CS239033B1 - Způsob fermentačni výroby thiaminasy I - thiamin: báze 2-methyl-4-aminopýrimidin- -5-methenyltransferasy, EC 2.5.1.2 - Google Patents

Abstract

Vynález se týká aerobní kultivace mikroorganismem Bacillus Tbiominolyticus Kuno, která'se provádí ve fermentačnim médiu obsahujícím jako stimulátor produkce thiaminasy I, kvasničny autolysat v množství 0,2 až 30 g/1. Produkce thiaminasy I. lze dále zvýšit přídavkem vápníkových iontů v množství 0,01 až 5>0 g/1. Získanou thiaminasu I i v surovém stavu lze použít ke stanovení thiaminu.

Description

Vynález se týká fermentační přípravy enzymu thiaminasy

I-thiaminíbáze 2-methyl-4-aminopyrimidin-5-methenyltransferasy, EC 2.5.1.2., kterýžto enzym může být s výhodou použit pro stanovení vitaminu B^ v biologickém nebo klinickém materiálu, v potravinářských nebo farmaceutických výrobcích neb· pro vědecké účely.

Vitamin B^, tj. thiamin a jeho některé deriváty, hraje velmi důležitou roli ve výživě člověka a jeho nedostatek vede k vážným nervovým poruchám (například nemoc beri-beri způsobená silným nedostatkem vitaminu B^ nebo Wernickeho ence^alopatie způsobená nedostatkem thiaminu u alkoholiků). Potravinářské technologie, používané v současné době, vedou k suboptimální koncentraci vitaminu B^ v lidské výživě ve většině zemí,-a proto je v řadě států dávka tohoto vitaminu doplňována syntetickým thiaminem, přidávaným do mouky, pečivá, mléka a podobně. Z těchto důvodů je stanovení celkového thiaminu v jednotlivých potravinářských surovinách a výrobcích i v kli nickém materiálu velmi důležité a věnuje se mu stále větší pozornost. Zjišťované koncentrace tohoto vitaminu se pohybují většinou ve zlomcích mg/g analyzovaného materiálu, a proto je pro stanovení thiaminu všeobecně používána fluorometrická thiochromová metoda, dosahující této citlivosti. Tate metoda však vyžaduje pracnou a zdlouhavou izolaci thiaminu, jež je zatížena značnou chybou. Také příprava a aktivace Dekalsa, tj. nejpoužívanějšího sorbentu pro tuto izolaci, je poměrně pracná a časově náročná. Mikrobiologické metody stanovení tohoto vitaminu jsou zatíženy ještě větší chybou a v některých materiálech selhávají úplně.

239 033

- 2 Pracnost thiochromové metody může snížit použití enzymu thiaminasy I (thiamin:báze 2-methyl-4-aminopyrimidin-5-methenyltransferasy, EC 2.5.1.2.), který specificky Štěpí thiamin a váže jeho pyrimidinovou složku na bázi (například pyridin) přidanou do reakčního prostředí. Tím umožňuje zjistit nethiochromovou fluorescenci v analyzovaných vzorcích, takže při thiochromové analytické metodě není zapotřebí pracná a zdlouhavá izolace thiaminu z těchto vzorků. C.A.Kennedyové a B.V.McCleary (Analyst 106« 344, 1981) doporučují k tomuto účelu thiaminasu I izolovanou z listí kapračorostů vyskytujících se v Austrálii (například Marsilea drummondii, Marsilea augustifolia, Marsilea mutica, Pteridium asculentum, Cheilanthes siebri). Pro tyto účely je nutno tento enzym získat z rostlinného extraktu adsorpcí na DEAE-celulosu a eluát zahustit vakuovou destilací a přečistit opakovanou ultrafiltrací a adsorpcí.

Dalším zdrojem thiaminasy I. může být bakterie*Bacillus thiaminolyticus Kuno, která ji produkuje do fermentačního prestředí. H.A. Douthit a R.L. Airth (Arch. Biochem. Biophys.

113. 331, 1966) navrhují pro produkci a izolaci thiaminasy I pro vědecké účely inokulum Bacillus thiaminolyticus z bohaté živné půdy (infuze z mozku a srdce) a fermentační medium obsahující vedle běžných zdrojů uhlíku, dusíku a minerálií ještě značné množství glutamové kyseliny a thiamin hydrochlorid v čistém stavu. Bakteriální thiaminasu pro analytické účely izolují vysrážením enzymu z kultivační kapaliny za použití tuhého síranu amonného s následujícím přečištěním. Získaný enzymový preparát uchovávají při -20 °C.

