CS239441B1 - Způsob isolace a dělení alkaloidů agroklavinu a elymoklavinu - Google Patents

Abstract

Způsob izolace a dělení alkaloidů agroklavinu a elymoklavinu. Postupem podle řešení se získávají klavinová alkaloidy agroklavin a elymoklavin. Alkaloidy mají využití jako suroviny pro přípravu farmakologicky účinných polosyntetických derivátů námelových alkaloidů jako je nicergolin, methylergometrin, lysurid, methergolin a další.

Description

Vynález se týká způsobu izolace a dálen! alkaloidů agroklevinu a elymoklevinu.

z fermentační'tekutiny případně mycelia získaných submersní nebo povrchovou fermentací.

Agroklevin (M. Abe et. al. Jap. pat. 176 336) strukturního vzorce I

(I) a elymoklavin (M. Abe et. al. US Pat. 2 835 675) strukturního vzorce II

(II) se vyskytují především ve sklerociích různých druhů houby parazitujících na divokých travách. Oba alkaloidy jsou rovněž obsaženy v saprofytních kulturách Clevieeps purpurea, Claviceps paspali a Aspergilus funigatus. Elymoklavin byl izolován i ze semen rostlin čeledi Convolvalaceae (A. Hofmann, Planta, Med. 2» 354 (1961)). Alkaloidy slouží jako-surovina pro parciální syntézu komerčně významných derivátů odvozených od ergolenováho nebo ergolinováho skeletu (Tung-Chung Choong a H. R. Shough, Tetrahedron Letters 22» 1 627 (1977)) E. Eich Pharmazie 30, H.8 (1975), M. Semonský a N. Kucharszyk, Coll. Czech. Chem. Commun. β3.

577 (1968), J. Křepelka et. al., Coll. Czech. Chem. Commun. £2, 1 412 (1977).

Způsob výroby uvedených alkaloidů včetně izolace popisuje čs, autorské osvědčení č. 199 986 (1980). Při izolaci alkaloidů uvedeným postupem dochází obvykle k tvorbě obtížně dělitelných emulzí. K dělení obou alkaloidů sloupcovou chromatografii je nutno použít vysokých násobků silikagelu a velkých objemů rozpouštědel. Postup není vhodný k použití v provozním měřítku.

Uvedené nevýhody odstraňuje způsob podle vynálezu, který řeší zpracování fermentační tekutiny nebo mycelia různých obsahů i alkaloidního spektra. Zpracování se s výhodou provede tak, že zalkalizovaná fermentační tekutina po případném odstranění glukanů, resp. ovlhčené a zalkalizované mycelium se extrahuje organickými rozpouštědly nebo směsí organických rozpouštědel. Použijí se s vodou nemísitelná rozpouštědla jako je chloroform, methylenchlorid dichlorethan, ethylacetát, butylacetát, ether nebo jejich směsi s polárnějšími rozpouštědly, jako jsou nižší alifatické alkoholy. S výhodou se použije směs ethylacetátu s jedním až deseti procenty ethanolu. Alkaloidy z takto získaného organického roztoku se extrakcí převedou do vodného roztoku anorganické kyseliny jako je kyseliny fosforečná, chlorovodíková, sírová nebo organické kyseliny jako je kyselina vinná s výhodou do 0,5 a 1 % roztoku kyseliny citrónové.

23944,

Přeextrahevání alkaloidů z organické do vodné fáze podstatná sníží přítomnost doprovodných balastních nealkoloidních látek a umožní dalšími extrakcemi oddělit elymeklavin od doprovodných alkaloidů, případná i chanoklavinu.

