CS237318B2 - Method of evaluating of enzymes and agent to perform the method - Google Patents

Description

Vynález se týká způsobu .a prostředku k imunologickému stanovení enzymů, obzvláště ke kvantitativnímu imunologickému stanovení isoenzymů kyselé nebo alkalické fosfatázy v tělesných tekutinách.

Kvantitativní stanovení isoenzymů v krvi má v posledních letech pro diferenciální diagnózu různých vnitřních onemocnění lidí značný . význam. V krvi pacientů s nádorovým onemocněním se vyskytují například určité isoenzymy alkalické fosfatázy, kyselé fosfatázy, laktátdehydrogenázy nebo galaktosyltransferázy ve velmi zvýšené koncentraci. Jejich kvantitativní stanovení poskytne klinické chemii důležité údaje pro včasné rozpoznání · nádorů, pozorování průběhu a kontrolu výsledku léčby.

Je známo, že kyselá fosfatáza (monoester kyseliny fosforité-fosfohydroláza, EC 3.1.3.2) lidí se vyskytuje ve více isoenzymech. Isoenzym kyselé fosfatázy z prostaty má značně zvýšenou koncentraci v krvi u mnohých pacientů s nádorem prostaty. Důkaz tohoto enzymu má proto velký význam pro ' · rozpoznání časného stadia onemocnění a terapie.

Také pro· alkalickou fosfatázu (monoester kyseliny fosforité-fosfohydroláza, EC 3.1.3.1.) lidí bylo popsáno více biochemicky rozlišitelných isoenzymů. V klinické chemii je důležité kvantitativní stanovení isoenzymů z jater a kostí nebo placenty v krvi. Pro diagnostiku ledvinových onemocnění se zdá znovu zajímavá také identifikace .a kvantitativní stanovení tak zvané cytoplasmatické alkalické fosfatázy tenkého střeva z ledvin v · moci. Placentám! isoenzym alkalické fosfatázy se vyskytuje v krvi těhotných žen. Biochemicko a imunologicko identicky reagující enzym, takzvaný regan-isoenzym alkalické fosfatázy, byl zjištěn ve větších koncentracích v krvi pacientů .s různými nádory a obzvláště často· u nádorů varlat nebo· vaječníků.

Plasma nebo sérum obsahuje většinou směsi isoenzymů uvedených fosfatáz. Jednoduché měření celkové účinnosti · kyselé nebo alkalické fosfatázy neposkytuje proto žádné jasné vysvětlení výskytu .a aktivity specificky hledaných složek isoenzymů v krvi. Často· představují hledané isoenzymy také jen malý podíl celkové aktivity v krvi, takže stanovení jejich .aktivity bez předešlé koncentrace vzorku je velice nepřesné. Při více stanoveních aktivity isoenzymů alkalické fosfatázy nebo prostatického isoenzymů kyselé fosfatázy se použijí pro tato stanovení alikvotní části biologických vzorců, aniž by se dříve enzym od tekutiny vzorku oddělil. Přitom zůstává bez povšimnutí, že vzorky · mohou obsahovat rušivé faktory, například při zkoušce interferující enzymy nebo srážení brzdicí přísady nebo· metabolity léků [Clin. Ohem. 21, 1 D-432 D (19715)].

Původní metody stanovení prostatickéoo' isoenzymů kyselé fosfatázy se používají jako kritéria pro množství chromoforu uvolněné působením enzymu z chromogenního· subs trátu. V novějších metodách se používají specifické . protilátky vůči kyselé fosfatáze ke zjištění a kvantitativnímu důkazu. Tyto imunologické metody, jako elektrotmunodtfúze, protiproudná imunoelektroforéza, radioimunologická zkouška a fluorosenční imunologická zkouška, však mají značné nevýhody. Nepříklad je elektroimunodlfúze dlouhotrvající a nevhodná pro· rutinní stanovení, protiproudná imunoelektroforéza dává pouze semikvantltativní výsledky. Radioimunologická zkouška je časově náročná a nevýhodná pro· použití radioaktivních látek. Obzvláště nevýhodné je provádění ve speciální laboratoři, nebezpečí záření a nepatrná trvanlivost radioaktivně značných reagencí. Fluorescenční imunologická zkouška je technicky poměrně komplikovaná s tendencí k chybám pro nezbytné pipetování partikulárních reagencií; to přináší problémy s· dávkováním. Kromě toho je jen částečně mechanisovatelná a vyžaduje speciální měřicí přístroj.

