CS230114B1 - Processing method of human leukocyte interferone - Google Patents

Description

230 114

Vynález sa týká spčsobu přípravy Tudského leukocytovéhoÍMterřerÓMM.

Doterajší stav technikyt cantell a Hirvonen připravili in-terferón purifikovaný selektivnym zrážaním /t. cantell, s. Hirvo-nem j. Gen, virol, jg, 54l»(^97^7r ktorý obsahuje nežiaducepříměsi, ktoré sa pri zrážaní dostanú zo zdroj a do finálnehopreparátu. Tento mdže mať potom nežiaduce účinky, napr, vyvolávanievysokých horúčok, M. Rubinstein a kol. využitím zložitých sepa-račných metód připravili interferón vo veTmi malých množstváchs použitím špeciálnych zariadení /m, Rubinstein, s, Rubinstein,p. c, Famílietti, m. S, Gross, r, s, Miller, a. A, waldman, S, Pestkat science 2Ο2, \28g, (\g7tiff, širšiemu využitiu interferénubráni nedostatok vhodných postupov na získanie požadovanéhomnožstva kvalitného preparátu interferónu, uvedené nevýhody v podstatnej miere odstraňuje vynález, kto-rého podstata spočívá v tom, že leukocytárny koncentrát získanýz transfúznej stanice sa podrobí dvojnásobné] erytrolýze chlori-dom amčnnym, leukocyty sa premyjú vo fosfátmi tlmenom fyziologickomroztoku a suspendujú sa v kultivačnom médiu, potom sa infikujús vírusom Newcastelskej choroby a inkubujú sa 8 až 24 h pri 37 °c,čím sa získá surový Tudský leukocytový interferčn, z ktorého satuhé nečistoty odcentrifugujú, okyselí sa kyselinou chlorovodíko-vou na pH 2 na dobu 48 až 72 h, potom sa koncentruje dvojnásobnýmzrážaním s rodanidom draselným, zvyšky rodanidu sa oddialyzujúa napokon sa purifikuje gélovou filtráciou cez modifikovaný sieťo-vaný dextran, pričom frakcia v rozpatí hodnot elučných konštantKav 0,1sa znovu zráža s rodanidom draselným, dialyzujesa a po testovaní aktivity sa zlyofilizuje. - 2 - 230 114 Výhodou navrhovaného spdsobu přípravy lewkocytovéko iwter-ferówu oproti doterajšim postupom je to, že vhodným sklbenimprecipitačnej a separačnej techniky sa dá pripraviť štandardnýpreparát vysokej kvality, ktorý je areaktívny a apyretický,pričom má vysokú Specifická aktivitu, vdčšiu ako milión jednotiekna miligram bielkoviny neobsahuje znečisteniny o relativnej mo-lekulové] hmotnosti vdčšej ako 45 OOO daltonov, pričom celý postupxtie je natoTko zložitý, že by sa nedal robiť vo veTkýck množstvách,takže je ekonomicky nenáročný, výhodou je tiež, že tento liek vy-užívá prirodzený ochranný mechanizmus tým, že ovplyvni buňky v or-ganizme tak, že sú na virusy necitlivé, fialšou výhodou je, Sesemipurifikovný preparát sa dá skladovať pri teplote -40 °c podobu 1 roka, takže sa dá nahromadit' a cfalšiu purifikáciu robiťnaraz s vačším množstvom.

Příklad I spracovanie 10 leukocytových koncentrátovt

Leukocytové koncentráty sa zmiešajú, získá sa 300 ml zmesi, ktorása vmieša do 3000 ml 0,83 % roztoku chlor idu amónneho, vychladené-ho na 4 °c, po dobu 10 min- sa zmes centrifuguje 20 min. priIOCO ot, min~l, Tekutina nad úsadkom sa odsaje a buňky sa resus-pendujú v lOOO ml 0,83 % roztoku chloridu amónneho, po 10 min;sa buňky scentrifugujú 20 miw pri 1000 ot, min“11. Tekutina nadúsadkom sa odsaje a buňky sa resuspendujú v 1000 mi fosfátmitlmenom fyziologickom roztoku na pH 7,2. suspenzia sa scentrifugu-je 20 min, pri 1000 ot, min~J, tekutina nad úsadkom sa odsajea buňky sa suspendujú v 100 ml kultivačného média, ktoré mázloženie /g,l~l/t L-arginin hydrochlorid 0,021 00, L-cystín 0,012 00, L-tyrozťw0,018 00, t-histidín 0,008 00, L-izoleucín 0,026 00, L-leucín0,026 00, L-lyzín 0,029 00, L-metiowíw 0,007 50, L-fenylalanín0,016 50, L-treonin 0,024 00, L-tryptofán 0,004 00, l-voIím0,023 50, L-glutamín 0,292 00, chlorid vápenatý 0,200 00,fenolová červeň 0,010 00, /+/ Biottw 0,001 00, kyselina listová0,001 00, cholinchlorid 0,001 00, nikotinamid 0,001 00,Ό-pantotenát váoenatý 0,001 00, pyridoxal hydrafolorid 0,001 00,i-inozitol 0,001 80, riboflavin 0,00010, glukóza 1,000 00,chlorid sodný na tkanivové kultúry 6,800 00, chlorid draselný 230 114 - 3 - na tkanivové kultúry 0,400 OO, kysly fosforečnan sodný krystalický s 2 vodami 0,125 00, síran horečnatý krystalickýsof vodami 0,200 00, penicilín c-draselná soT 40 jednotiek,síran streptomycinu 40 mikrogramov a 4 objemové percentá agamma-séra, to je Tudské sérum zbavené globulínov precipitáciou síranomamónnym.

