CS235785B1 - Způsob výroby specifického mikrobního preparátu proti larvám komárů a muchniček - Google Patents

Abstract

Způsob výroby specifického mikrobního preparátu proti larvám komárů a mu- I ■ chniček z krystaloforního bacila Baoillus thuringiensis serovar H-14 (israelensis) submersní metodou za stálého míchání a vzdušnění při teplotě 29 - 32 °C zaočkováním do sterilní tekuté půdy Obsahující asimilovatelná sacharidy a asimilovatelný organický zdroj dusíku, vyznačený tím. že asimllovatelných sacharidů a asimilovatelného zdroje dusíku s obsahem růstových faktorů a vitaminů se použije v poměru 1 : 1 až 3 s 1 za přidání oligobiogenních prvků při výchozím pH do 7,5, přičemž ukončení fermentace je při uvolnění spor a krystalů a tyto ae z fermentační půdy isolují při teplotách do 80 °C za přídavku smáčedla a ochranné látky

Description

Předmětný vynález se vztahuje na výrobu nového bakteříjního preparátu jako vysoce selektivního biologického přípravku na hubení larev komárů a muchniček sajících krev·

Boj e komáry a muchničkami jako trapiči a přenašeči nákaz je veden ničením jejich larev v přírodních vodách· Dosud k tomu byly používány výhradně chemické insekticidy (chlorované uhlovodíky, karbaaáty, organofosfáty)· Postupně se vytvářela resistence komárů k těmto látkám a byly nahrazovány novými látkami často a vysokou toxicitou pro člověka a živočichy· Vyvolávaly u nich dlouhodobé onemocnění a ireparabilní poškození· Při širokých terárních aplikacích působily tyto přípravky na lovnou zvěř a živočichy ve volné přírodě a způsobily kritické snížení jejich počtu· Rezidua těchto látek se s rostlinami dostávala do potravy zvířat a vyvolávala nekontrolovatelné přemístění toxických látek i mimo místo aplikace· Přechodem do tekoucích a spodních vod se dostávaly zbytky chemických insekticidů do zásob pitné a užitkové vody a narušovaly zdraví i životní prostředí obyvatelstva.

Týto závažné důsledky použití chemických látek proti komárům a hlavně jejich selhání při epidemásh malárie, vedly k hledání přírodních účinných náhrad, které by při vysoké selektivitě nebyly prostředí cizí, nevytvářely rezidua a nepoškozovaly jiné organismy·

V průběhu hledání byly izolovány nové kmeny bakterie Bacillus thuringiensis serovar.H·-7 (aizawai), serovar H»13 (pakistani) a serovar EWL4 (isřaelensis),

235 785 které jsou vysoce selektivně účinné ňa larvy komárů a muchniček, přenašečů nákaz a neškodné pro ostatní organismy v témže prostředí: rostliny, zvířata a člověka· Netvoři v prostředí rezidua, protože jsou součástí potravy dalších organismů a jimi jsou odstraňovány v krátké době z vodního prostředí i z půdy* Ani souvislá velkoplošné ošetření nepoškozuje ostatní organismy·

Způsob podle vynálezu umožňuje provozní výrobu specifického bakterijního preparátu proti larvám komárů a muchniček z krystaloforního bacila Bacillus thuringiensis serovar.H-14 (israelensis), H-13 (pakistani), H-7 (aizawai) ekonomickým způsobem ve velkém měřítku za použití moderního zařízení a v krátkém čase 32 - 70 hod·

Vynález se týká způsobů výroby insektioidního bakterijního preparátu proti komárům z krystalotvorného bacila druhu Bacillus thuringiensis serovar· israelensis, pakistani a aizawai submersní metodou za stálého míchání a vzdušnění při teplotě 29 až 32*C zaočkováním do sterilní tekuté půdy obsahující ašimilovátelné sacharidy a asimilovatelný organický zdroj dusíku, vyznačený tím, že asimilovatelných sacharidů a asimilovatelného zdroje dusíku se použije v poměru 1:1 až 3:1, s obsahem růstových faktorů a vitaminů při výchozím pH do 7»5 > přičemž ukončení fermentaoe je podmíněno uvolněním insekticidní složky, která se dále z fermentační tekutiny izoluje a suší za přídavku smáčedla a ochranné látky·