Stanovení alkalické fosfatázy z placenty v séru těhotných žen a pacientů s nádorovým onemocněním (regan-isoenzym) se dosud provádělo· především měřením aktivity enzymu po tepelné úpravě vzorku nebo za přítomnosti inhibitorů nebo diferenciací isoenzymového rozložení kombinací tepelné předúpravy vzorku a měření za přítomnosti inhibitorů. Tyto metody mají nevýhodu, že nejsou příliš citlivé a dostatečně selektivní. Také výsledky dosažené s· elektroforetickými metodami na různých nosičích nejsou uspokojivé, protože neumožňují žádné kvantitativní výroky,· částečně dávají zkreslené výsledky a nejsou použitelné oro rutinní stanovení. V novějších metodách se používají k poznání a kvantitativnímu důkazu specifické protilátky vůči isoenzymům alkalické fosfotázy. Vysrážení isoenzymů alkalické fosfatázy specifickými · protilátkami ve volné nebo imobilizované formě je necitlivé a poruchové. Při jiných technikách jsou isoenzymy alkalické fosfatázy vázány na kovalentně zesítěné antisérum a měřeny ve vázané formě. Nevýhodami těchto technik je nákladná příprava reagencií, špatná dávkovatelnost a zdlouhavé oddělení odstředěním. Další imunologické metody, jako* jednoduchá radiální imunodifúze, elektroimunodifúze a radioimunologická zkouška, mají stejné nevýhody, jak již bylo popsáno stanovení kyselé · fosfatázy.

Z PCT pat. přihlášky č. WO 79/00475 je známý například způsob imunologického stanovení prostatického isoenzymů kyselé fosfatázy na základě fluorescenční imunologické zkoušky s pevnými fázemi. Přitom se nejprve vážou specifické protilátky vůči tomuto isoenzymů · kovalentně na sefarozový gel aktivovaný kyanhalogenídem. Potom se musí zbylé aktivní skupiny blokovat na sefarozovém gelu a přebytečné blokovací reagens · se musí odstranit, přičemž jsou nezbytné další promývací stupně. Stanovení prostatického isoenzymu kyselé fosfatázy vázaného na protilátku se potom provádí fluorescenčním měřením produktu, který vznikne při štěpení substrátu.

Také tento způsob má, nehledě na již popsané nevýhody v souvislosti s vyhodnocováním fluorescenčních měření, značnou nevýhodu, že protilátky se musí nejprve kovalentně vázat nákladným způsobem na nosič. Použitím nosiče v částicové formě vzniká kromě toho problém špatné dávkovatelnosti částicové suspenze a odstředění při provádění stanovení.

Jsou také známé způsoby, při kterých se může imunologická složka vázat nejen kovalentně, nýbrž také adsorpčně na ve vodě nerozpustný nosič (DOS čís. 2 901 391, US čís. 4 016 043). V těchto případech však vzniká složka z kovalentního kopulačního produktu antigenu nebo protilátky a enzymu, takže také v těchto případech se musí nejprve vytvořit kovalentní vazba.

Úkolem vynálezu je zajistit způsob a prostředek ke kvantitativnímu stanovení enzymů, při kterém aby se mohly odstranit uvedené nevýhody a získat analytické výsledky při alespoň stejné citlivosti ve značně kratším čase.

Předmětem vynálezu je způsob kvantitativního imunologického stanovení enzymů v tělesných tekutinách, který se provádí tak, že se protilátky vůči stanovovanému enzymu adsorbované na ve vodě nerozpustném nosiči inkubují zkoušeným roztokem obsahujícím tento enzym, přičemž enzym zachovává v komplexu s protilátkami reprodukovatelný podíl své aktivity, zkoušený roztok se odstraní, nosič s adsorbovanými protilátkami a enzymem se promyje a stanoví se aktivita enzymu vázaného na protilátky.

Předmětem vynálezu je obzvláště způsob kvantitativního stanovení isoenzymů kyselé fosfatázy, především prostatického isoenzymu kyselé a alkalické fosfatázy v tělesných tekutinách, který se provádí tak, že se protilátky vůči stanovovanému isoenzymu fosfatázy adsorbované na ve vodě nerozpustném nosiči inkubují zkoušeným roztokem obsahujícím tento enzym, přičemž isoenzym zachovává v komplexu s protilátkami reprodukovatelný podíl své aktivity, zkoušený roztok se odstraní, nosič s adsorbovanými protilátkami a isoenzymem se promyje a stanoví se aktivita enzymu vázaného na protilátky.

Dále se vynález týká prostředku к provádění tohoto způsobu, který se vyznačuje tím, že obsahuje ve vodě nerozpustný nosič, na který jsou adsorpčně vázány protilátky. Jako ve vodě nerozpustný nosič se použijí s výhodou nádobky z plastické hmoty, obzvláště testovací rourky z polystyrenu nebo polypropylenu.