Buňky sa spočítajú, zistí sa, že sa získalo 4 500 miliónov leuko-cytov, κ suspenzii sa přidá ešte 350 ml média, čím sa získáítoncentrácia ro7 leukocytov v 1 ml. suspenzia sa umiestni do dvojlitrovej kultivačnej fTaše a infikuje sa so 40 OOO hemaglutinač-ných jednotiek virusu Newcastelskej choroby, FTaša sa dá do ter-mostatu do otáčavého bubna s horizontálnou rovinou otáčaniaa kultivuje sa 8 h pri 37 °c, potom sa suspenzia schladí na 4 °c,scentrifuguje sa 20 min pri 2OOO ot, min"J, Tekutina nad úsadkompředstavuje surový interferón, v tomto Sa na 48 h upraví pH 2pomocou kyseliny chlorovodíkovej, zneutralizuje sa hydroxidomdraselným, κ 46Ο ml surového interferónu sa přidá 46 ml 5 molna liter rodanidu draselného, pH sa upraví kyselinou chlorovodí-kovou na 3,5, Po 60 min sa zmes scentrifuguje 20 min pri 2OOOot, min“l, Tekutina nad úsadkom sa odsaje, úsadok sa rozmiešav 46 ml fyziologického roztoku, pomocou hydroxidu sodného sazneutralizuje, čím sa i precipitát rozpustí, zvyšky rodanidu saodstránia dialýzou. Tento koncentrát sa móže skladovať pri tep-lotě -40 °c celý rok bez straty aktivity, v priebehu purifikáciesa materiál koncentruje a ďalšie kroky sa robia naraz s vačšímmnožstvom, κ 32Ο ml semipurífikovaného preparátu sa přidá 32 ml5 mol na liter roztoku rodanidu draselného pri pH 3,5, Zmes sascentrifuguje 20 min pri 2000 ot, min"1t tekutina nad úsadkomsa odsaje a úsadok sa rozmieša v 32 ml fyziologičk ého roztokua potom sa zneutralizuje. Koncentrát sa potom aplikuje na kolónunaplnenú sieťovým dextranom /sephadex G-75/ s výškou stlpca32 cm a priemerom 10 cm, zlúcia sa robí fosfátmi tlmeným fyziolo-gickým roztokom s prídavkom 0,02 % azidu sodného, hydrostatickýmtlakom výšky 33 cm, pre túto kolónu sú hodnoty Kav 0,1 Iq až0,65 zodpovědné elučnému objemu 1180 až 1800 ml. To znamená,že sa získá 62Ο ml purif ikátu, K tomuto sa přidá 62 ml 5 mol 230 114 na liter rodanidu draselného, okyselí sa na pH 3,5 a scentrifugujesa po dobu 20 min pri 2000 otáčkách za min Tekutina nad úsadkomsa odsaje, úsadok sa rozmieša v 60 ml fyziologického roztoku,přefiltruj e sa cez bakteriologický filter, po odstváneni zbytkovrodanidu dialýzou sa zlyofilizuje. Příklad 2 postupuje sa ako v příklade 1 s tým rozdielom, že získanéleukocyty sa kultivujú 24 h, příklad 3 postupuje sa ako v příklade 1 s tým rozdielom, že v surovominterfer6ne sa upraví pH 2 na 72 h, příklad 4 postupuje sa ako v příklade 2 s tým rozdielom, že v surovominterferóne sa upraví pH 2 na 72 h,

Zudský interferSn mdže nájsť široké uplatnenie v medicíněako liek pri širokej škále virusových i nádorových ochoreni.

Claims (1)

1. PŘED MET VYNALEZU 230 114 spdsob přípravy leukocytárneho interferčnu vyznačujúci satým, že leukocytárne koncentráty sa podrobia dvojnásobné] erytrolýzcchloridom am&nnym, získané leukocyty sa premyjú fyziologickýmroztokom a suspendujú v kultivačnom médiu, potom sa infikujúvírusom wevicastelskej choroby a inkubujú 8 až 24 h pri 37 °c,čím sa získá surový interferón, z ktorého sa tuhé nečistotyodcentrifugujú, na dobu 48 až 72 h sa okyselí kyselinou chloro-vodíkovou na ΡΗ2, potom sa konceVruje dvojnásobným zrážanímrodanidom draselným a napokon sa purifikuje gélovou filtrácioucez modifikovaný sieťovaný dextran, pričom frakcia elučnýchkonštánt kqv O,lig až 0,65 sa znovu skoncentruje rodanidom dra-selným, zvyšky rodanidu sa oddialyzujú a preparát sa zlyof ilizuj e, 5»