Bacillus thuringiensis serovar H-14 (israelensis), serovar.H-7 (aizawai) nebo H-13 (pakistani), se kultivuje aerobně v submersních podmínkách ve sterilním tekutém mediu za stálého vzdušnění a míchání. Kultivační doba je 32 ež 7® hod·, optimální teplota 30 - 2*C, výchozí pH se může pohybovat mezi 6,5 a 7>5 a optimem při 7>0 až 7,2·

Během fermentace se pH udržuje v tomto rozmezí pomocí přísady pufru, např. KgHPO^ nebo CaCO^ nebo NaHCO^·

Může být použito různých tekutých medií obsahujících aaimilovatelný uhlík a dusík. Zdrojem uhlíku mohou být ašimilovátelné mono-j di- nebo polysacharidy nap? o glukosa

235 785 maltosa, g^yseíol, škrob. Asimilevatelným zdrojem dusíku je bílkovinný materiál, nejlépe obsahující současně vitamíny a růstové faktory, např. kvasničný autolyzót, kvasničný » extrakt, sušené kvasnice, pepton, sojová mouka, pšeničné mouka, kukuřičné mouka, mouka z odtučněných bavlníkových * klíčků, kaseinový hydrolyzát, kukuřičný extrakt, výpalky po výrobě alkoholických nápojů apod. Je výhodné přidat do kultivačního media ČLigobiogenní prvky jako hořčík, mangan, železo, zinek, vápník a sodík ve formě solí.

Po ukončení vývoje a 90-95 % vysporúlování kultury bacilu, kdy se současně uvolni insekticidní krystaly, se účinná biomasa spor a inkluzí z fermentační tekutiny izoluje a suší. Před izolací se vmíchá do fermentační tekutiny s biomasou laktosa nebo chlorid sodný (5 až 30$) a smáčedlo, např· Triton X 100, Tween 20,

Chevron, Slova sol ap. (5 až 10 $) · Izolace sporového materiálu se provede odstředěním nebo filtrací nebo kombinací obou· Fermentační tekutinu s biomasou je možno zahustit na filmové odparce nebo odstředivkou typu Laval· Sušení je možno provést několika způsoby: proudem teplého vzduchu, lyofilizací, ve vakuové sušárně, ve sprayové sušičce, precipitací acetonem a následujícím vysušením· Materiál spor a krystalů ve formě suchého prášku si zachovává své insekticidní vlastnosti po řadu let, js-li uskladněn v suchu a chladu·

Aktivita přípravku se určuje biologickým testem na larvách komárů Culax pipiens tutogenicus nebo Aedes aegypti a srovnáním s mezinárodním standardem IPS (hodnota 1000 Mezinárodních jednotek)· Aktivita se vyjadřuje v Mezinárodních biologických jednotkách. Biologický test ’ se hodnotí po 48 hod·

Příklad 1.

Živné půda na třepačce, v předočkovacím tanku a farmě nt a čním tanku má složení: 1,3 % sojové mouky, 1,4 $ kukuřičného škrobu, 0,03 % 0,002$ FeSO^THgO,

0,002 $ ZnS0₄»7H₂0,0,002 $ C^Cl^ a 0,1 $ NaHCOy Banky

233 785 na třepačku na 500 ml se plní 50 ml půdy a zaočkují se 20 hod· kulturou produkčního kmene vyrostlého na šikmém agaru o složení: agar 2,0 $, škrob 2 %, pepton 0,75 $, kvasničný autolyzát 2 $, K₂HP0₄ 0,68 $, oligobiogenní prvky 0,1$ základního roztoku (H^SO^ 17,4 g, MgS0₄«7H₂0 12,3 g, MnSO^I^O 0,22 g, FeS°₄.7H₂0 2,0 g, ZnS0₄.7H₂0 1,44 g, CaCl₂*6H₂0 18^3 g, H₂0 1000 ml)· Kulturou z 1 šikmého agaru zaočkovóiiy vždy 3 baňky· Předočkovací tank se očkuje 1 až 3 $ objemu 12 hodinovou kulturou z třepačky, fermentor se oškuje 2-10 % objemu 20 hodin starou kulturrou z předočkovacího tanku. Kultivace ve fermentačním tanku probíhá při 28 až 32*C za vzdušnění 1/2 objemem vzduchu a míchání 300 ot/min· 32-64 hodin, až dojde k uvolnění spor a krystalů z 95 $ buněk kultury· Po skončení fermentace se do tekutiny v tanku s biomasou B. thuringiensis přimíchává laktosa (5 až 10 % počítáno na sušinu) a Slovesol (10-15$), míchá se 30 min· za současného chlazení a pak se celý objem suší na sprayové sušičce (vstup 150 - 200*C, výstup max·

80*C)· Aktivita sušiny se stanoví testěm na larvách Culex pipiens autogenicus a určí se počet jednotek aktivity preparátu·

Přiklad 2.