Předpokladem pro způsob podle vynálezu je výroba antisér, které mohou specificky vázat enzymy nebo isoenzymy. Tato vazba musí být dostatečně stabilní a skutečně měřená enzymatická aktivita vázaných složek nesmí být, nebo jen v reprodukovatelné míře, brzděna. Antiséra nebo čištěné imunoglobuliny z těchto antisér ve vhodných pufrových roztocích se vážou adsorpčně na povrch ve vodě nerozpustných nosičů, jako nádobek z polystyrenu, polyproplenu apod. Nevázané protilátky se odstraní z antiséra nebo roztoku imunoglobulinu promytím nádobky. К důkazu enzymu nebo isoenzymu se biologický vzorek inkubuje určitou dobu v nádobkách s vrstvou protilátky. Přitom je podíl stanoveného enzymu nebo isoenzymu, který je úměrný koncentraci vzorku, vázaný na vrstvu protilátky. Použitím protilátek, které jsou pevně vázány, se docílí koncentrování molekul enzymu ve vrstvě protilátek. To má obzvlášní výhodu například při použití větších objemů vzorků s nízkou koncentrací stanoveného enzymu nebo isoenzymu.

Zbylá tekutina vzorku se potom odstraní a nádobka se několikrát promyje obvyklým proplachovacím roztokem pufrového roztoku obsahujícího detergent. Tímto postupem se odstraní rušící faktory pro enzymový test, které jsou případně přítomny ve vzorku (soli, láky, rušící enzymy). К důkazu vázaných enzymových molekul se dají do nádobky určité objemy roztoků se zkušebními reagenciemi pro enzymový test (obsahující substrát, pufr atd.) Extinkce vznikajícího reakčního produktu enzymatické reakce se buď přímo registruje ve fotometru (kinetický enzymový test) nebo se měří po určité reakční době (dvoudobové stanovení). Aby se získaly ve vzorku absolutní hodnoty pro aktivitu stanovovaného enzymu nebo isoenzymu, sestrojí se kalibrační křivka se vzorky kontrolního roztoku, jejichž enzymatická aktivita je předem dána. Tyto vzorky se zpracují stejným způsobem jako analyzované vzorky. Potom se získá referenční křivka, která umožňuje stanovení enzymatické aktivity ve vzorku.

Způsob podle vynálezu je neočekávaně jednoduchý, specifický a citlivý. Spojuje výhody koncentračního účinku a eliminace rušících faktorů, protože enzymatická aktivita se stanoví teprve po odstranění zkoušeného roztoku. V porovnání s jinými imunologickými metodami se provádí přímé měření, tj. odpadne reakční stupeň se značenými protilátkami. Tím také odpadne nutnost připravit kopulační produkt, se všemi s tím spojenými nevýhodami. Jako další důležitý faktor je nutno vyzdvihnout rychlost, se kterou se může provádět způsob podle vynálezu. J

Příklad 1

Stanovení placentárního isoenzymu alkalické fasfatázy

a) Příprava antiséra specifického pro isoenzym

Alkalická fosfatáza z lidské placenty se čistí až se enzym zbaví dalších isoenzymů alkalické fosfatázy a nejsou již dokazatelné další proteiny při elektroforéze na polyakrylamidovém gelu. Isoenzym se dialyzuje 0,15 M roztokem kuchyňské soli, odstředěním se zbaví agregátů a sterilně se filtruje. Proteinový obsah roztoku se nastaví 0,15 M roztokem kuchyňské soli na 2 mg/ml; 1 ml tohoto roztoku se emulguje 1 ml kompletního Freundova adjuvans. Tato emulze se podá ovcím nebo kozám jako intramuskulární injekce na 3 až 4 místech do zadních běhů. Stejné injekce se podají ještě dvakrát v odstupu třech týdnů; 21 dní po poslední injekci se odebere krev. Další injekce následují v odstupu asi 12 týdnů po posledním odběru krve. Krev se odebírá tři týdny po boosterové injekci. Z krve se získá známým hematologickým způsobem sérum.

b) Izolace imunoglobulinové frakce z antiséra

Imunoglobulinová frakce G se izoluje z antiséra kombinací vysrážení síranem amonným, díalýzy 0,071 M acetátovým pufrem pH 5 a ionexové chromatografie na DEAE-Sephadexu při pH 5 podle způsobu popsaného v Scand. J. Immunol. 2, Suppl. 1. 161—164 (1973).

