CS225134B2 - Způsob SiStSní komerčního nebo surového inzulínu - Google Patents

Abstract

Aplikuje-li se vodný roztok komerčního nebo surového inzulínu o pH 6 až 10 na sloupec aniontoměniče a poté se sloupec eluuje ve frakcích s vodou mísitelným alifatickým Cf-Co-alkanolem a jímají-li ae frakce vykazující eaenciálne jedinou složku (při analýze pomocí D1SC PAGE), získá ee Inzulín prosty pankreatlckýeh bílkovin o molekulová hmotnosti vySSÍ, než je molekulová hmotnost inzulínu, a prostý antigenních nečistot podobných inzulínu o přibližní téže molekulové hmotnosti jakou má inzulín. Uvedený s vodou mjlsitelny alkanol obsahuje vodu v množství 20 až 70 % objemových a má pH 6 až 10.

Description

Vynález se týká způsobu Slátání komerčního nebo surového inzulínu pro jeho zbavení pankreatickýeh bílkovin o molekulová hmotnosti vyšší než je molekulová hmotnost inzulínu, totiž nad 6 000, i antigenních inzulínu podobných neSiatot o přibližně táže molekulová hmotnosti jako má inzulín, aplikací k Slátání určeného inzulínu na sloupce mániSe,aniontů.

Britský patentní spis č. 1 285 023 popisuje injekční inzulínový přípravek s obsahem inzulínu získaného ze slinivek břiáníoh, rozpuátěného nebo suspendovaného ve vodném injekčním médiu, přičemž inzulín je prost bílkovin pankreatického původu o molekulové hmotnosti nad 6 000 a vykazuje v podstatě jedinou složku při analýze jeho roztoku polyakrylamidovou gelovou elektroforézou (tzv. metoda Disc Pege).

Jako výchozího materiálu při čištění inzulínu se obvykle používá komerčního inzulínu, tj. amorfního inzulínu nebo krystalického inzulínu, který může být několikrát překryštelován. Lze váak rovněž používat surového inzulínu, například koláče,solí, obsahujícího inzulín, jenž vzniká při izolaci inzulínu z pankreatickýeh žláz a obvykle obsahuje 10 až 31 % hmotnostních inzulínu, avšak pro vysoký obsah nečistot je tento materiál méně vhodný pro způsob .Siátšní podle vynálezu. Lepši výchozí materiál lze získat zpracováním roztoku koláče solí isoelektrickým srážením nastavením hodnoty pH roztoku na 5,5 a izolací sraženiny odstředěním.

Původně panoval obecný názor, že vhodně překrystalovaný inzulín ve formě romboedrů s ostrými hranami, spojených s rovnými krystalovými plochami, představuje čistou bílkovinu, inzulín, jehož konfigurace byla určena Sangerem se sp., viz například Biochemical Journal 60 (1955), 556. Později váak bylo nalezeno, že tomu tak není. Vědecká analytická zkoumání ukázala, že zmíněný krystalický inzulín obsahuje bílkoviny pankreatického původu s molekulární hmotností vyáái než má čistý inzulín a kromě toho látky podobná inzulínu přibližně stejné molekulové hmotnosti jakou má čistý inzulín (asi 6 000).

Bylo dokázáno, že krystalický inzulín rozpuštěný v 1 M kyselině octové lze frakcionovat ve složky (a), (b) a popřípadě (c), gelovou filtrací na koloně Sephadexu 0-50 (Sephadex je chráněná známka), což je dextren zesítěný epichlorhydrinem s limitem penetrace asi 10 000 (minimální molekulová hmotnost vylučovaná látky), který je ve-formě zrn (průměr 20 až 80 mikronů). Tyto tři složky lze izolovat obvyklými způsoby z jejich roztoků, například vysolením, srážením zinečnatou solí při neutrální reakcí, lyofilizací apod. Obě složky (a) a (b) obsahují bílkoviny pankreatického původu a molekulární hmotností vyěěí než 6 000, zatímco složka (c) obsahuje čistý inzulín kontaminovaný bílkovinami podobnými inzulínu, přibližně stejné molekulární hmotnosti jakou má čistý inzulín.

