CS231279B1 - Způsob izolace antibiotika tylosinu - Google Patents

Abstract

Vynález řeší způsob izolace antibiotika tylosinu z vyfermentované půdy po skončení kultivace produkčního kmene Streptomyces fradiae. Způsob podle vynálezu se vyznačuje tím, že se vyfermentovaná půda upraví přidáním kationaktivního detergentu, s výhodou dimethylbenzyldodeciniumbromidu (Ajatinu) v koncentraci 0,05 % obj., vztaženo na 100 % obj. vyfermentované půdy, dále se přidá formadehyd v koncentraci 0,5 % obj. a síran hlinitý v koncentraci 1,5 % hmot.obj. Potom se oddělí pevná část a filtrát se extrahuje semipolárním organickým rozpouštědlem, s výho- ' dou butylacetátem, z kterého se tylosin i vysráží jako sůl acetonovým roztokem ky- ? seliny, s výhodou 1 % roztokem kyseliny i vinné, a tento tylosin-tartarát se převe- * de na tylosin-bázi o účinnosti 990 m.j. na 1 mg.

Description

Vynález řeší způsob izolace antibiotika tylosinu z vyfermentované půdy po skončení kultivaee produkčního kmene Streptomyces fradiae.

Tylosin je makrolidové antibiotikum sumárního vzorce °45^Η77^θ17* ^9lat|ě bázického charakteru. Je málo rozpustný ve vodě, dobře v polárních a semipoláraích organických rozpouštědlech, nerozpustný v nepolárních rozpouštědlech jako je hexan nebo petrolether. Jeho vodné roztoky jsou stálé při pH v rozmezí hodnot 5,5 až 8,0. Kyselou hydrolýzou přechází na tzv. desmykosin, což je látka biologicky podobně aktivní jako tylosin* Tylosin tvoří s kyselinami dobře krystalizující sole, rozpustné ve vodě i v polárních organických rozpouštědlech.

Tylosin je antibiotikum účinné především proti grampozitivním bakteriím a mykoplazrnozám /Ose E.E.s J.Am.Vet.A. 157, 421-425, 1960/. Samotný tylosin se využívá zejména při léčbě dysentérií a pneumonií hospodářských zvířat /Curtins R.A.S Can.Vet.J. 5, 285-288, 1962} Doornebal H.í Can.J.Comp.ffied.Sei 29, 179-182, 1965} Schovánek V.s Veterinářství 25, 505-507, 1975/. široce jsou využívány i jeho kombinace, jako např. se sulfonamidy /Ose E.E.í Vet.ffied.Smáli Anim.Clin. 68, 559-545, 1975í Eeichel P.: Biol.Chem.Výž.zvířat 10, 545-550, 1974/, furazolidinem /US 5,690,869/, colistinem /Ger.offen 2,527,592/, jakož i s inertními přísadami, např. síranem sodným /US 5,925,995/, polyoxyethylenestery /Brit. 1,219,785/ nebo s močovinou /Ger.offen 1,812,471/. Ka přípravu léčebných přípravků se též používají sole tylosinu jako tartarát, chlorid, fosfát nebo síran /Bruszew3ki W.s Now.Wet. 6, 549-552, 1972/.

231 279

- 2 V krmných směsích se zase využívá technický tylosin, připravený sprayováním fermentační půdy /Dvořák J., Straková J., Ševčík B.s Biol.Chem.Vet. 18, 77-88, 1982/.

Doposud se tylosin izoloval z fermentační půdy tak, že se odfiltrovalo mycelium, filtrát se extrahoval chloroformem

Λ a po oddestilování chloroformu za sníženého tlaku se z olejoví tého zbytku vysrážel n-hexanem tylosin /US 3,178,341/· Takto připravený tylosin bylo nutno před dalším použitím přečistit rekrystalizací z vody, a nebo připravit z něho tartarát a z něj potom čistou bázi tylosinu /Hamill R.I.: Antib, and Chemother. 11, 328-334, 1961/.

Preparát tylosin o obsahu 40 % účinné látky je možno připravit vysolením tylosinu z filtrátu fermentační půdy, upravené přídavkem 2 až 5 $ síranu zinečnatého, a nebo extrakcí tylosinu alkoholy z vysprayované fermentační půdy, např. 90$ propanolem /AO č. 197 600/. Tylosin podobné čistoty je možno též získat azeotrcpickým oddestilováním vody např. s n-hexylalkoholem /Ger.offen 2,054,085/·

Bylo zjištěno, že tylosin ve formě tartarátu je možno získat ve vysoké Čistotě a výtěžku z vyfermentované živné půdy po ukončení kultivace produkčního kmene Streptomyces fradiae, způsobem podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se vyfermentovaná půda upraví přidáním kationaktivního detergentu v koncentraci 0,01 až 0,5 $ obj·, vztaženo na 100 $ vyfermentované půdy, s výhodou dimethylbenzyldodeciniumbromidu /Ajatinu/ v koncentraci 0,03 $ obj., formaldehydu v koncentraci 0,1 až 0,5 $ obj·, s výhodou 0,3 $ obj., síranu hlinitého v koncentraci 0,5 až 3,0 $ hmot. obj., s výhodou

1,5 $ hmot. obj., n3Čež se oddělí pevná část a filtrát se extrahuje semipolárním organickým rozpouštědlem, s výhodou butylacetátem, z kterého se tylosin vysráží jako sůl acetonovým roztokem kyseliny, s výhodou 1$ roztokem kyseliny vinné, a pře vede se dále na bázi tylosinu.