c) Potažení reakčních nádobek vrstvou protilátek

Jako reakční nádobky se použijí pro potažení vrstvou protilátek reagenční rourky z polystyrenu 12 X 55 mm. Do reagenčních rourek se dá 1 ml roztoku imunoglobulinové frakce G o koncentraci 10 ^ug/ml v 0,15 M roztoku kuchyňské soli s 0,02% azidem sodným a uzavřené nádobky se inkubují 18 hodin při 4 °C. Potom se tekutina odstraní dekantací nebo odsátím; nádobky se několikrát promyjí proplachováním roztokem (0,05 % detergens v 0,15 M roztoku kuchyňské soli s 0,02% azidem sodným) a suší se na vzduchu.

d) Stanovení placentárnfho isoenzymů v biologických vzorcích

Jako biologický vzorek se použije sérum zdravého člověka inaktivované teplem, ke kterému se přimíchá isoenzym alkalické fosfatázy z placenty o známé enzymatické aktVtě Pro pokus к opětnému získání placentami alkalické fosfatázy se použijí směsi obchodně dostupného séra s placentární alkalickou fosfatázou jako jedinou aktivitou alkalické fosfatázy a lidského séra inaktivovaného teplem. Do nádobek s vrstvou protilátek se odpipetují vzorky s 0,1 ml séra obsahujícího alkalickou fosfatázu z placenty. Rourky se doplní na 0,5 ml 10 mM tris/HCl - pufrem o pH 7,5, který obsahuje navíc 2 mM chlorid rořečnatý a 0,025 mM chlorid zinečnatý. Nádobky se uzavřou a inkubují se za intenzivního míchání 1 hodinu při 37 °C a cca 16 hodin při 4 °C. Potom se nádobky třikrát promyjí tris/HCl - pufrem (10 mM, pH 7,5 s 2 mM chloridem hořečnatým a 0,025 mM chloridem zinečnatým) a krátce se suší na vzduchu. Potom se přidá pro stanovení aktivity alkalické fosfatázy na nádobku 1,0 mililitru pufrového substrátového roztoku a 10 minut se inkubuje při teplotě místnosti. Ihned poté se měří extinkce vzorku v kývete ve fotometru při 405 nm. Jako slepý vzorek se použije stejně upravený pufrový substrátový roztok. Vyhodnocení se provádí na základě kalibrační křivky, přičemž mezi použitou známou aktivitou placentární alkalické fosfatázy ve vzorku (U/l) a měřenou změnou extinkce na časovou jednotku (10 minut) je přísná korelace/korelační koeficient r = 0,998). Z vázané aktivity bylo vypočteno, že bylo znovu nalezeno na nádobkách asi 70 až 80 % aktivity placentární alkalické fosfatázy ve vázané formě.

Jako pufrový substrátový roztok se použilo roztoku, který měl v testu následující koncentraci: 10 mM p-nitrofenylfosfátu, 0,5 mM chlorid horečnatý, 1,0 mM diethanolamin-HC1 pufr (pH 9,8);

e) Kinetické stanovení vázaného placentárního isoenzymů alkalické fosfatázy

Použijí se vzorky lidského séra s cca 80 U/l aktivity placentární alkalické fosfatázy. Vzorky se inkubují ve čtyřrohých kyvetách z polystyrenu potažených vrstvou protilátek.

Tyto nádobky se inkubují a potom promyjí, jak popsáno pod 1 d. К důkazu vázané alkalické fosfatázy z placenty se dá do těchto nádobek pufrový substrátový roztok a zaznamenává se změna extinkce vznikajícím produktem v nádobách přímo ve fotometru se zapisovacím přístrojem. Reakce probíhá lineárně cca 2 minuty.

f) Stanovení placentárního isoenzymů alkalické fosfatázy ve vzorcích s přidaným inhibitorem enzymu

0,05 ml lidského séra s aktivitou placentární alkalické fosfatázy cca 140 U/l se smíchá s 0,5 ml 10 mM tris/HCl-pufru o pH 7,5, který obsahuje následující přísady: 2 mM chlorid hořečnatý a 0,025 mM chlorid zinečnatý (A), pufr jako v (A) s 5 mM L-Phe-Gly-Gly (В), pufr jako v (A) s 5 mM L-Leu-Gly-Gly (C), pufr jako v (A) s 5 mM L-fenylalaninem (D). Aktivita těchto vzorků se stanoví analogicky jako v příkladu 1 d. Ze všech vzorků se získaly hodnoty pro placentární alkalickou fosfatázu vázanou na protilátky (měřeno jako Δ optické hustoty (10 min), které byly totožné se srovnávací hodnotou z (A) v mezích přípustnosti chyb metody. Přítomnost inhibitorů pro placentární alkalickou fosfatázu ve vzorku nerušila přesné stanovení s nádobkami potaženými vrstvou protilátek.