Nedostatky spočívající v nákladné izolaci thiaminasy z rostlinného materiálu a v nákladné živné půdě používané pro produkci bakteriální thiaminasy jsou odstraněny ve způsobu výroby thiaminasy podle vynálezu. Podstata vynálezu spočívá v tom, že se produkční kmen Bacillus thiaminolyticus Kuno, s výhodou kmen CCM 3599 Československé sbírky mikroorganismů v Brně, pomnoží v půdě obsahující jako stimulátory produkce

- 5 thíaminasy suchý kvasmčný auto ly z at v mn jako zdroj thiaminu a dodatkových živínrm ku v množství Ófl až $ g/1, vedoucí k dalšímu zvýšení výtěžku

239 033

thiaminaay I. Kultivace probíhala za aerobních podmínek 12 až 46 h a tato kultura se použije jako inokulum pro aerobní produkční kultivaci v tekuté půdě obdohnéno složení při 50 až 58 °C po dobu 12 až 72 h. Pak se bakteriální buňky oddělí od fermentační kapaliny, nejlépe odstředěním a čirá kapalina, jež se může použít jako surový preparát thiaminasy I. pro stanovení thiaminu a jeho derivátů, se rozplní do vhodných nádobek a uchovává při -15 až -20 °C. Enzymová aktivita zůstává za těchto podmínek zachována déle než 6 měsíců. Pro Konzervaci tohoto preparátu, aby mohl být uchováván i při teplotách nad 0 °C /až do 50 °C/, lze použít běžné konzervační prostředky například bensoan sodný do konečné koncentrace 0,2 až 0,5 % kyseliny oenzoové v enzymovém preparátu, u něhož ae pak upraví pH pomocí kyseliny chlorovodíkové nebo sírové na 4,0 až 5,0. Stabilita takto konzervovaného preparátu je při teplotě 20 až 50 °C více než 4 týdny. Pro prodloužení stability je možno surový enzymový preparát vysušit lyofilizaeí.

Pro speciální účely je možno surový enzymový preparát přečistit tím, že se enzym z čiré kapaliny isoiuje a přečistí některým z běžných izolačních postupů, například frakeionaČním vyerážením síranem amonným v kombinaci s gelovou filtrací, ionexovou chromatografii a dialyaou.

Výtěžnost thiamiaaey I· za použití kvasničuého autolyzátu a CaCl2 se oproti půdě popisované H.A. Doutnitem a R.L. Airthem /Arch. Biochem. Biophys. 115« 351, 1966/ zvýaí zhruba na trojnásobek, jak je zřejmá ze srovnávacích kvasných pokusů provedených metodikou uvedenou v příkladu 1 za použití různých půd /Tab. 1/.

- 4 239 033

Tabulka 1.

Aktivita thiaminasy I v prokvašeném odstřeaéném médiu použitá půda Aktivita thiamiuasy^+// % aktivity mg rozloženého thiaminu/1 ni enzym· preparátu/10 minut

Syntetická dle H.A.

Douthita, R.L.Airxna 1,4 100 %

Syntetická e přídavkem suchého MVasničného autolyzátu /5g/l/	5,1	226 %
Syntetická e přídavkem
suchého autolyzátu /5g/l/	4,0	293 %
a CaCl2.6H20 /2g/l/

+/ stanoveno dle E.E.Edwina /Methode in isniymology/ /D.B.McCormick, L.D.Wrigirt eda./ 62, 113» 1979/ za použití radioaktivního /^C/ thiaminu /4,48 μβ o celkové aktivitě 332 nCi na 1 μΐ odstředěného prokvašeného media· Reakce probíhala 10 minut při 40 °C a pH 6,4·

