CS231279B1

CS231279B1 - Method of tylosin antibiotic isolation

Info

Publication number: CS231279B1
Application number: CS832046A
Authority: CS
Inventors: Stefan Mazan; Julius Kliment
Original assignee: Stefan Mazan; Julius Kliment
Priority date: 1983-03-24
Filing date: 1983-03-24
Publication date: 1984-10-15
Also published as: CS204683A1

Abstract

Vynález řeší způsob izolace antibiotika tylosinu z vyfermentované půdy po skončení kultivace produkčního kmene Streptomyces fradiae. Způsob podle vynálezu se vyznačuje tím, že se vyfermentovaná půda upraví přidáním kationaktivního detergentu, s výhodou dimethylbenzyldodeciniumbromidu (Ajatinu) v koncentraci 0,05 % obj., vztaženo na 100 % obj. vyfermentované půdy, dále se přidá formadehyd v koncentraci 0,5 % obj. a síran hlinitý v koncentraci 1,5 % hmot.obj. Potom se oddělí pevná část a filtrát se extrahuje semipolárním organickým rozpouštědlem, s výho- ' dou butylacetátem, z kterého se tylosin i vysráží jako sůl acetonovým roztokem ky- ? seliny, s výhodou 1 % roztokem kyseliny i vinné, a tento tylosin-tartarát se převe- * de na tylosin-bázi o účinnosti 990 m.j. na 1 mg.The invention provides a method for isolating the antibiotic tylosin from fermented soil after the end of cultivation of the production strain Streptomyces fradiae. The method according to the invention is characterized in that the fermented soil is treated by adding a cationic detergent, preferably dimethylbenzyldodecinium bromide (Ajatin) in a concentration of 0.05% vol., based on 100% vol. of fermented soil, then formaldehyde is added in a concentration of 0.5% vol. and aluminum sulfate in a concentration of 1.5% wt./vol. Then the solid part is separated and the filtrate is extracted with a semipolar organic solvent, preferably butyl acetate, from which tylosin is precipitated as a salt with an acetone solution of acid, preferably a 1% solution of tartaric acid, and this tylosin tartrate is converted into tylosin base with an activity of 990 IU per 1 mg.

Description

Vynález řeší způsob izolace antibiotika tylosinu z vyfermentované půdy po skončení kultivaee produkčního kmene Streptomyces fradiae.The invention provides a method for isolating the antibiotic tylosin from fermented soil after the culture of Streptomyces fradiae production strain.

Tylosin je makrolidové antibiotikum sumárního vzorce °45^Η77^θ17* ^9lat|ě bázického charakteru. Je málo rozpustný ve vodě, dobře v polárních a semipoláraích organických rozpouštědlech, nerozpustný v nepolárních rozpouštědlech jako je hexan nebo petrolether. Jeho vodné roztoky jsou stálé při pH v rozmezí hodnot 5,5 až 8,0. Kyselou hydrolýzou přechází na tzv. desmykosin, což je látka biologicky podobně aktivní jako tylosin* Tylosin tvoří s kyselinami dobře krystalizující sole, rozpustné ve vodě i v polárních organických rozpouštědlech.Tylosin is a macrolide antibiotic of the general formula ° 45 ^Η 77 ^ θ17 * ^{9lat |} basic character. It is poorly soluble in water, well in polar and semi-polar organic solvents, insoluble in non-polar solvents such as hexane or petroleum ether. Its aqueous solutions are stable at pH values ranging from 5.5 to 8.0. Acidic hydrolysis leads to the so-called desmycosin, which is a biologically similar active substance as tylosin.