Příklad 2

Stanovení isoenzymu alkalické fosfatázy z jater nebo kostí

Isoenzym so izoluje z lidských jater a čistí, až je protein zbaven dalších isoenzymů alkalické fosfatázy. Imunisace se provádí podle příkladu 1 a. Antisérum se absorbuje v lidském séru zesítěném glutaraldehydem. Izolace imunoglobulinových frakcí z absorbovaného antiséra se provádí podle příkladu lb a potažení reakčních nádobek protilátkami analogicky podle příkladu 1 c. Ke stanovení aktivity alkalické fosfatázy z jater nebo kostí se použije jako vzorek lidské sérum inaktivované teplem s přídavkem alkalické fosfatázy z lidských jater. Celková aktivita alkalické fosfatázy (totožná s aktivitou alkalické fosfatázy z jater nebo kostí) ve vzorku se zjistí před stanovením.

Do reakčních nádobek, které jsou potaženy vrstvou protilátek vůči alkalické fosfatáze z jater nebo kostí, se odpipetuje 0,1 ml vzorku a 0,4 ml 10 mM tris/HCl-pufru o pH 7,5 s mM chloridem hořečnatým a 0,025 mM chloridem zinečnatým. Další postup ' je stejný jako v příkladu 1 d. Vyhodnocení se provádí na základě kalibrační křivky, přičemž mezi nasazenou známou aktivitou alkalické fosfatázy z jater nebo kostí ve vzorku séra (U/l) a měřenou změnou extink.ce (10 min) je přísná korelace (korelační koeficient r = = 0,997).

Příklad 3

Stanovení alkalické fosfatázy tenkého střeva v séru, plasmě nebo moči

Isoenzym alkalické fosfatázy tenkého střeva se izoluje z lidského tenkého střeva a čistí se, až je protein zbaven dalších isoenzymů alkalické fosfatázy. Imunizace se provádí analogicky podle příkladu 1 a. Antisérum so absorbuje v lidském séru zasítěným glutaraldehydem. Z antiséra se po absorpci čistí G-frakce imunoglobulinu (Meth. Enzymol. XXXIV, str. 725, Academie Press, New York 1974). K potažení vrstvou protilátek se polystyrénové rourky (obsah 1 ml) inkubují 20 hodin roztokem imunoglobulinu G (lO^g/ml) ve 30 mM barbitalového pufru o pH 8,6, dvakrát se promyje 1 ml fyziologického roztoku s fosfátovým roztokem kuchyňské soli a uchová se při 4 °C. Jako vzorek se použije 0,1 ml séra nebo plasmy, až 1 ml moč'. Rourky se potom doplní na 1 ml 10 mM trís/HCl-pufrem o pH 7,5 M chloridem sodným, 2 mM chloridem hořečnatým, 0,025 mM chloridem zinečnatým, 0,2% hovězím albuminem a 3% polyethylenglykolem 6000 a potom se inkubuje 24 hodiny při 4 . °C. Přebytek se odsaje a každá rourka se 3X promyje roztokem kuchyňské soli, který obsahuje ještě 3% polyethylenglykol 6000. Promyté rourky se naplní 0,95 ml testovacího roztoku pro alkalickou fosfatázu (1M diethanolamin) HCl-pufr pH 9,8 s 10 mM p-nitrofenylfosfátem a 0,5 mM chloridem hořečnatým). Re-akce se zastaví po 60 minutách přídavkem 50 ,ul roztoku 5 N louhu sodného a 10 mM dvojsodné soli ethylendinitrilotetraoctové kyseliny. Jako kalibrační antigen se požije alkalická fosfatáza izolovaná z lidského tenkého střeva. Vyhodnocení se provádí analogicky podle příkladu 1 d. Přitom plyne pro alkalickou fosfatázu z tenkého střeva spodní hranice důkazu 0,05 U/l (odpovídající 25 ng/I) při objemu vzorku 1 ml nebo 0,5 U/l (odpovídající 250 ng/1) při objemu vzorku 0,1 ml.

Příklad 4

Stanovení prostatického isoenzymu lidské kyselé fosfatázy

Isoenzym kyselé fosfatázy se extrahuje z lidské tkáně prostaty a předem čistí pomocí f raketo váného vy srážení síranem amonným. Následující izolace čistého· proteinu se provádí podle Prep. Blochem. 8, 73—89 (1978), Specifická aktivita čistého enzymu byla cca 385 U/mg proteinu. K získání protilátek se imunizoval králík; 1 mg čistého proteinu v 1 ml roztoku se emulgovalo 1 ml kompletního Freundova adjuvans a zvířeti se píchla subkutánní injekce do hřbetu. Druhá injekce následovala o 14 dní později. Po 4 týdnech so podalo poloviční množství emulze jako intramuskulární injekce. Po 7 až 10 dnech se odebrala z ušní tepny krev. Z antiséra se izolovala pomocí adsorpční chromatografie podle FEBS Letters 28, 31 (1972) frakce G imunoglobulinu.

