CS245213B1 - Způsob výroby mikrobiálního syřidla - Google Patents

Abstract

Vynález řeší způsob výroby mikrobiálního syřidla pro potřeby mlékárenského průmyslu, přičemž podstatou je použití kmene plísně Rhizomucor sp. MX CCF 1863 (Mezinár. federace sbírek č. 182), který je uložen ve Sbírce kultur plísní a hub, katedra botaniky nižších rostlin Karlovy university, Praha 2, Benátská 2, a současně způsob izolace enzymu. Vyšší technický účinek spočívá v náhradě nedostatkového klasického syřidla z telecích žaludků.

Description

Vynález ae týká způsobu výroby mikrobiálního syřidla, prov dukovaného nově izolovaným a popsaným plísnovým kmenem Rhizomucor sp. MX (CCP 1863).

Nedostatek přirozených zdrojů klasických syřidel především chymosinového typu (EC 3.4.23.4) vedl k hledání vhodné náhrady mezi proteolytickými enzymy, produkovanými různými mikroorganismy. Až dosud je realizována průmyslová výroba mikrobiálních syřidel nejčastěji pomocí .plísní Rhiiíomucor miehei (Cooney a Emerson) Schipper, Endothia parasitica a Rhizomucor pusillus (Lindt) Schipper.

Nevýhodou syřidla z plísněEndothia parasitica je jeho poměrně nízká tepelná stabilita, nebot při pokojové teplotě dochází během 10 hodin ke 40 % ztrátě enzymové aktivity, dále nízké rozmezí stability enzymu v poměru k pH a náročnost na purifikaci vzhledem k simultánně produkovaným toxinňm a antibiotikům ve fermentačnim médiu. Nevýhodnost použití plísně Rhizomucor pusillus k výrobě syřidla spočívá v nízké produkci enzymu za podmínek obvyklé submersní kultivace v míchaném fermentoru nebo v kultivačních baňkách na třepacím stroji. M.A.A. SCHIPPER (Studies in Mýcology, No 17, str.61, Centraalbureau voor Schimmelcultures,. Baam, Dec. 1978) s odvoláním na další autory uvádí, že výtěžek syřidlového enzymu u Rhizomucor pusillus činí nejvýše 4 % výtěžků, dosahovaných při použití plísně Rhizomucor miehei.

v

Uvedené nedostatky odstraňuje způsob podle vynálezu, jehož podstatou je zjištění, že pomocí nově izolovaného a níže popsaného kmene plísně Rhizomucor sp.MX č. CCP 1863 se získá velké množství syřidlového enzymu, který má poměrně nízkou nespecifickou proteolytickou a lipolytickou aktivitu vedle vysoké sýřivé (koagulační) aktivity, viz. tab.1., přmčemž se postupuje tak, že produkční kmen podle vynálezu se kultivuje na vhodném živném

- 2 245 213 prostředí a vyprodukovaný enzym se izoluje.

v

Tab·1 Enzymová aktivita plísnového syřidla podle vynálezu ve srovnání s komerčním preparátem Renniíase NOVO

Produkční kmen

Rhizomucor sp. MX č.GGP 1863

Rhizomucor miehei

Označení preparátu

MX šarže 3

RenniĚase

NOVO

Sýřivá (koagulační ) aktivita ^xSJ.ml“'

45.714

58.400

Nespecifická proteolytická aktivita «J.ml ^T

290

310

LJpolytická aktivita

154

286 ^xxxJ.ml-¹

Soxhletovy jednotky. Mírou sýřivé (koagulační) aktivity, uvedené v tab. 1 a 3 je množství enzymu, které zkoaguluje 1 ml mléka při teplotě 35 °C za 40 minut„ _οτ .._π-1 M (ml) 2400 (s) ,„_nn

SJ·¹“¹ = B · rís) * ¹⁰⁰⁰

M = ml mléka ; E = množství enzymu; T = doba počátku koagulace mléka azokaseinová jednotka = 1 jig rozštěpeného azokaseinu . h”’' při 37 °C jednotky relativní k miliekvivalentům rozštěpeného substrátu (tributyrin)

Kmen plísně Rhizomucor sp. MX byl izolován z bramborových hlíz, napadených hnilobou, a uložen ve JSbírce kultur plísní a hub (Iďezinár. federace sbírek Č.182), katedra botaniky nižších rostlin Karlovy university Praha 2, Benátská 2, pod č. GGP 18£3.

