chémii pri identifikácii škod-livin v životnom prostředí.

Claims

η» «έ ίύ 4 PREDMET Spósob přípravy p-difenol oxidázy vyznače-ný tým, že drevokazná huba Fomes fomen-tarus (Linne ex Fries) Kickx sa kultivujesubmerzne na pode zloženej z 10 až 30 hmot.dielov D-glukózy, 1 až 3 dielov kazeínu, 0,5až 2 dielov KH2PO4, 0,1 až 0,3 diela NallPCU. . 12 H2O, 0,1 až 1 diel MgSCU, 0,001 až 0,003diela CuSOá, 0,0005 až 0,002 diela ZnSOd,0,0005 až 0,002 diela MnSCU, 0,005 až 0,015diela FeSCU, 0,005 až 0,015 diela CaCl2,0,00002 až 0,00008 diela tiamínu a 0,001 až VYNÁLEZU 0,1 diela xylidínu alebo o-toluidínu v 1 000dieloch vody, pričom kultivácia prebieha pri20 až 40 °C po dobu 250 až 750 hodin za sú-časného prevzdušňovania vháňaním vzdu-chu rýchlosťou 0,05 až 0,2 objemového dielaza minútu a v následnej izolácii uvoTnenejp-dlfenol oxidázy, ako jedinej extracelulár-nej bielkoviny vysolením, zrážaním organic-kými rozpúšťadlami alebo inými běžnými po-stupmi.