Tylosin je antibiotikum účinné především proti grampozitivním bakteriím a mykoplazrnozám /Ose E.E.s J.Am.Vet.A. 157, 421-425, 1960/. Samotný tylosin se využívá zejména při léčbě dysentérií a pneumonií hospodářských zvířat /Curtins R.A.S Can.Vet.J. 5, 285-288, 1962} Doornebal H.í Can.J.Comp.ffied.Sei 29, 179-182, 1965} Schovánek V.s Veterinářství 25, 505-507, 1975/. široce jsou využívány i jeho kombinace, jako např. se sulfonamidy /Ose E.E.í Vet.ffied.Smáli Anim.Clin. 68, 559-545, 1975í Eeichel P.: Biol.Chem.Výž.zvířat 10, 545-550, 1974/, furazolidinem /US 5,690,869/, colistinem /Ger.offen 2,527,592/, jakož i s inertními přísadami, např. síranem sodným /US 5,925,995/, polyoxyethylenestery /Brit. 1,219,785/ nebo s močovinou /Ger.offen 1,812,471/. Ka přípravu léčebných přípravků se též používají sole tylosinu jako tartarát, chlorid, fosfát nebo síran /Bruszew3ki W.s Now.Wet. 6, 549-552, 1972/.Tylosin is an antibiotic particularly effective against Gram-positive bacteria and mycoplasmosis / Ose E.E.s J.Am.Vet.A. 157, 421-425 (1960)]. Tylosin alone is used in particular in the treatment of dysentery and pneumonia in livestock / Curtins R.A.S Can.Vet.J. 5, 285-288, 1962} Doornebal H. Can.J.Comp.ffied.Sei 29, 179-182, 1965} Schovánek V.s Veterinary 25, 505-507, 1975]. its combinations are also widely used, such as with sulfonamides / Ose E. E. Vet.ffied.Small Anim.Clin. 68, 559-545, 1975; Eeichel P .: Biol.Chem.Animal Nut 10, 545-550 (1974), furazolidine (US 5,690,869), colistin (Ger.offen 2,527,592), as well as with inert additives such as sodium sulfate (US 5,925,995), polyoxyethylene esters (Brit. 1,219,785 (or with urea (Ger .offen 1,812,471)). Tylosin salts such as tartrate, chloride, phosphate or sulfate / Bruszewki W.s. Now.Wet are also used in the preparation of medicaments. 6, 549-552, 1972].

231 279231 279

- 2 V krmných směsích se zase využívá technický tylosin, připravený sprayováním fermentační půdy /Dvořák J., Straková J., Ševčík B.s Biol.Chem.Vet. 18, 77-88, 1982/.- 2 In feed mixtures, technical tylosin, prepared by spraying of fermentation broth, is used / Dvořák J., Straková J., Ševčík B. with Biol.Chem.Vet. 18, 77-88 (1982)].

Doposud se tylosin izoloval z fermentační půdy tak, že se odfiltrovalo mycelium, filtrát se extrahoval chloroformemTill now, tylosin was isolated from the fermentation broth by filtering the mycelium, the filtrate extracted with chloroform

Λ a po oddestilování chloroformu za sníženého tlaku se z olejoví tého zbytku vysrážel n-hexanem tylosin /US 3,178,341/· Takto připravený tylosin bylo nutno před dalším použitím přečistit rekrystalizací z vody, a nebo připravit z něho tartarát a z něj potom čistou bázi tylosinu /Hamill R.I.: Antib, and Chemother. 11, 328-334, 1961/.Po and after the chloroform was distilled off under reduced pressure, tylosin was precipitated from the oily residue with n-hexane (US 3,178,341). The tylosin thus prepared had to be purified by recrystallization from water before use or to prepare tartrate and then pure tylosin base from it. RI: Antib and Chemother. 11, 328-334 (1961)].