Množství složky (a) může tvořit 2 až 5 % hmotnostních krystalovaného inzulínu a méně než 1 % hmotnostní překrystalovaného inzulínu. Množství složky (b) může činit v obou případech 4 až 8 % hmotnostních a množství bílkovin podobných inzulínu ve složce (o) může činit 5 až 13 % hmotnostních ve složce (c).

Imunologická pokusy provedená na zvířatech, která tvořily základ tohoto vynálezu prokázaly, že výše uvedená složky (a) a (b) a do určitá míry bílkoviny podobná Inzulínu přítomné ve složce (c) jsou v podstatě odpovědné za antlgenní vlastnosti dosud známých inzulínových preparátů.

Účelem vynálezu je odstranit jednoduchým a účinným způsobem nečiatoty obsažená nejenom v surovém inzulínu, ale zejména v komerčním inzulínu tak, že čištěný inzulín nevykazuje žádnou nebo podstatně sníženou antigenicitu, protože neobsahuje ani Vysokomolekulární bílkoviny a ani antigenní látky podobná inzulínu.

Podstata vynálezu způsobu čištění komerčního nebo surového Inzulínu pro jeho zbavení pankreatickýeh bílkovin o molekulové hmotnosti nad 6 000 a podobných nečistot pomoci sloupcové chromatografie spočívá v tom, že jako vodného roztoku inzulínu, který má být čištěn,

225,34 se používá roztoku o hodnotě pH v rozsahu 6 až 10, ze sloupce se frakce vymývají alifatickým alkanolem (o 1 až 3 uhlíkových atomech v molekule) mlsitelným s vodou, ktorý obsahuje vodu v množství 20 až 70 % objemových, výhodně 30 až 50 %, objemových a který má hodnotu pH v rozsahu 6 až 10, výhodně 6,5 až 8,5, jímá se nebo jímají ee frakce eluétu vykazující při analýze pomocí elektroforézy na polyakrylamidovém gelu (DISC PAGE) esenciálně jedinou složku, a inzulín takto vyčištěný se izoluje ze zjímané frakce nebo ze zjímaných frakcí.

Je výhodné jako měniče aniontů používat, silně bazického měniče aniontů

Pro analytické účely byla již použita diskontinuáíní alektroforéza na polyakrylamidovém gelu, rovněž v souvislosti » krystalickým inzulínem. Teto specifická gelová «slekirOforéza byla vyvinuta B, J, Daviaem a L. Oraateiítea » je popsána v Asm. M. X, Aead. Sci. W, str. 321 až 349 a 474 až 427 (1964). V tomto případě se ve spodním gelu používá 7,58 polyakrylamidu, který obsahuje 8 U močovinu a aá hodnotu pH aai 3/?, zatímco vr-chní gel a nanáěený roztok inzulínu, obsahující aul 0,1 mg tasulinu, obsahují rovněž 8 U močovinu.

Je· nejenom překvapující_} Se podle -vynálezu lze odvtreňovat vysokomolekulái-ní bílkoviny, je věak rovněž překvapující, 'že diskontinuáíní elektroforézy na pdyekřylemidovém gelu lze používat jek? kritéria nepřitemnosti těchto bílkovin, nehol je známo, Se použiti tohoto analytického způsobu v souvislosti s komerčním itutilínsm poskytuje inzulínový pda obsahující vysokomolekulámí bílkovinu, dimer, .viz. například článek Steinera ě spol,. v Diabetes, 17. stí·» 728, sloupec vpravo.

Déle nemohlo být očekáváno, že použité eluční činidlo by mohlo být schopné vytvářet takový monomerizBční efekt u přítomných bílkovin, aby byla možná separace látek podobných inzulínu.

Měniče aniontů, které by měly být s výhodou silně bazického typu, používané při způsobu podle vynálezu, jsou známé. Příklady slabě bazických měničů aniontů jsou Bio-Oel UM, vyráběný na bázi polyakrylamidů, DEAE-Sephadex, vyráběný ze sírovaných dextranů a DBAE-celulóza, vyráběná z celulózy. Příklady silně bezickýeh měničů aniontů jsou Dowery (Dovex je chráněné známka), vyráběné z polystyrénů a QAE-Sephadex, x.r.váběný se zesilovaných dextranů.