- 3 245 213

Použitý kmen Rhizomucor sp. MX CCF 1863 lze charakterizovat takto :

při kultivaci na sladinovém agaru při teplotě 37 °C vznikají kolonie 1<<3 πΛ· vysoké, zprvu šedomodré, později hnědošedé až tmavošedé. Rhizoidy slabě vyvinuty, sporangiofory větvené,

5,7 až 9,0 jim silné. Sporangia (45-50 jim) s inkrustovanou stěnou ve zralosti praskající, kolumely opakvejčité, někdy až hruš kovitého tvaru (30^35 Jim), sporangiospory široce oválné, většinou téměř kulovité, 2,9 eí 3,9 Jim v průměru. Zygospory nebyly spatřeny, stolony 10 až 20 um silné. Azygospory rovněž nebyly nalezeny. Dobře roste i sporuluje při 30 G, při 37 G je růst rychlý. Použitý kmen podle vynálezu se odlišuje od typové kultury Rhizomucor pusillus (Lindt) Schipper množstvím tvorby a tepelnou stabilitou syřidlového enzymu, hydrolýzou kaseinu a velikostí sporangiío Další znaky, jako nepřítomnost zygospor, azygospor, růstová nezávislost na thlaminu, šířka stolonů, velikost kulumely, růst na sacharóze, brání zařadit kmen podle vynálezu do skupiny druhu Rhizomucor miehei (Cooney et Emerson) Schipper. Souhrn znaků je uveden v tab.č.2.

Způsob podle vynálezu je blíže objasněn v následujících příkladech fermentace a izolace nového mikrobiálního syřidla, aniž se těmito příklady omezuje rozsah ochrany.

Výhody způsobu podle vynálezu spočívají v jednoduchosti provedení, přičemž se získává enzymový preparát neobvyklé čisto ty, s dobrým výtěžkem syřidlové (koagulační) aktivity - viz. tab. 3.

Příklad uchovávání produkčního kmene.

Kultura Rhizomucor sp. MX (CCF 1863) se uchovává na šikmém sladinovém agaru nebo ve zkumavkách se sterilními· bramborovými klínky, zalitými 2 3 ml tekuté Czapek - Doxovy půdy. Kultura se nechá narůst a vysporulovat při 30 až 37 °G, potom se uloží do chladímy o teplotě + 5 °C. Přeočkování se provádí po 3 až měsících.

- 4 Tab.2 Morfologické a fyziologické znaky typových kultur

Rhizomucor pusillus a Rhizorauoor miehei ve vztahu k vlastnostem kultury Rhizomucor sp. MX (COP 1863)

245 213

Morfologické a fyziologické znaky	Rhizomucor pusillus (Lindt) Schipper	Rhizomucor miehei (Cooney and Emer- son) Schipper	Rhizomucor sp .MX CCF 1863
Výška kolonie	1 (<2) mm	1 mm	1 3 mm
stolony šířka	•do 17 pm	do 9 pm	1Qrf20 pm
rhizoidy	slabě vyvinuty	slabě vyvinuty	slabě vyvinuty
sporangiofory (velikost)	do 11nx(l5)pm	do 7 pm	5,7«9,O pm
sporangia (průměr)	do 80«a((100)pm	do 5O(4'6o)pm	45^50 pm
kolumela	do 45x38 um zřídka vetší	do 28x25 pm zřídka větší	30x35 pm
sp o rangi o sp o ry	3»4 pra	3c£4 pm	2,9áÉ3,9 pm
zygospory	-	+	-
t hýamin-dep endenc e	-	+	-
+/hydrolýza kaseinu		( + )	+
+/sacharóza jako C-zdroj	+		+
Tvorba syřidlového enzymu za standardní/.' kultivace /KUNITZ Rennet Units.l“'/ USA pat. 1 ,108.287	z 300	* 10000	11.428 I i
Tepelná stabilita syřidlového enzymu	4· + ^ Q 15 /65 C 10% aktivity	15*/65°C 50% aktivity	i 15 765 °C 53% aktivity