Extrakcí kyselého vodného roztoku alkaloidů organickými rozpouštědly jako je chloroform nebo methylenchlorid s 0,5 až 1 % organické kyseliny jako kyselinp mandlová, benzoová, nebo ftělová s výhodou 0,5 % chloroformovým roztokem kyseliny salicylevé se dosáhne oddělení agroklavinu. Získaný extrakt se zbaví kyseliny salicylové extrakci roztokom uhličitanu sodného a vodou, organický roztok báze agroklavinu se pak zahustí na hdparek, případně dále zpracuje krystalizaci.

Rafinovaný kyselý vodný roztok elymoklavinu se zalkalizuje na pH 9 a extrahuje s β vodou nemlsitelnými organickými rozpouštědly, případně směsí organických rozpouštědel.

Je možno použít stejných rozpouštědel jako při extrakci alkaloidů z fermentačni tekutiny.

Po odpaření extrakčního činidla se pevný odparek zpracovává na čistý elymoklavin krystalizaci.

Ke kapalinovým extrakcím lze v provozním měřítku s výhodou použít kontinuálních způsobů extrakce, jako jsou rotační extraktory nebo vibrační kolony.

Výěe uvedený základní postup, kterým lze zpracovat produkty fermentace s vysokým obsahem balastních látek i doprovodných nežádoucích alkaloidů lze výhodnš modifikovat a zjednodušovat podle charakteru výchozí fermentačni tekutiny nebo mycelia a požadavků na kvalitu vyizolovaných alkaloidů.

Izolaci alkaloidů z fermentačních tekutin obsahujících málo doprovodných balastních látek lze zjednodušit a postupovat tak, že po případném odstranění glukamů se k fermentační tekutině přidá kyselina s výhodou kyselina vinná na 0,5 až 1% roztok a provede se přímo extrakce roztokem organické kyseliny. Z kyselé fermentačni tekutiny zbavené agroklavinu se po alkalizaci extrahuje elymoklavin.

K izolaci elymoklavinu z půd nebo mycelil, která obsahují převahu elymoklavinu, není nutné používat složitý výše popisovaný dělicí extrakční postup, ale je možno využít schopnosti dělení obou alkaloidů krystalizaci. Krystalizaci je možno provést u málo zmečištěných extraktů půdy nebo mycelia z částečně zkoncentrovaného extraktu po přečištění přes aktivní uhlí.

Zvláště výhodného dělicího efektu je dosaženo při krystalizaci ze směsi ethylacetátu s 1 až ,0 % etanolu. Výrazného čisticího a dělicího efektu je dosaženo i krystalizaci z metanolického roztoku odbarveného aktivním uhlím. Krystalizaci je možno zařadit v kterákoliv fázi izolačního postupu, kdy je možno alkaloidy získat v pevné formě odpařením organického rozpouštědla,, případně vysrážením z vodného roztoku. e

Úpravou pU vodného roztoku alkaloidů na hodnotu 8-9 lze alkaloidy v dobrém výtěžku vysrážet. Čistota vysrážených alkaloidů je závislá na obsahu balastních látek ve výchozím'vodném roztoku. Vysrážením alkaloidů přímo ť fermentačni tekutiny lze dosáhnout ve sraženině sumárního obsahu alkaloidů okolo 40 %, kdežto obsah alkaloidů ve sraženině získané úpravou pH kyselého vodného extraktu ze základního postupu převyšuje 80 %.

Výtěžek srážení (i kvalita sraženiny) nepřímo závisí na obsahu organických rozpouštědel v kyselém vodném roztoku. Alkaloidy, které vlivem rozpustnosti zůstávají nevysrážené, je možno získat následující extrakcí do organického s vodou nemlsitelného rozpouštědla, nebo směsi rozpouštědel nejlépe shodnou s použitou k první extrakci půdy nebo mycelia.

Uvedené postupy blíže výsvětlí následující příklady, které však neomezují rozsah vynálezu. Uváděná % jsou % hmotnostní.