Příklady vodu obsahujících s vodou mísitelných organických «lučních rozpouštědel jsou tetrametylmočovina, dimetylformamid, dloxan, s vodou mísitelné ketony, například aceton, a alkanoly, například metanol, etanol-a propanoly. Alkanoly představují výhodná organická eluční rozpouštědla pro použití při způsobu podle vynálezu a používají se s výhodou ve formě, která obsahuje od 30 do 50 % objemových vody.

Eluční činidlo obsahuje vždy pufrační látku pro kontrolu hodnoty pH «lučního Činidle. Je výhodné provádět způsob podle vynálezu při stélé hodnotě pH. Hodnota pH eluSního činidla by měle být udržována v rozmezí od 6,5 do 8,5, měřeno skleněnou élektrcdou, nastavenou obvyklým způsobem na standardní pufr.

Vhodné pufry lze nalézt v dostupné literatuře.

Zásadní význam má konstantní teplota během výměny iontů. Τορ.>.οΐ,υ. lze v ulit v rozmzzí od -10 °C do 40 °C, s výhodou od 0 °C až do 30 °C. fliětěný inzulín z jímttsýssh frakcí lze izolovat obvyklým způsobem, například odpařením, vysolením nebo srážením v «aao-fní nebe krystalické formě v přítomnosti lontů zinku.

Při izolaci Inzulínu je známo podrobit kyselé nebo neutralizované alkoholické extrakty z pankreatu Bloupcové chromatografie na měniči kationtů, například na kavboxymetylcelulóze (francouzský patentní spis 2. 1 499 126), sulfonovazých pryskyřicích syntetizovaných z kopolymeru styrenu a divinylbenzenu (britský patentní spis 2. 1 054 523) nebo na měniči aniontů, například aa dietylaminoetylcelulóze (britský patentní spis 2. 931 954). AvSak inzulín získaný těmito způsoby obsahuje nečistoty stejně jako krystalický inzulín získaný obvyklými izolačními způsoby včetně opakovaného srážení surových roztoků inzulínu vysolováním chloridem sodným.

Z britského patentního spisu č. 881 855 je rovněž známé sloupcová chromatografie nespecifikovaného zink-inzulínu na měniči kationtů Dowex 50-XI (eulfonovaný styren_Tdivinylový kopolymer v zrněné formě) za použití vodného etanolu jako elučního činidla, avěak i když se jako výchozího materiálu použije překryštelovaného inzulínu, izolovaný inzulín obsahuje většinou tytéž nečistoty jako výchozí materiál, protože se jímají všechny frakce obsahující inzulín a nikoliv specifické frakce obsahující inzulín, které vykazují jedinou složku pomocí metody CISC PAGE.

Z britského patentního spisu č. 913 042 je dále známo čištění krystalického inzulínu ve směsi s amorfními nebo cizími mikrokrystalickými materiály promýváním nečistého krystalizátu vodným roztokem, jehož hodnota pH je udržována od 3,8 do 4,3 pomocí slabé kyseliny nebo směsi pufrů. Tento stupeň čištění však neodstraňuje takové nečistoty jako proinzulín, dimer nebo jeho intermediát.

Konečně z britského patentového spisu č. 871 541 je známá sloupcová chromatografie šestkrát krystalovaného inzulínu a inzulínu čištěného jak je popsáno Lensem (Biochem. et Biophys. Acta (1948) 2, 76] na styren-divinylbenzenovém kopolymerovém měniči kationtů na netečném zřeňovadle s velkým povrchem, avšak inzulín obsahuje po této chromatografii ještě nečistoty, například proinzulín, dimer a intermediát spolu s arginin-inzulínem a monodesaminoinzulínem, protože přítomnost těchto nečistot nezabraňuje tomu, aby chromatogram nevzbuzoval dojem, že materiál eluovaný z kolony je v podstatě homogenní.

