CS232904B1 - Způsob šlechtění mikroorganismu Bacillus subtilis a vyšlechtěný kmen - Google Patents

Abstract

Vynález se týká způsobu šlechtěni mikroorganismu Bacillus subtilis pomocí mutagenních zásahů N-nitro-N-nitroso-metyl- -guanidinem, N-nitroso-metylmočovinu a selekce mezi mutagenními pokusy, která sleduje produkci exoproteaz a vede k izolaci kmene se stabilní produkcí exoproteaz o aktivitě 8 000 až 10 000 SRN.

Description

Vynález se týká šlechtění mikroorganismu Bacillus subtilis, zejména jeho kmene UV <20, za účelem získání jeho nového kmene se zvýšenou produkt! exoproteáz 1 jeho sporulace, dávající záruky a předpoklady pro jeho využitelnost pro přípravu krmného blopreparátu použitelného jako přípravek do krmivá hospodářských zvířat.

Se sporulašní fází je u bakteriálních mikroorganismů spojena řada biosyntetických aktivit, které těsněji nebo volněji souvisejí geneticky e fyziologicky s tvorbou epor.

Např. maximální syntéza mimobuněčných proteolytických enzymů nastává před sporulací v pozdní exponenciální nebo v Sasné stacionární fázi růstu, polypeptidová antibiotika jsou produkována na začátku sporulace, amyláza v pozdějších stadiích sporulace apod.

Genetická analýza mutant nesporulujlcích (Sp^-) nebo tnálo sporulujících (Osp) s ohledem na sporulaci a tvorbu exoproteáz ukázala, že vztahy mezi těmito a dalšími, znaky, které souvisejí se sporulací, jsou vztahem pleiotropie. Tak např. pokusy s mutaňtami mikroorganismu Bacillus subtilis vyznačující se sníženou produkcí exoproteázy a fenotypem Sp a jejich reverzemi fenotypu Fr⁺Sp⁺ bylo dokázáno, že uvedený genetický vztah existuje.

Účelem vynálezu je vypracovat na základě uvedených genetických vztahů způsob šlechtění tohoto mikroorganismu, zejména pak jeho kmene UV 120, jehož charakterem je špatná sporulace a nízká produkce exoproteáz o syřivé aktivitě pouze kolem 3 500 j. a připravit nový kmen se zvýšenou schopností produkce exoproteáz a dobrou sporulací.

Šlechtění a selekce mikroorganismu Bacillus subtilis způsobem podle vynálezu spočívá v tom, že se na kulturu jeho vegetativních buněk působí N-nitro-N-nitroso-metylguenidinem v koncentraci 2.10¹ mM ve vodném roztoku s hodnotou pH 8,0 po dobu 10 až 60 min. načež se odizoluji mutanty, které se dále podrobí mutagennímu působení N-nitroso-metylmočoviny ve vodném roztoku o hodnotě pH 6,0 v koncentraci 2.10° oM po dobu 20 min., případně se podrobí ozáření germicidnl lampou o výkonu 10,7 J/m /s, jejíž UV světlo má maximum záření v oblasti vlnové délky 253,7 nm ze vzdálenosti 17 až 25 cm a mezi mutagenními pokusy se provede selekce podle produkce exoproteáz. Po dvou vložených pokusech selekce se získá stabilní kmen s vysokou produkcí exoproteáz.

Získaný materiál se testuje podle schopnosti produkce exoproteáz, výsledné izoláty jsou dále podrobeny mutagenním zásahům při střídání mutagenů a selekce a ohledem na produkci. Po čtyřnásobném opakování pokusu s N-nitro-N-nitroeo-metylguanidlnem a s N-nitroso-metylmočovinou a vložené selekci se izoluje stabilní kmen Bacillus subtilis CCM 3622, vyznačující se zvýěenou produkcí exoproteáz a dobrou sporulací.