Příklady provedeni

1. 850 ml fermentační tekutiny e obsahem 3 600 ^tg/ml obou alkaloidů s poměrem elymoklavinu : agroklavinu 1 : 1,6 se naředl 850 ml acetonu, vysrážená glukany se odfiltrují a neředěná půdě se zbaví acetonu odpařením na rotační vakuová odparce za vakua vodní pumpy při teplotě 40 °C. Takto upravená půda se zalkalizuje 10% amoniakem na pH 9 a extrahuje směsí ether : methenol 8 : 2 (obj/obj). Alkaloidy se přeextrehují do 1% roztoku kyseliny citrónová a ze spojených extraktů se odstření agroklavin opakovanou extrakcí 0,5% roztokem kyseliny selicylová v chloroformu. Spojená extrakty se vytřepou

x.100 ml 10% roztoku sody a 3 x 100 ml vody. Chloroformový extrakt se po vysušení síranem sodným zahustí na odparek. Získá se 1,2 g agroklavinu s celkovým obsahem 90,6 % (bezvodá titrace). obsahující 97,5 % agroklavinu a 2,5 % elymoklevinu (ΗΡΙΛ). Blymoklevin se získá opakovanou extrakcí zalkalizovanáho roztoku kyseliny citrónová směsi ether : methenol 8 : 2. Spojená organická extrakty se po vysušení zahusti na pšnovltý odparek. (0,95 g, celkový obsah alkaloidů 80 % (bezvodá titrace), 95 % elymoklavin, 1,6 % agroklavin, 3,4 % ostatní (HPI£)).

2. 100 g mycelia se ovlhčí 20 ml vody obsahující 3,3 ml·koncentrovaného amoniaku a nechá 4 hodiny stát, poté se perkoluje 300 ml směsi ethylacetátu : ethanolu 0,5 : 0,5.

Takto získaný extrakt se vytřepe 3 x 50 ml 1% kyseliny vinné. Spojené extrakty se extrahují chloroformem s 0,5% kys. salicylové. Rafinovaný kyselý extrakt se na vakuové odparce zbaví organických rozpustidel a zalkalizuje na pH 9. Suspenze vysrážených alkaloidů se vychladl na teplotu 5 °C a alkaloidy se odfiltrují. Sraženina po vysušení a překryštelování z methanolu poskytne 0,6 g elymoklavinu 99% čistoty.

3. 500 ml fermentační tekutiny s obsahem 1 500 jag/ml elymoklavinu a 500yfcg/ml agroklavinu se upraví na 1% roztok kys. vinné a extrahuje 0,5 % roztokem kys. benzoové ve směsi ether : methenol 9:1. Rafinovaná půda s obsahem kyseliny vinné s 10% amoniakem zalkalizuje na pH 9 a opakovaně extrahuje methylenchloridem, spojené organické výtřepky se po vysušení zahustí na odparek. Získá se 0,7 g elymoklavinu s celkovým obsahem 92 %.

(97 % elymoklavinu, 1,5 % agroklavinu a 1,5 % ostatních alkploidů (HPLC)). Spojené extrakty - ether-methanol s 0,5% kys. benzoové, obsahující agroklavin, se vytřepou 2 x 100 ml 10% roztoku sody a 150 ml vody. Organická fáze se vysuší síranem sodným a zahusti na odparek. Získá se 0,2 g agroklavinu celkový obsah 91 %, 96 % agroklavinu % elymoklavinu (HPLC). ‘

4. 2 000 ml fermentační tekutiny s obsahem 1 700 jug/ml elymoklavinu a 300 ^g/ml agroklavinu se naředl 2 000 ml ethanolu a nechá stát při teplotě 0 až 10 °C do druhého dne. Vysrážené glukány se odfiltrují přes vrstvu křemeliny a filtrát se na rotační vakuová odparce zbaví ethanolu. Odglukanovaná půda se zalkalizuje 10% roztokem sody na pH 9 a extrahuje 4 x 800 ml ethylacetátu s 1 % ethanolu. Spojené extrakty se zahustí na desetinu původního objemu a při teplotě -5 °C se nechají 4 hodiny krystalovat, krystal se odfiltruje a promyje ethylBcetátem, Po vysušení se získá 2,8 g krystalu s celkovým obsahem alkaloidů 92 %, 96 % elymoklavinu a 4 % agroklavinu.