+ H.J. SCHOLLER, E. MÚLLER : Path.Microbiol. 2£ (1966) 730<i741

M.A.A. SCHIPPER.: Studies in Mycology, No 17-, Dec. 1978, Baam, str. 53<7O ++ G.A. SOMKUTI, F.J. BABEL: J.Bacteriol. 9£ (1968) 1407«1414

245 213 fl

O

váného z kultu:
o	£
r—1 O	1
N •H
—	o H
03	tu
i—i	w
úd	o
•H >fd	£
ra	a>
o	-P tí
x!	X
'g r—í	p
'Cj Ή	>;
X
O	><L>
Pi	ε
X
•g	>
í>=	'Φ >
X o	8
-P	o
ra	•H
•H >O	Ή
> fl	O O
<D	ε
ft	o
3	P·
-P m
aJ	kO CO
ek	V“
>N	O
>o	O
-P
>	řP-H

σ5

- 6 245 213

Příklad přípravy inokula 1

Příprava inokula pro 1. stupeň submersní fermentace (100 l) se provede tím způsobem, že bramborové kostky, připravené z pečlivě umytých, loupaných brambor se vpraví do 1 1 Erlenmayerových baněk se širokým hrdlem a zvlhčí Czapek-Doxovým médiem.

Sterilizace 30 min. při 121 °C v autoklávu. Po sterilizaci se baňky zaočkují suspenzí spor a kultivují 34 5 dnů při 3Q«37^OC.

Příklad přípravy inokula 2

Příprava inokula submersní kultivací na rotačním třepacím stroji v 500 ml varných bankách s obsahem 100 ml živného média, následujícího složení :

sójová mouka 1% bramborová moučka 1% ječný šrot 1% melasové výpalky (60% suš.) 1%

KH₂P0₄ 0,5%

CaCO^ 0,5%

K přípravě se použije vodovodní voda asi 50 °C teplá, v níž se rozpustí 0,1% bakteriální amylasy (B.subtilis). Po cca 30^45 min. hydrolýze se živná půda rozplní a sterilizuje 30 min při 121 C v autoklávu. Po zaočkování vychlazených baněk suspensí spor a kultivaci po dobu 108 hodin vzrostl obsah syřidlového enzymu — 1 v kultivačním médiu na 3636 SJ.ml

Příklad fermentace v objemu 100 1 Příprava fermentace se provede tak, že do 100 1 vodovodní vody.;, °C teplé, ve fermentoru, se přidá asi 100 g bakteriální amylasy (B.subtilis-BOLAIÍYLASA - Slov. škrobáme, n.p, Trnava) a za míchání se dodají další živiny :

kg sójová mouka kg ovesná mouka kg_t sladový výtažek o sušině 65 %

0,5 kg plavený CaCO-j

0,3 kg KH₂P0₄

Po 60 minutách hydrolýzy se přidá 25^50 ml sojového oleje a-půda se sterilizuje 1 hodinu při 121<n 123 0. Po ochlazení fermentoru na 37 40 °C se provede zaočkování kulturou MX na hrám- 7 245 213 borových kostkách podle výše uvedeného příkladu. Do 6 baněk s dobře narostlou kulturou se nalévá po 500 ml sterilní vody tak, aby se zabránilo prášení spor. Obsah 6 baněk se asepticky promíchá a převede do fermentoru. Po zaočkování se nastaví intenzívni vzdušnění média (0,05 min“ ) a v případě nutnosti přidává odpěnovací tuk. Eermentační teplota se udržuje při 35 C.

Po dosažení maximální produkce enzymu se fermentace ukončí.