Příklad 1

Jednolitrová banka se 150 ml sterilní živné půdy obsahující v jednom litru 18,0 g glycerolu, 3,0 g močoviny, 5,0 g citrátu sodného .2H₂0, 3,0 g suchého kvasníčného autolyzátu, 1,0 g KH₂PO₄, 2,0 g T7a₂HPO₄.12H₂O, 2,0 g CaCl₂.6H₂0, 1,1 g NaCl, 0,7 g MgSO₄.7H₂O, 0,03 g FeSO₄.7H2O a mající pH upraveno na 7,2 ae zaočkuje 1,0 ml 24 hodinové třepané kultury Bacillus thiaminolyticue Euno CCM 3599 vyrostlé při 33 ± 2 °C na půdě stejného složení· Inkubuje se za třepaní 66 h při 33 * 2 °C. Pak se kultura ochladí, bakteriální buňky se oddělí odstředěním, k čirému eupernatantu se přidá tuhý benzoan sodný do konečné koncentrace 0,2 % kyseliny benzoové /véha/objem/ a pH supernatantu ae upraví pomocí HC1 o koncentraci 1 mol/1 na 4,5 až 3,0. Takto získaný surový enzymový preparát se rozplní do vhodných nádobek a uchovává se za chladu, nejlépe při -13 až -20 °C. Aktivita toho- 5 239 033 ►

to preparátu při pH 6,4 a teplotě 40 °C v přítomnosti pyridinu /o konečné koncentraci 14,1 (imol/ml/ je za optimálních podmínek, tj· za nulové koncentrace reakčního produktu, 5 až 4 ukatál/mg proteinu, přičemž 1 ml odstředěného prokvašeného media obsahuje kolem 0,7 mg proteinů. Aktivita tohoto preparátu zůstává zachována při uchovávání při teplutách nižších než -10 °C více než 6 měsíců při teplotách do 50 °C více než 4 týdny, pro stanovení thiamxnu o koncentraci 0,2 až 5,0 gg/g zředěného vzorku pomocí thiochromové metody je nejvhodnější používat 0,2 ml tohoto preparátu do celkového objemu 4,2 ml reakční směsi a dobu inkubace 50 minut při 40 °C za pH 6,4 /pufrovéno citrát-fosfátovým pufrem o koncentraci 0,05 mol/l/·

Příklad 2

Obdobné fermentační půda jako v příkladě 1 s obsahem 1 g/1 kvasničného autolysatu a 4 £ CaC^/l se fermentů je a oddělení buněk se provádí stejné jako u příkladu 1. Ze supernatantu získaného z 10 az 15 kultivačních baně* se izoluje thiaminasa I způsobem popsaným J.L.Wittliffem a R.L. Airthem /Method· in Enzymology /D.B.McCormick, L.D.Wright, eda./ 18 A, 254, 1970/ a konečný roztok enzymu se uchovává při -20 °C nebo se vysuší lyofilizací a, uchovává v chladu. Stabilita roztoku je za těchto podmínek více než 6 měsíců, lvofilizovans preparát je stabilní několik let.

Příklad 5 ml živné půdy o složení uvedeném v příkladu 1 ae zaočkuje kulturou Bacillus thxaminolyticus CCM 5599 ze šikmého agaru a inkubuje se za třepaní 24 h při 55 - 2 °C. Pa* se celý objem převede do laboratorního fermentoru obsahujícího 1 500 ml sterilní půdy složení uvedeného v příkladu 1 a kultivuje se za provzdušňování 24 až 56 h při 54 ±1 °C, načež se celý objem fermentační kapaliny převede do fermentoru obsahujícího 50 litrů živné půdy stejného složení jako v předchozím stupni a kultivuje se 48 h při 54 - 1 °C za intenzivního

- 6 239 033 provzdušňování. Pak se fermentační kapalina zchladí, buňky se odseparují na průtokové odstředivce a čirá kapalina se zpracuje postupem uvedeným v příkladu 1 nebo 2 nebo se vysuší lyofilizací. Aktivita prokvašeného media po odstředění je

3,5 ukatal/mg proteinu, přičemž obsah proteinu v tomto mediu je 0,6 mg proteinu.

Claims (2)

1. Způsob fermentačnl výroby thiaminasy I.-thiamin:baze 2-methyl -4-aminopyrimidin-5-methenyltranaferasy, EG 2.5,1.2·, aerobní kultivací produkčního mikroorganismu Bacillus thiaminolytieue KUno,vyznačující se tlm, Že se kultivace provádí ve fermentačnlm mediu obsahujícím jako stimulátor produkce thiaminasy I· kvaaničný autolysat v množství 0,2 až 50 g/1, načež. se fermentačnl kapalina odstředí a zlsxany eupernatant se konzervuje chemickým prostředkem nebo lyofilisuje.

2· Způsob podle bodu 1, vyznačujíc! se tlm, že se kultivace provádí ve fermentačnlm mediu obsahujícím ionty vápníku v množství 0,0/až 5,0 g/1.