5. 1 000 1 fermentační tekutiny zbavené glukanů podle příkladu 1 se zalkalizuje 10% .amoniakem na pH 9 a extrahuje se 3 000 1 směsi ether : ethanol 8 : 2 na vibračním extraktoru s 30 teflonovými patry. Nátoky fází do extraktoru se nastaví v poměru 1 objem, díl fermentované půdy na 3 obj. díly směsi rozpouštědel. Celkové prosazeni se volí m^/m² h. Disperguje se těžěl fáze, frekvence kmitů je 100 až 150/mín. Získaný extrakt se extrahuje opět na vibračním extraktoru 1% roztokem kyseliny citrónové. Na 3 obj. díly organické fáze se použije 1 obj. díl vodné fáze. Celkové prosazení je 20 nP/m² h, frekvence kmitů 150 až 200/min, disperguje se těžší fáze. Kyselý vodný extrakt se dále extrahuje chloroformem s 1 % kyseliny salicylové. Extrahuje se na odstředivém extraktoru typu Luwesta nebo Podbielnlak.

Volí se poměr 2 díly vodné fáze na 1 díl chloroformu. Vodná fáze, zbavená předchozí extrakcí agroklavinu, se extrahuje chloroformem, opět na odstředivém extraktoru s poměrem fází 1 :>1. Získaný chloroformový extrakt se zahustí, převede do metanolu a krystaluje na Slstý produkt.

Claims (5)

1. Způsob izolace a dělení alkaloidů agroklavinu a elymoklavinu vyznačený tím, že se fermentačni tekutina zalkalizovaná na pH 8,5 až 9,5 po případném odstranění glukanů, nebo ovlhčené a zalkalizované mycelium, vyextrahuje s vodou nemísitelným rozpouštědlem jako je chloroform, methylenchlorid, ether, ethylacetát nebo směsi těchto rozpouštědel, s jedním až deseti objemovými procenty ethanolu nebo methanolu, s výhodou ethylacetátem s 5 objemovými procenty ethanolu, alkaloidy se extrakcí převedou do vodného 0,5 až 1B% hmot. roztoku kyseliny vinné nebo citrónové a provede se separace alkaloidů tím, že agroklavin se extrakcí převede do 0,5 až 1 % hmot. roztoku kyseliny salicylové v chloroformu a po zalkalizovánl na pH 9 se vyextrahuje elymoklavin s vodou nemísitelným rozpouštědlem nebo směsí rozpouštědel jako při první extrakci, z nichž se izoluje odpařením rozpouštědla nebo krystalizaci.

2. Způsbb podle bodu 1, vyznačující se tím, že se fermentačni tekutina po okyselení kyselinou vinnou nebo citrónovou na 0,5 až 1 % hmot. roztok přímo extrahuje roztokem kyseliny salicylové v chloroformu o koncentraci 0,5 až 1 % hmot.

3. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se extrakt alkaloidů s převahou minimálně 80 % hmot. elymoklavinu v organickém rozpouštědle, jako je chloroform, ether methylenchlorid nebo směsi těchto rozpouštědel s jedním až deseti objemovými procenty ethanolu nebo methanolu, odpaří na desetinu původního objemu a krystalizaci se získá elymoklavin.

4. Způsob podle bodfi I a 2, vyznačující se tím, že se získaný kyselý vodný výluh alkaloidů žalkalizuje na pU 8,5 až 9 a vyloučené alkaloidy se izolují filtrací.

5. Způsob podle bodů 1, 2, 3, 4 vyznačující se tím, že se kapalinová extrakce provádí kontinuálně.