Preparát tylosin o obsahu 40 % účinné látky je možno připravit vysolením tylosinu z filtrátu fermentační půdy, upravené přídavkem 2 až 5 $ síranu zinečnatého, a nebo extrakcí tylosinu alkoholy z vysprayované fermentační půdy, např. 90$ propanolem /AO č. 197 600/. Tylosin podobné čistoty je možno též získat azeotrcpickým oddestilováním vody např. s n-hexylalkoholem /Ger.offen 2,054,085/·A 40% tylosin preparation can be prepared by salting tylosin from a fermentation broth filtrate treated with 2 to 5% zinc sulfate, or by extracting tylosin with alcohols from a sprayed fermentation broth, for example 90 $ propanol (AO No. 197 600). Tylosine of similar purity can also be obtained by azeotropically distilling water with, for example, n-hexyl alcohol (Ger.offen 2,054,085).

Bylo zjištěno, že tylosin ve formě tartarátu je možno získat ve vysoké Čistotě a výtěžku z vyfermentované živné půdy po ukončení kultivace produkčního kmene Streptomyces fradiae, způsobem podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se vyfermentovaná půda upraví přidáním kationaktivního detergentu v koncentraci 0,01 až 0,5 $ obj·, vztaženo na 100 $ vyfermentované půdy, s výhodou dimethylbenzyldodeciniumbromidu /Ajatinu/ v koncentraci 0,03 $ obj., formaldehydu v koncentraci 0,1 až 0,5 $ obj·, s výhodou 0,3 $ obj., síranu hlinitého v koncentraci 0,5 až 3,0 $ hmot. obj., s výhodouIt has been found that tylosin tartrate can be obtained in high purity and yield from fermented broth after cultivation of the Streptomyces fradiae production strain by the method of the invention, which comprises treating the fermented broth with a cationic detergent at a concentration of 0, 01 to 0.5 $ vol, based on 100 $ fermented soil, preferably dimethylbenzyldodecinium bromide (Ajatin) at a concentration of 0.03 $ vol, formaldehyde at a concentration of 0.1 to 0.5 $ vol, preferably 0.3 % aluminum sulphate at a concentration of 0.5 to 3.0% by weight; % by volume, preferably

1,5 $ hmot. obj., n3Čež se oddělí pevná část a filtrát se extrahuje semipolárním organickým rozpouštědlem, s výhodou butylacetátem, z kterého se tylosin vysráží jako sůl acetonovým roztokem kyseliny, s výhodou 1$ roztokem kyseliny vinné, a pře vede se dále na bázi tylosinu.1.5 $ wt. The solid is separated and the filtrate is extracted with a semipolar organic solvent, preferably butyl acetate, from which tylosin precipitates as a salt with an acetonic acid solution, preferably a tartaric acid solution, and is further transferred on a tylosin basis.