Vynález je ilustrován následujícími příklady»

Příklady provedení ť ř í k 1 a d 1

Připraví se pufr tohoto složení:

0,1 M roztok chloridu amonného

0,02 14 roztok amoniaku

60% etanol (obj./obj.)

Hodnota pH je 8,3 při 25 °C.

g měniče aniontů Dowex 1 x 2 (oka: 50/100) se nechá nabobtnat v pufru a nejjemnější částice se odstraní dekantací. Materiálu se použije k naplnění kolony o průměru 1,6 cm a výšce 25 om. Kolona se ekvilibruje pufrem. Dowex 1 x 2 je kopolymer styrenu s 2 % divinylbenzenu, jenž obsahuje jako funkční skupiny benzyltrimetylamoniové skupiny a je v zrněné formě.

500 mg inzulínu, jednou krystalovaného z citrátového pufru, se rozpustí ve směsi 20 mg dvojsodné soli kyseliny etylendiamintetraoctové, 5 ml pufru, 5 ml 60% (obj./obj.) etanolu a 0,04 ml 15,3 M roztoku amoniaku (konečná hodnota pH 8,5). Nerozpustný materiál se odstraní odstředěním a čirý roztok se nanese na kolonu. Vymývání se provádí pufrem při teplotě 25 °C a rychlostí 7,5 ml/h. Jímají se frakce po 5 ml.

Měří se hodnoty extinkce při 276 nm a vynášejí se proti číslům frakcí. Frakce odpovídající střední hlavní části inzulínového maxima (největší maximum), která elekťroforézou na polyakrylamidovém gelu (tzv. DISC PAGE) vykázala esenciálně jedinou komponentu, se smísí a inzulín se sráží přidáním 100 ml vody, 1,3 ml 1 N roztoku kyseliny chlorovodíkové a 2 ml

225Ί34

N roztoku octanu zinečnatého na 100 ml spojených frakcí. Sraženina se izoluje odstředěním a krystaluje známým způsobem ze směsi aceton-citrétový pufr. Výtěžek čištěného inzulínu je 200 mg.

Příkl, ad 2

Připrnví se pufr tohoto složení:

25,0 g tris(hydroxymetyl)aminometanu 29,0 ml 6 N roztok kyseliny chlorovodíkové

1,2 litru metanolu

Voda k doplnění celkového objemu na 2 litry. Hodnota pH je 7,3‘při 25 °C.

g měniče aniontů QAE-Sephadex A-25 se nechá nabobtnat v pufru a nejjemnější částice se odstraní dekantací. Materiálu se použije k naplnění kolony o průměru 2,5 cm a výšce 25 cm. Kolona se ekvilibruje pufrem. QAE-Sephadex A-25 je dextran zesítěný epichlorhydrinem s limitem penetrace asi 5 000 (minimální molekulové hmotnost vyloučených látek), jenž má jako funkční skupiny dietyl-(2-hydroxypropyl)-aminoetylskupiny, je v zrněné formě (průměr 40 až 120 mikronů).

- 500 mg inzulínu krystalovaného jednou z citrátového pufru se rozpustí ve směsi 25 mg dvojscdné soli kyseliny etyléndiamintetraoctové, 94 mg tris(hydroxymetyl)aminometanu, ml 60% metanolu (obj./obj.) a 0,073 ml 6 N roztoku kyseliny chlorovodíkové (konečná hodnota pH 7,3). Nerozpustný materiál se odstraní odstředěním a čirý roztok se nanese na kolonu. Vymývání se provádí pufrem při teplotě 25 °C a rychlostí 30 ml/h. Jímají se frakce po 5 ml. Extinkce se měří při 276 nm a vynáší proti číslům frakcí. Frakce odpovídající střední hlavní části inzulínového maxima (největší maximum), která elektroforézou na polyakrylamidovém gelu (tzv. DISC PASE) vykázala.esenciálně jedinou komponentu, se smísí a Inzulín se sráží přidáním 100 ml vody a 2 ml 1 N roztoku octanu zinečnatého na 1 00 ml spojených frakcí. Sraženina se izoluje známým způsobem odstředěním a krystaluje ze směsi aceton-citrétový pufr. Výtěžek čištěného inzulínu je 250 mg.