K potažení vrstvou protilátek se polystyrénové rourky (obsah 1 ml) inkubují 20 hodin roztokem frakce G imunoglobulinu z anťséra (5 μξ imunoglobulinu G/ml ve 30 mM barbitalovém pufru pH 8.6), dvakrát se promyje 1 ml roztoku kuchyňské soli s fosfátovým pufrem, plní se roztokem kuchyňské soli a uchovává při 4 °C. Pno test se lidské sérum nebo plasma (max. 1 ml) inkubuje 24 hodiny · v rourkách při 4 °C, přebytek se odsaje a každá rourka se třikrát promyje fyziologickým roztokem kuchyňské soli s fosfátovým pufrem, který obsahuje 3% polyethylenglykol 6000 a 0,1 % detergens. Pro důkaz vázaného enzymu se plní do promytých rourek 0,95 ml testovacího roztoku pro kyselou fosfatázu (50 mM citranový pufr pH 4,8 s 5,5 mM p-nitrofenylfosfátem). Po 60 minutách se enzymová reakce zastaví přídavkem 50 μΐ 3 N louhu sodného a přírůstek extinkce se stanoví při 405 nm oproti slepé zkoušce. Slepá skouška byla provedena pomocí stejně upravené rourky, která se 24 hodiny inkubovala s fyziologickým roztokem kuchyňské soli a 3% polyethylengiykolem 600 místo séra při 4 °C.

Byla sestrojena kalibrační křivka, při kte237318 ré aktivita použité kyselé fosfatázy korelovala se zbytkovou aktivitou měřenou v rource. Kalibrační křivka byla stanovena přídavkem uvedené aktivity prostatického isoenzymu kyselé fosfatázy ke směsi ženských sér. Slepá aktivita séra byla odečtena od měřených hodnot. Hranice důkazu byla 0,05 U/l (odpovídající 120 ng/1); citlivost se tím více jak dvojnásobně zlepšila oproti radioimunologické zkoušce (250 ng/1).

Příklad 5

Stanovení laktátdehydrogenázy z lidského kosterního¹ svalu

Laktátdehydrogenáza typu kosterního svalu se izoluje ze vzorků kosterního svalstva, které byly získány podle' vlastního uvážení. Čištění enzymu z orgánového extraktu se provádí frakcionovaným srážením síranem amonným a následující iontoměničovou chromatografii na DEAF-Sephadexu v 0,03 M Tris/HCl-pufru při 7,5. V průtoku se nalezne isoenzym laktátdehydrogenázy typický pro' kosterní sval, tj. LDH-M4 (složený ze čtyř identických proteinových jednotek typu M] a tak se oddělí od dalších isoenzymů laktátdehydrogenázy, jako· například LDH-HM3 a LDH-H2M2, které zůstanou vázány na iontoměniči. Enzym ve frakcích průtoku se koncentruje · srážením síranem amonným, rozpustí se v pufru, dialyzuje se a dvakrát se chromatografuje na iontoměničovém sloupci, jak popsáno· výše. Laktátdehydrogenáza v průtoku je LDH-M4, která je bez dalších LDHňsoenzymů. Enzym má specifickou aktivitu cca 700 U/mg.

Antiséra proti LDH-M4 byla vyrobena z králíků, použito imunisační schéma podle příkladu 4. Z antisér se izoluje IgG-frakce podle způsobu popsaného· v Scand. J. Immunol. 2, dodatek 1, 161—164 (1973 J. Pro· přípravu umělých nádobek potažených protilátkami se· polystyrénové rourky (10,5 mm x x 40 mm) inkubují 18 hodin při 4 °C 1 ml roztoku který obsahoval 50 pg IgG v 0,15 M roztoku chloridu sodného, a 0,02 azidu sodného. Potom se roztok odstraní odsátím a potažené rourky se propláchnou několikrát promývacím roztokem (0,15 M roztok chloridu sodného s 0,05 % detergentu a 0,02 · % azidu sodného) a nakonec se suší na vzduchu. Ke stanovení LDH-M4 se rozpustí čištěný isoenzym-M4--aktátdehydrogenázy o různých koncentracích v PBS/ /BSA, tj. 0,01 M fosforečnanu sodném jako pufru při pH 7,2 s 10 mg albuminu hovězího séra na ml. Použijí se roztoky s objemovou aktivitou v rozmezí 3 až 300 U/l (odpovídá cca 4,3 až 430 pg LDH-proteinu na 1). V kontrolních vzorcích se použije výše zmíněné ředicí prostředí bez přídavku LDH. Při testu se inkubuje vždy 1 ml roztoku 24 hodiny při 4 °C v rourkách potažených protilátkami a potom se odstraní odsátím. Rourky se potom propláchnou tři krát 1 ml PBS/BSA a konečně se úplně odsají. Ke kvantitativnímu důkazu vázané enzymatické aktivity se přidá 1 ml 0,067 M fosforečnanu sodného jako pufru při pH 7,2 v-ytemperovaného na 25 °C, který obsahoval 1,3 mM pyruvát sodný a 0,4· mM NADH.