Pro úpravu vyfermentované půdy je možno použít jako kationaktivního detergentu /kromě již uváděného Ajatinu/ i trimethyldodecyl^hexadecylamoniumchloridu /Tetrasalu/, cetyltri- 3 231 279 me thylamoniumchloridu nebo cetylpyridiniumbromidu. Úprava fermentační půdy se provádí při teplotě 20 až 70 °C. Místo síranu hlinitého jr možno použít i síran hlinitodraéelný. Z upravené fermentaění půdy se oddělí mycelium společně s vysráženými talastními látkami filtrací nebo odstředěním· filtrát, který je takto možno získat až v 90?í výtěžku, se extrahuje ve vodě nerozpustným rozpouštědlem, kromě butylacetátu je možno použít i propylacetát, ethylacetát nebo methylisobutylketon. Extrahovaný filtrát má pH v rozmezí hodnot 7,5 až 9,5· Vyextrahovaný tylosin se sráží z filtrátu vhodnou anorganickou či organickou kyselinou, rozpustnou v polárním či semipolárním organickém rozpouštědle·{[oproti dosud používaným způsobům výroby tylosinu se způsobem podle vynálezu získá přímo čistý tylosin-tartarát, který lze využít buá přímo k přípravě léčivých přípravků, nebo se známými postupy převede připravený· tylosin-tartarát na tylosin-bázi. Kromě výše uvedené výhody přináší způsob podle vynálezu i řadu technologických výhod. Účinkem kationaktivního detergentu se snižuje viskozita fermentační půdy, čímž se zlepšuje její transportovatelnost. formaldehyd zvyšuje stabilitu fermentační půdy, což má význam zejména při průmyslové výrobě tylosinu, kdy není vždy možno najednou zpracovat všechnu vyfermentovanou půdu. Síran hlinitý sráží balastní látky bílkovinné povahy, čímž se zlepšuje filtrovatelnost fermentační půdy a zvyšuje se výtěžek a čistota získaného tylosinu. Použitím butylacetátu místo chloroformu se zvyšuje selektivita extrakce, získaný extrakt není nutno zahušíovat za sníženého tlaku, ale je možno ho přímo srážet vhodnou kyselinou a po odfiltrování soli tylosinu je možno regenerovat organické rozpouštědlo běžnými způsoby.Trimethyldodecyl-hexadecylammonium chloride (Tetrasal), cetyltri- 3 231 279 methylammonium chloride or cetylpyridinium bromide may be used as a cationic detergent (in addition to the already mentioned Ajatin) for the treatment of fermented soil. The fermentation broth is treated at a temperature of 20 to 70 ° C. Aluminum aluminum sulfate can also be used instead of aluminum sulfate. The mycelium is separated from the treated soil fermentation together with the precipitated talastics by filtration or centrifugation. The filtrate, which can be obtained in up to 90% yield, is extracted with a water-insoluble solvent. The extracted filtrate has a pH in the range of 7.5 to 9.5. Extracted tylosin is precipitated from the filtrate by a suitable inorganic or organic acid soluble in a polar or semi-polar organic solvent. tylosin tartrate, which can either be used directly for the preparation of medicaments, or converted to tylosin-based tylosin tartrate by known methods. In addition to the above-mentioned advantage, the process according to the invention also brings a number of technological advantages. The effect of the cationic detergent reduces the viscosity of the fermentation broth, thereby improving its transportability. formaldehyde increases the stability of the fermentation broth, which is particularly important in the industrial production of tylosin, where it is not always possible to process all the fermented broth at the same time. Aluminum sulphate precipitates proteinaceous ballasts, thereby improving the filterability of the fermentation broth and increasing the yield and purity of the obtained tylosin. The use of butyl acetate instead of chloroform increases the selectivity of the extraction, the extract obtained does not need to be concentrated under reduced pressure, but can be directly precipitated with a suitable acid, and after filtration of the tylosin salt, the organic solvent can be recovered by conventional methods.

Následující příklad provedení způsob podle vynálezu pouze dokládá, ale nijak neomezuje·The following exemplary embodiment illustrates the method of the invention but does not limit it in any way.

Do 4 000 ml fermentační půdy o účinnosti 2 890 m.j. na 1 ml půdy se přidají 4 ml trimethyldodecyljthexadecylamoniumchloridu /Tetrasalu/ a směs se 2 hod míchá. Pak se přidá 12 ml 38$ formaldehydu, míchá se dalších 30 minut a pak se do směsi pomalu přilévá 40 g oktadekahydrátu síranu hlinitého - Alg/SO^/j • 18 HgO, rozpuštěného ve 100 ml vody, směs se míchá dalšíTo 4000 ml of fermentation broth with an efficiency of 2890 IU. per ml of soil, 4 ml of trimethyldodecyl] hexadecylammonium chloride (Tetrasal) was added and the mixture was stirred for 2 hours. 12 ml of 38% formaldehyde are then added, stirred for a further 30 minutes, and then 40 g of aluminum sulfate octadecahydrate - Alg / SO4 / .18HgO dissolved in 100 ml of water are slowly added to the mixture, the mixture is stirred for a further

