CS234379B1 - Způsob šlechtění mikroorganismu Bacillus subtilis a vyšlechtěný kmen - Google Patents

Abstract

Vynález se týká způsobu šlechtění mikroorganismu Bacillus subtilis pomocí auta— f enních zásahů UV světla o vlnové délce 53,7 nm neb N-nitroso-ethylmočovinou a 3 až 4násobné selekce, čímž se získá kmen schopný sporulovat v 85 až 90 % populace.

Description

Vynález se týká způsobu Šlechtěni mlkroorganiemu Baelllua subtills, např. jeho kmene BS 20, za účelem získáni nového kmene a mohutnou sporulaei a jeho využití pro ovlivňování střevní mikroflory hospodářských zvířat.

Životni cyklus sporulujících mikroorganismů je tvořen dvěma odlišnými fázemi: vegetativním růstem a sporulaei. Kontrola vegetativního růstu vylučuje vSak sporulaei a obráceně. Oba procesy se odlišují v několika aspektech: v nárokování energie, v enzymová aktivitě, ve výživových nárocích spod. V nejjednoduěií formě ze regulace projevuje načasovanou syntézou některých mikrobiálních enzymů a produktů.

Účelem vynálezu je vypracovat způsob Šlechtění mikroorganismu Bsoillus subtills za účelem získání nového kmene a mohutnou sporulaei a jeho využití pro ovlivněni střevní mikroflory některých hospodářských zvířat. Výchozím materiálem pro Šlechtění je kmen, označený BS 20, který se vyznačuje slabou sporulaei, takže vyaporulovévé jen 60 % populace a na masopeptonovém agaru tvoří kolonie různého tvaru a povrchu od drsných až po hladká a s pravidelným až laločnatým okrajem.

Způsob Šlechtění a selekce kmene BS 20 mikroorganismu Bacillua subtills, jehož sporulace je omezená, spočívá v tom, že se suspenze jeho spor ozařuje UV světlem germicidní lampy s maximem záření v oblasti vlnová dálky 253,7 nm o výkonu 10,7 J/m^/s ze vzdálenosti 20 až 25 cm po dobu 60 až 90 s, případně že se na kulturu jeho vegetativních buněk působí H-nitrosoethylmočovinou ve vodném roztoku s hodnotou pH 6,0 a v koncentraci 5.10“¹ mM po dobu 60 až 90 min, načež se izolují mutanty, které se dále selektují. Při selekci se sledují izoláty se zvýěenou schopností sporulace a tím je dosaženo plně sporulujícího kmene Sp⁺⁺, u kterého vysporuluje 85 až 90 % populace.

Principem je aplikace mutagenu na sporovou suspenzi nebo na suspenzi vegetativních buněk. Jako mugateny je možno použít nitroso- a thio-sloučeniny charakterizované methyla alkyl-aktivitou, a to přednostně na vegetativní buňky, nebo UV záření či gamma-paprsky na sporovou suspenzi. Pro získání kmene SP⁺⁺ je s výhodou použito fyzikálních mutsgenů. Roztoky mutegenů se připravují v koncentraci řádově 1.10“* mM a působí se jimi 60 až 90 min.

Výchozí sbírkový kmen BS 20 mikroorganismu Bacillua subtills, který ss vyznačuje meněl sporulaei, tvoři na masopeptonovém agaru kolonie rozličného tvaru a povrchu, od drsných až po hladké, s okrajem pravidelným až laločnatým. Mutagenním zásahem a následující dvou až třínésobnou selekcí aezíská nový kmen Bacillua subtills CCM 3 623, který na masopeptonovém agaru tvoří převážně drsná kolonie a neprodukuje pigment, nebo jen pigment slabě hnědavý, difundujloí do živné půdy, a který se vyznačuje mohutnou sporulaei (SP*+ 85 až 90 %). Jeho spory jsou odolná vůči zahříváni do 80 °C po dobu 30 až 45 min. Pro svoji odolnost je schopen dlouhodobým podáváním ovlivnit mikrofláru zažívacího traktu hospodářských zvířat a umožnit tak i plné využití podávaného krmivá.

Získanou vlastnost mohutná sporulace lze prokázat na sporulačnlch půdách, např. na masopeptonovém agaru, na A de King-agaru apod·, ale z hlediska praktického i při submerznl kultivaci na třepacím stroji.

V souhlase s poznatky humenní medicíny zůstávají spory Bacillua subtills podaná v dostatečném množství v dietě žaludkem nedotčeny účinkem nízkého pH a trávicích enzymů. Klíčení spor začíná až v tenkém střevě a kultura ae vyvíjí do vegetativní formy vlivem tepla, vlhkosti a složení prostředí. Je nutné, aby klíčení spor a vývoj vegetativních buněk byl dostatečně rychlý vzhledem k pohybu materiálu v zažívacím traktu. Při klíčení se uvolňují bakteriolytické enzymy, které působí na ostatní nežádoucí mikrofloru a dochází k vytvoření přirozeného poměru přítomných mikroorganismů, např. coliformních bakterií a enterokoků apod. Tím je dána i větěí odolnost zvířete k nákazám zažívacího traktu.

Příklad kultivace vyšlechtěného kmene Bacillus subtilis sbírkového označení CCM 3 623: Kulturou tohoto kmene, vyrostlou na šikmém masopeptonovém agaru při 37 °C za dobu 4 až 5 dní a pak uloženou v chladničce při -«-5 °C, se pomocí kličky očkuje 80 ml půdy v Erlenmayerově baňce o objemu 750 ml. živná půda má toto složení:

kukuřičná mouka 1,8 % hmot.

glukóza 1,8 % hmot.

kukuřičný extrakt 1,0 % hmot.

2taSO₄.H₂O 0,2 % hmot.

CaCO^ 0,3 % hmot.

H₂0 zbytek

Hodnota pH půdy se neupravuje. Sterilizace této živné půdy ee provádí při teplotě 120 °C po dobu 30 min. Baňky se kultivuji na rotační třepačce e 240 ot/min a s výchylkou 25 mm při teplotě 37 °C po dobu 48 až 54 hodin. Sporulace se zjišíuje výsevem suspenze po 15 minutovém zahřívání na teplotu 75 °C na sporulační půdu a pro kontrolu sporulace slouží nazahřívaná suspenze. Kultura eporuluje v rozmezí 85 až 90 %.

Claims (2)

1. Způsob Šlechtění mikroorganismu Bacillus aubtilie, např. jeho kmene, označeného

IBS 20, vyznačující se tím, že se suspenze jeho spor ozařuje UV světlem germicidní lampy s maximem záření v oblasti vlnové délky 253,7 nm o výkonu 107 J/m /s ze vzdálenosti 20 cm po dobu 60 až 90 s, případně že se na kulturu jeho vegetativních buněk působí N-nitroso-ethylmočovinou ve vodném roztoku s hodnotou pH 6,0 a v koncentraci 5.10^_1 mlí po dobu 60 až 90 min, načež se izolují mutanty, které se pak podrobí selekcím, přinichž se sledují izoláty se zvýšenou schopností sporulace a po 3 až 4 selekčních pokusech se získá izolát schopný sporulace v 85 až 90 % populace.

2. Vyšlechtěný kmen mikroorganismu Bacillus subtilis sbírkového označení CCM 3 623, schopný sporulace v 85 až 90 % populace, jehož spory jsou resistentní k tepelnému namáháni do 85 °C po dobu 30 až 45 min.