Pro úpravu vyfermentované půdy je možno použít jako kationaktivního detergentu /kromě již uváděného Ajatinu/ i trimethyldodecyl^hexadecylamoniumchloridu /Tetrasalu/, cetyltri- 3 231 279 me thylamoniumchloridu nebo cetylpyridiniumbromidu. Úprava fermentační půdy se provádí při teplotě 20 až 70 °C. Místo síranu hlinitého jr možno použít i síran hlinitodraéelný. Z upravené fermentaění půdy se oddělí mycelium společně s vysráženými talastními látkami filtrací nebo odstředěním· filtrát, který je takto možno získat až v 90?í výtěžku, se extrahuje ve vodě nerozpustným rozpouštědlem, kromě butylacetátu je možno použít i propylacetát, ethylacetát nebo methylisobutylketon. Extrahovaný filtrát má pH v rozmezí hodnot 7,5 až 9,5· Vyextrahovaný tylosin se sráží z filtrátu vhodnou anorganickou či organickou kyselinou, rozpustnou v polárním či semipolárním organickém rozpouštědle·{[oproti dosud používaným způsobům výroby tylosinu se způsobem podle vynálezu získá přímo čistý tylosin-tartarát, který lze využít buá přímo k přípravě léčivých přípravků, nebo se známými postupy převede připravený· tylosin-tartarát na tylosin-bázi. Kromě výše uvedené výhody přináší způsob podle vynálezu i řadu technologických výhod. Účinkem kationaktivního detergentu se snižuje viskozita fermentační půdy, čímž se zlepšuje její transportovatelnost. formaldehyd zvyšuje stabilitu fermentační půdy, což má význam zejména při průmyslové výrobě tylosinu, kdy není vždy možno najednou zpracovat všechnu vyfermentovanou půdu. Síran hlinitý sráží balastní látky bílkovinné povahy, čímž se zlepšuje filtrovatelnost fermentační půdy a zvyšuje se výtěžek a čistota získaného tylosinu. Použitím butylacetátu místo chloroformu se zvyšuje selektivita extrakce, získaný extrakt není nutno zahušíovat za sníženého tlaku, ale je možno ho přímo srážet vhodnou kyselinou a po odfiltrování soli tylosinu je možno regenerovat organické rozpouštědlo běžnými způsoby.

Následující příklad provedení způsob podle vynálezu pouze dokládá, ale nijak neomezuje·

Do 4 000 ml fermentační půdy o účinnosti 2 890 m.j. na 1 ml půdy se přidají 4 ml trimethyldodecyljthexadecylamoniumchloridu /Tetrasalu/ a směs se 2 hod míchá. Pak se přidá 12 ml 38$ formaldehydu, míchá se dalších 30 minut a pak se do směsi pomalu přilévá 40 g oktadekahydrátu síranu hlinitého - Alg/SO^/j • 18 HgO, rozpuštěného ve 100 ml vody, směs se míchá další

231 279 hodfl^Z takto upravené fermentační půdy se získá odstředěním 3 650 ml filtrátu, ke kterému se přidá 800 ml butylacetétu a za míchání se upraví pH směsí na hodnotu 8,9 až 9,0. Fo 30 min míchání se oddělí organická fáze a vodná fáze se ještě jednou extrahuje 400 ml butylacetátu. Spojené butylacetátové extrakty se přidají za míchání do 800 ml acetonu, ve kterém je rozpuštěno 5 g kyseliny vinné. Vzniklá směs se 2 h^ míchá a vy srážený tylosin-tartarát se odfiltruje, promyje 50. ml acetonu a vysuší volně na vzduchu. Získá se 11 g čistého tylosin-tartarátu o účinnosti 850 m.j. na 1 mg substance, oož je 82Jř výtěžek· g tylosin-tartarátu se rozpustí ve 100 ml vody, přidají ee g aktivního uhlí a 15 min se směs míchá. Potom se aktivní uhlí odfiltruje, promyje se na filtru 20 ml vody, která se přidá k filtrátu a ten se zahřeje na 45 °0· K zahřátému filtrátu se po kapkách přidává 10$G roztok hydroxidu sodného až do hodnoty pH 8,8. Po přidání roztoku hydroxidu sodného se ke směsi přidá 15 g chloridu sodného, přičemž směs intenzivně mícháme a udržujeme teplotu na 45 °0. Směs po přidání chloridu ještě min mícháme, potom odfiltrujeme vysrážený ty losin a promyjsme ho na filtru 30 ml teplé vody· Tylosxn se vysuší ve vakuové sušárně při teplótě max. 60 °C. Získá se 8,2 g báze tylosinu o účinnosti 990 m.j. na 1 mg· .

Claims (1)

1. PŘEDMĚT ¥ Y U / L Ε Z U

   231 279

   Způsob izolace antibiotika tylosinu z vyfermentované půdy po skončení kultivace produkčního kmene Streptomyoes fradiae vyznačující se tím, Se se vyf ermeat ováná půda upraví při· dáním kationaktivního detergentu v koncetraci 0,01 aS 0,5 % objfciTwztaSeno na 100 % vyfermentované půdy, s výhodou dimo+ThtrT Kom σνί Λ ηΛ ví 4 ητηΉ>»Ληι4 Λ η ττ Ιγλπ αωπ+·ύ»ολ·ι Α Α^Ε λΚ -4 £3 ismsutijs Á s výhodou 1,5 # hmofjkobjiTT^hačeš se oddělí pevná část a filtrát se extrahuje semipolárním organickým rozpouštědlem, s výhodou butylacetátem, z kterého se tylosin vysraží jako sůl acetonovým roztokem kyseliny, s výhodou 1% roztokem kyseliny vinné, a převede se dále na bázi tylosinu.