Po 60 minutové inkubaci při 25 °C se zajistí absorpce roztoku při 334 nm oproti vodě v seminikrokyvetě · z křemene ve spektrálním fotometru.

Pro vyhodnocení se odečte adsorpce výše popsaného slepého pokusu od analytických hodnot a vypočítaná absorpce se nanese graficky proti známé objemové aktivitě (udáno· v U/l). V rozmezí 4,3 až cca 60 pg LDH-M4/1 byla nalezena lineární souvislost mezi objemovou aktivitou a absorpcí.

Rourky potažené protilátkami se inkubují v paralelních sadách s extrakty z různých lidských orgánů. Tyto extrakty se nastaví zředěním PBS jednotně na aktivitu 30 U laktátde'hydlrogenázy/1. Důkaz vázané laktátdehydrogenázy se provádí následujícím způsobem. Větší množství vázané aktivity bylo nalezeno· pomocí extraktu z jater nebo kosterního svalu, střední aktivita byla pozorována pomocí extraktu z ledvin nebo mozku, zatímco extrakt ze srdečního svalu ukazoval pouze nižší hodnotu vázané aktivity. Tyto výsledky odpovídají· předpokladu podle rozdělení LHD-M4 nebo jiných LDH--soenzymů s obsahem proteinové podjednotky M v uvedených orgánech, které je odborníkovi známé.

Příklad 6

Stanovení galaktosyltransferázy · asociující s nádorem (isoenzym II galaktosyltransferázy)

Gala.ktosyltransferáza II se získá z břišní tekutiny pacientů s gynekologickým nádorem. Tato tekutina se shromáždí od různých pacientů. Čistění galaktosyltransferázy II se provádí · podle způsobu popsaného v J. Biol. Chem. 254, 3983—3990 (1979). Galaktosyltransferáza se koncentruje z břišní tekutiny frakcionovaným srážením síranem amonným a chromatografií na norleucinu-agaróze. Isoenzymy I a II galaktosyltransferázy se oddělí potom se chromatograficky na DEAE-celulóze v 0,005 M fosforečnanu sodném jako pufru při pH 7,2. Galaktosyltransferáza I se objeví v průtoku, zatímco· galaktosyltransferáza II je vázána a eluuje se gradientem 0,005 M až 0,1 M fosforečnanu sodného' jako pufru při pH 7,2.

Zpětná chromatografie takto získaného preparátu galaktosyltransferázy II v druhém chromatografickém procesu na DEAE-celulóze v 0,005 M fosforečnanu sodném při pH 7,2 ukázala, že enzym je bez galaktosyllransferázy I. Imunoelektroforetická analýza za použití polyvalentního antiséra proti proteinu lidského séra ukázala, že preparát galaktosyltransferázy II obsahuje ještě stopy proteinů ze séra. Preparát je proto bez dalších isoenzymů galaktosyltransferázy, avšak ne zcela vyčištěný na homogenní, jednotlivý protein.

Antiséra proti galaktosyltransferázy II byla vyrobena z králíků: 1 mg enzymového preparátu v 1 ml roztoku se emulguje 1 ml Freundova adjuvans a zvířatům se podávají dvakrát v odstupu 14 dní injekce i. m. Třetí injekce se podá subkutánně po 28 dnech. Za 7 dní obdrží zvířata 200 ^g enzymového preparátu v roztoku do ušní žíly. Za týden se odebere z ušní žíly krev a z té se získá sérum. Z antiséra se izoluje Ig G-frakce podle způsobu popsaného v Scand. J. Immunol., 2, Dodatek 1, 161—164 (1973).

Příprava umělých nádobek potažených protilátkami se provádí podle způsobu popsaného v příkladu 5.