Živná půda pro předočkovací tank a fermentor se skládá z 1,5 $ pšeničné mouky, 1,0 $ glukosy, 0,5 $ kvasní čného extraktu, 0,1 % HHgPO^I^O, 0,05 $ MgS0₄.7H₂0,

0,3 $ NaCl, 0,01 $ Pe₂(S0₄)^· pH upraveno na 7,0 - 7,2· Předočkovací tank se záočkuje 1-3 $ vegetativního inokula produkčního kmene starého 12 hod·, vyrostlého na rotačním třepacím stroji na půdě obsahující 1 $ škrobu,

0,79 $ peptonu, 1,5 $ kvasničného autolyzátu, 0,68 K₂HPO₄ a 0,1 $ oligobiogenních prvků (viz příklad 1) a kultivuje ee při 29 - 30*C za vzdušnění 1/2 objemem vzduchu a mícháni 200 ot/min 20 hod· Tímto inokuleiů se záočkuje fermentor še stejnou půdou· Kultivace ve fermentoru probíhá při 30*C za vzdušnění 1/2 objemem a mícháním 300 ot/min· až 64 hod·, až dojde k uvolnění spor a krystalů v 95 $ kultury·

235 785

K bio^ase spor a krystalů ve fermentační tekutině se přidá 5-106 NaCl a smáčedlo Syntapon IQ %, sahustí se na filmové odparce a usuší na sprayové sušičce jako v příkladu 1·

V získaném prepařótě se stanoví biotestem na larvách komárů Aedes cantans počet jednotek aktivity·

Příklad 3·

Živná půda v předočkovacím a fermentačním tanku má složení 0,75 % peptonu, 0,5 % kvasničného extraktu, 1,2 % glukosy,

0,5 % KH₂P0., 0,05 36 MgS0₄.7H₂0, 0,3 % NaCl, 0,01 %

Fe₂(S0₄)j· Živná půda v baňkách na třepačce má složení 1*0 56 glukosy, 1,0 % kvasničného autolyzátu, 0,75 % peptonu,

0,5 % KgHPO^ a 0,1 % oligobiogenních prvků (viz příklad 1)·

Postup při inokulaci a fermentaci jsou stejné jako v příkladě 1·

Biomasa spor a krystalů ve fermentační tekutině se ochladí asi na 20*C a zahustí asi 6-krát na separátoru typu Alfa Laval. Ke koncentrátu se přidá laktosa (5 až 15 % na sušinu) a smáčedlo Triton X 100 (5 až 10 56), míchá se asi 30 min. a precipituje se 2 objemy acetonu. Precipitát se oddělí filtrací a suší se v proudu vzduchu. Aktivita se určuje biotestem na larvách komárů a srovná se s aktivitou mezinárodního standardu·Příklad účinnosti bakterijního preparátu na larvy L3 komára Culex pipiens autogenicus mortalita

konc. prep.	24 hod	48	hod
0,3 mg/litr	100 56
0,2 mg/litr	90 56	100 %
0,1 mg/litr	10 56	60	56
0,05 mg/litr	10 56	50	%
0,025 mg/litr	0 56	10	56
kontrola	mm	mm

Claims (2)

1· Způsob výroby specifického miknobního preparátu proti larvám komárů a muchniček z kryataloforního bacila Baeilue thuringiensis eerovar H-14 (israelensis),

H-13 (pakistani) a H-7 (aizewai) áubmersní metodou za Stálého míchání a vzdušnění při teplotě 29 · 32*C zaočkováním do sterilní tekutá půdy obsahující asimilovatelná sacharidy a asimilovatelný organický zdroj dusíku, vyznačený tím, že asimilovatelných sacharidů a aeimilovatelného zdroje dusíku s obsahem růstových faktorů a vitaminů se použije v poměru 1:1 až 3:1 za přidání oligobiogenních prvků při výchozím pH do 7»5, přičemž ukončení fermentace je při uvolnění spor a krystalů a tyto se z fermentační půdy izolují a po přídavku smáčedla a ochranné látky se suší při teplotách do 80*C·

2· Způsob podle bodu 1 vyznačený tím, že ae jako ochranná látka použije laktosa nebo chlorid sodný·

Vytiskly Moravské tiskařské závody,