V 1 litru prokvašeného média z laboratorního fermentoru byl zjištěn obsah syřidlového enzymu v rozmezí hodnot 4700 až 6480 SJ_sffll¹a

Příklad izolace syřidlového enzymu 1

K izolaci syřidlového (koagulačního) enzymu z fermentačního média se použije vsádkový způsob iontoměnné soi^pce na slabý katex 0STI0MM (OTICHEM, n.p. Ústí n.lj (Amberlit XE 64), 0,315 mesh, připravený v H⁺cyklu„ K 2400 ml filtrátu fermentačního média, zbaveného my celu, se přidá 500 ml vlhkého iontoměniče.

Po 30 min. míchání směsi dojde k poklesu pH z hodnoty 5,4 na 3,5 a k ukončení sorpce. Matečný roztok se odfiltruje nebo odstraní dekantací, 1x promyje destilovanou vodou a k sorbentu se naleje 250 ml 0,5 mol roztoku Nad. Hodnota pH se upraví z 3,0 na 5»5ajě 6,0 roztokem 30 %> NaOH a směs se 30 min míchá. Katex se oddělí filtrací přes nuč. Vzhledem k tomu, že enzym je stabilní v širokém rozmezí pH (3,0^ 7,0), upraví se eluát pouze přídavkem 0,05 mol CaClg a pH se nastaví pomocí HG1 na hodnotu 4,0 4,2. Enzymový koncentrát se konzervuje 10 % NaCl a 0, 1 0,2 % benzoanu sodného. Výsledky znázorňuje tab.č.3.

Příklad izolace syřidlového enzymu 2

Živné médium se po fermentaci plísně zbaví suspenzních podílů s mycelem filtrací nebo odstředěním. Za míchání se pH filtrátu sníží z hodnoty 5,5 na 4,0 pomocí zředěné kyseliny chlorovodíkové. K ,2400 mí filtrátu (5217 SJ.ml“^ ) se dále přidají 3 g zesítěné polyakrylové kyseliny, např. Carbopol 934 (GOODRICH) . a v míchání se pokračuje. Po 30 minutách se vytvořená sraženina odstředí a supernatant dekantuje. Aktivní sediment se resuspen245 213

- 8 duje ve 200 ml destilované vody. Po dokonalé homogenizaci se do roztoku nasype 30 g plaveného CaGO^ a směs se míchá dalších 30 minut. Vytvořený komplex nerozpustné vápenaté soli kyseliny polyakrylové se odstraní filtrací nebo centrifugací. Sirý, koncentrováný roztok enzymu se konzervuje přídavkem 10 % kuchyňské soli a 0,25 % Na-benzoanu po snížení hodnoty pH na 4,0 až 4,5 zředěnou kyselinou chlorovodíkovou. Výsledný koncentrát obsahoval 86 % původní sýřivé (koagulační) aktivity.

Enzym je možné z fermentačního média oddělit také použitím sorbentu DEAE-celulosy. V tom případě však se na iontoměnič „ váže i větší podíl pigmentu, takže výsledný koncentrát obsahuje více nečistot. Rovněž ztráty v důsledku ireverzibilní vazby na DEAE-celulóze jsou vyšší než na sorbentu Ostion KM.

Claims (2)

1. Předmět vynálezu.

   245 213

   1. Způsob výroby mikrobiálního syřidla, vyznačený tím, že se na živném médiu, obsahujícím jako C - zdroj 0,5 až 6,0 %W, cukrů, s výhodou hydrolyzovaného škrobu, 0,2 až 3,1 % Ittwt. zdroje organických dusíkatých látek, s výhodou sladového výtažku a sójové mouky, kultivuje submerzním nebo povrchovým způsobem při teplotě 25 až 40 °C a pH 4,8 až 7,2 plív sen Rhizomucor sp. MX CG? 1863, a vyprodukovaný enzym se izoluje.
2. 2. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že se syřidlový enzym oddělí z fermentačního média iontoměnnou sorpcí (výlukou) na slabém katexu z iontoměnné pryskyřice vsádkovým způsobem nebo sloupcovou chromatografii.