231 279 hodfl^Z takto upravené fermentační půdy se získá odstředěním 3 650 ml filtrátu, ke kterému se přidá 800 ml butylacetétu a za míchání se upraví pH směsí na hodnotu 8,9 až 9,0. Fo 30 min míchání se oddělí organická fáze a vodná fáze se ještě jednou extrahuje 400 ml butylacetátu. Spojené butylacetátové extrakty se přidají za míchání do 800 ml acetonu, ve kterém je rozpuštěno 5 g kyseliny vinné. Vzniklá směs se 2 h^ míchá a vy srážený tylosin-tartarát se odfiltruje, promyje 50. ml acetonu a vysuší volně na vzduchu. Získá se 11 g čistého tylosin-tartarátu o účinnosti 850 m.j. na 1 mg substance, oož je 82Jř výtěžek· g tylosin-tartarátu se rozpustí ve 100 ml vody, přidají ee g aktivního uhlí a 15 min se směs míchá. Potom se aktivní uhlí odfiltruje, promyje se na filtru 20 ml vody, která se přidá k filtrátu a ten se zahřeje na 45 °0· K zahřátému filtrátu se po kapkách přidává 10$G roztok hydroxidu sodného až do hodnoty pH 8,8. Po přidání roztoku hydroxidu sodného se ke směsi přidá 15 g chloridu sodného, přičemž směs intenzivně mícháme a udržujeme teplotu na 45 °0. Směs po přidání chloridu ještě min mícháme, potom odfiltrujeme vysrážený ty losin a promyjsme ho na filtru 30 ml teplé vody· Tylosxn se vysuší ve vakuové sušárně při teplótě max. 60 °C. Získá se 8,2 g báze tylosinu o účinnosti 990 m.j. na 1 mg· .The fermentation broth thus obtained is obtained by centrifuging 3,650 ml of the filtrate to which 800 ml of butyl acetate is added and the pH of the mixture is adjusted to 8.9 to 9.0 with stirring. After stirring for 30 min, the organic phase is separated and the aqueous phase is extracted once more with 400 ml of butyl acetate. The combined butyl acetate extracts are added with stirring to 800 ml of acetone in which 5 g of tartaric acid is dissolved. The resulting mixture was stirred for 2 h and the precipitated tylosin tartrate was filtered off, washed with 50 ml of acetone and air-dried. 11 g of pure tylosin tartrate having an efficiency of 850 IU are obtained. per 1 mg of the substance, i.e. the yield of g of tylosin tartrate is dissolved in 100 ml of water, ee g of activated carbon is added and the mixture is stirred for 15 min. The activated carbon is then filtered off, washed with 20 ml of water on the filter, which is added to the filtrate and heated to 45 DEG C. To the heated filtrate is added dropwise 10% sodium hydroxide solution until pH 8.8. After the sodium hydroxide solution was added, 15 g of sodium chloride was added to the mixture while stirring vigorously and maintaining the temperature at 45 ° 0. Stir the mixture after adding the chloride for a minute, then filter out the precipitated saline and wash it on a filter with 30 ml of warm water. · Tylosxn is dried in a vacuum oven at a temperature of max. 8.2 g of tylosin base having an efficiency of 990 IU are obtained. to 1 mg ·.

Claims

SUBJECT ¥ Y U / L Ε Z U

231 279

Method for isolating tylosin antibiotic from fermented soil after cultivation of a production strain of Streptomyoes fradiae characterized in that the filtered soil is treated by adding a cationic detergent at a concentration of 0.01 and 0.5% by volume to 100% fermented soil, preferably dimo + ThtrT Kom σνί Λ ηΛ knows 4 ητηΉ> Ληι4 Λ η ττ Ιγλπ αωπ + · ύ Κ £ Κ ^ £ £ Κ Κ £ £ £ £ £ £ £ £ £ £ £ £ £ £ £ £ £ £ £ £ £ £ £ is extracted with a semipolar organic solvent, preferably butyl acetate, from which tylosin is precipitated as a salt with an acetonic acid solution, preferably a 1% tartaric acid solution, and converted further on a tylosin basis.