Principem je aplikace mutangenu na suspenzi vegetativních buněk připravených 18hodinovou kultivací Bacillus subtilis UV 120 na jednoduché rozpustné půdě obsahující sacharidy jako zdroj uhlíku, dusíkaté sloučeniny jako zdroj dusíku a stopové prvky. Jako mutagenů je možno použít nitroso- a thio- sloučeniny charakterizované metyl- a alkyl- aktivitou s výhodou střídání dvou mutagenů a následné selekce. Roztoky mutagenů se připravují v pufru o pH 6,0 až 9,0 podle povahy mutagenu v koncentraci řádově 1.10° mM nebo 1.10' mM v délce působení 10 až 60 minut.

Výchozí kmen UV 120 mikroorganismu Bacillus subtilis, který se vyznačuje produkcí exoproteáz o aktivitě cca 3 500 SRN, tvoří-kolonie hladkého povrchu produkující hnědavý pigment difundující do půdy. Uvedenými mutagenními zásahy s následnými selekcemi se získá kmen Bacillus subtilis CCM 3622, který má zvýšenou produkci exoproteáz o aktivitě 8 000 až 10 000 SRN a dobrou sporulaci. Na masopeptomovém agaru .tvoří drsné, menší kolonie a rovněž produkuje hnědavý pigment difundující do živné půdy.

Po kultivaci' kmene CCM 3622 obsahuje médium směs exoproteáz a dalších průvodních exometabolitů, čímž vzniká balancovaný preparát uplatňující se při výkrmu zvířet, nebol působením proteolytických enzymů se zvýší využití krmivá a to hlavně u zvířet s vlmstní nedostatečnou účinností proteaz.

Příklad jeho kultivace:

Kulturou kmene Bacillus suhtilis CCM 3622 vyrostlou na Šikmém masopeptovém agaru při 37 °C za dobu 3 až 4 dny a pak uloženou v chladničce při teplotě +5 °C se pomocí· kličky očkuje 40 ml půdy v Erlenmayerových baňkách o obsahu 750 ml. Živná půda mé toto složení (v % hmotnostních):

t	krmná žitná mouka	2,0 %
	kukuřičná máčecí voda zahuStěná	3,0 %
	suSené odtučněné mléko	1,5 %
	suSené kvasnice	0,5 %

Hodnota pH této živné půdy se neupravuje - po sterilizaci má hodnotu kolem 6,0. Sterilizuje se při 120 °C po dobu 30 min. SuSené mléko jako 10% roztok se sterilizuje věak zvláěí, rovněž při 120 °C, ale po dobu 20 min a teprve po sterilizaci se přidává do živné půdy už vysterilizované.

živná půda se pak rozděluje do uvedenýoh baněk po 40 ml a mikroorganismus se kultivuje na rotační třepačce s 240 ot/min a s výchylkou 25 mm. Vzorky ke stanovení proteáz se odebírají v 36., 48 a 72. hodině kultivace. Maximum produkce obvykle nastává ve 48. hodině a dále se už produkce nemění.

Claims (2)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   1. Způsob šlechtění mikroorganismu Bacillus subtilis, zejména jeho kmene UV 120, vyznačující se tím, že na kulturu jeho vegetativních buněk se působí N-nitro-N-nitroso-metylguanidinem v koncentraci 2.10^-lmM ve vodném roztoku s hodnotou pH 8,0 po dobu

   10 až 60 min, načež, se izolují mutanty, které se dále podrobí mutagennímu působení

   N-nitroso-metylmočoviny ve vodném roztoku o hodnotě pH 6,0 v koncentraci 2.10°mM po o dobu 20 min, případně se podrobí ozáření germicidní lampou o výkonu 10,7 J/m /s, jejíž UV světlo má maximum záření v oblasti vlnové délky 253,7 nm ze vzdálenosti 17 až 25 cm a a mezi mutagenními pokusy se provede selekce podle produkce exoproteáz a po dvou vložených pokusech selekce se získá stabilní kmen s vysokou produkcí exoproteáz.
2. 2. Vyělechtěný kmen mikroorganismu Bacillus subtilis sbírkového označení 3622 s vysokou produkcí exoproteáz o aktivitě 8 000 až 10 000 SRN.