Ke stanovení galaktosyltransferázy II se rozpustí čištěný enzymový preparát v 0,02 M kakodylátu sodném jako pufru s pH 7,4 s 0,15 M chloridem sodným a 10 mg albuminu hovězího séra na ml. Použijí se roztoky s koncentrací galaktosyltransferázy cca 60 až 600 ^g proteinu na 1. V kontrolních vzorcích se použije pufr bez galaktosyltransferázy. Při testu se inkubuje vždy 0,3 ml roztoku 24 hodiny při 4 °C v rourkách potažených protilátkami a potom se odstraní odsátím. Rourky se potom třikrát propláchnou pufrem-0,02 M kakodylátem sodným při pH 7,4 s

0,15 M chloridem sodným, který ještě obsahoval 0,05 °/o detergentu, a nakonec se úplně odsají.

Aktivita vázané galaktosyltransferázy se stanoví inkubací substrátovou směsí po 60 minut při teplotě 37 °C. Substrátová směs obsahovala v 0,3 ml pufru-0,1 M kakodylátu sodného při pH 7,4 s 0,15 M chloridem sodným následující činidla: 0,02 M chlorid manganu, 0,001 M UDP-C14-galaktózu a cca 1 mg asialoagalaktofetuinu, který byl připraven podle způsobu v J. Clin. Invest. 51, 2024—, —2032 (1972). Ke stanovení C14-galaktózy v akceptoru asialoagalaktofetuinu se odebere 0,2 ml inkubační směsi a přidá se v ledové lázni 0,2 ml 3 M kyseliny trichloroctové. Vznikne sraženina, která se oddělí odstředěním. Ve sraženině se stanoví radioaktivita. К tomu účelu se sraženina rozpustí v 0,3 ml 1M NaOH, emulguje se scintilačním prostředkem a měří se kapalným scintiločním počítačem. Vázaná radioaktivita roste s koncentrací galaktosyltransferázy v rourkách potažených protilátkami.

Ke stanovení galaktosyltransferázy II v séru se dá do rourek potažených protilátkami 0,3 ml vzorku séra místo enzymového roztoku a dále se pracuje jak uvedeno výše.

V séru zdravých osob nebyla nalezena žádná enzymatická aktivita. Séra pacientů s různými nádory měla až cca 30% dokazatelné aktivity galaktosyltransferázy II.

Claims (6)

1. Způsob kvantitativního imunologického stanovení enzymů v tělesných tekutinách s využitím adsorpční vazby imunologické složky na nosič nerozpustný ve vodě, vyznačený tím, že se protilátky vůči stanovovanému enzymu adsorbované na nosiči neropustném ve vodě inkubují zkoušeným roztokem obsahujícím tento enzym, přičemž u enzymu v komplexu s protilátkami je zachována reprodukovatelná část jeho aktivity, zkoušený roztok se odstraní, nosič s protilátkami a enzymem se promyje a stanoví se aktivita enzymu vázaného na protilátky.

2. Způsob podle bodu 1 pro stanovení isoenzymů kyselé nebo alkalické fosfatázy v tělesných tekutinách, vyznačený tím, že se protilátky vůči stanovovanému isoenzymu kyselé nebo alkalické fosfatázy adsorbované na nosiči nerozpustném ve vodě inkubují zkoušeným roztokem obsahujícím tento isoenzym, přičemž u isoenzymu v komplexu s protilátkami je zachována reprodukovatelná část jeho aktivity, zkoušený roztok se odstraní, nosič s protilátkami a isoenzymem se promyje a stanoví se aktivita isoenzymu vázaného na protilátky.

3. Způsob podle bodu 1, pro stanovení prostatického isoenzymu kyselé fosfatázy v tělesných tekut nach, vyznačený tím, že se protilátky vůči stanovovanému prostatickému isoenzymu kyselé fosfatázy adsorbované na nosiči nerozpustném ve vodě inkubují zkoušeným roztokem obsahujícím tento isoenzym, přičemž u enzymu v komplexu s protilátkami je zachována reprodukovatelná část jeho aktivity, zkoušený roztok se odstraní, nosič s protilátkami a isoenzymem se promyje a stanoví se aktivita isoenzymu vázaného na protilátky.

4. Prostředek к provádění způsobu podle bodů 1 až 3, vyznačený tím, že obsahuje nosič nerozpustný ve vodě, na který jsou adsorpčně vázané protilátky vůči stanovovanému enzymu.

5. Prostředek podle bodu 4, vyznačený tím, že nosič nerozpustný ve vodě je nádobka z plastické hmoty.

6. Prostředek podle bodů 4 a 5, vyznačený tím, že nosič nerozpustný ve vodě je testovací rourka z polystyrenu nebo polypropylenu.