Příklad 3

Připraví se pufr tohoto složení:

0,06 M tris(hydroxymetyl)aminometanu

0,02 M roztok kyseliny chlorovodíkové

0,075 M roztok chloridu sodného % etanol (obj./obj.)

Hodnota pH je 8,3 při 25 °C.

g měniče aniontu uvedeného v příkladu 2 se nechá nabobtnat v pufru a nejjemnější částice se odstraní dekantací. Materiál se použije k naplněni kolony o průměru 2,5 cm a výšce 50 cm. Kolona se ekvilibruje pufrem,

2,5 g inzulínu krystalovaného jednou z citrátového pufru se rozpustí při teplotě 0 °C ve směsi 450 mg tris(hydroxymetyl)eniinometanu, 100 mg čtyřsodné soli kyseliny etyléndiamintetraoctové, 25 ml pufru, 25 ml 6056 etanolu (obj./obj.) a 0,08 ml 4 N roztoku kyseliny chlorovodíkové (konečné hodnota pH při 25 °C je 8,4). Nerozpustný materiál se odstraní odstředěním při teplotě 2 až 4 °C a čirý filtrát se nanese na kolonu. Vymývání se provádí pufrem při teplotě 4 °C a rychlostí 26 ml/h. Jímají se frakce po 20 al.

te

Extinkce se měří při 276 nm a vynááí proti číslům frakcí. Frakce odpovídající střední hlavní části inzulínového maxima (největSÍ maximum), která elektroforézou na polyakrylamidovém gelu (tzv. DISC FAGE) vykázala esenciálně jedinou komponentu, se smísí a inzulín se sráží přidáním stejného objemu 0,02 M roztoku octanu zinečnatého, 0,03 N roztoku kyseliny chlorovodíkové. Sraženina se izoluje odstředěním a krystaluje ze směsi acetoncitráíový pufr známým způsobem. .

Výtěžek čištěného inzulínu je 1,3 g.

Příklad 4

Připraví se pufr následujícího složení:

14,9 g hydrochloridů histidinu

38,7 ml 1 N roztoku hydroxidu sodného

16,1 g chloridu sodného 3,12 litrů 96% etanolu (obj./obj.)

Voda k doplněni celkového objemu 5 litrů. Hodnota pH při teplotě 25 °C je 6,5.

g měniče aniontů uvedeného v příkladu 2 se nechá nabobtnat. v pufru a nejjemnSjší částice se odstraní dekantacl. Materiálu se použije k naplnění kolony průměru 2,5 cm a výšky 25 cm. Kolona se ekvilibruje pufrem.

500 mg inzulínu jednou krystalovaného z nitrátového pufru se rozpustí ve směsi 20 mg dvojsodné soli kyseliny etyléndiamintetraoctové, 6,5 ml pufru a 6 ml 60% etanolu (obj. na objem), přičemž hodnota pH se nastaví na 6,8 přidáním 1 N roztoku hydroxidu sodného. Nerozpustný materiál se odstraní odstředěním a čirý roztok se nanese na kolonu. Vymýváni se provádí pufrem při teplotě 27 °C a rychlostí 30 ml/h. Jímají se frakce po 5 ml.

Extinkce se měří při 276 nm a vynáší proti číslům frakcí. Frakae odpovídající střední hlavní části inzulínového maxima (největší maximum), které elektroforézou na pólyakry 1amidovém gelu (tzv. DISC PAGE) vykázala esenciálně jedinou komponentu, se smísí a inzulín

J ee aréží přidáním stejného objemu 0,02 κ roztoku octnou zinečnatého. Sraženina se izoluje odstředěním a krystaluje ze směsi aceton-oitrétový pufr známým způsobem. Výtěžek čištěného ΐ ' inzulínu je 210 mg.

Příklad. 5

Připraví se pufr tohoto složení:

i ,25 kg trieíhydroxymetyljeainometeEfttt

725 ml 12,3 N roztoku kyseliny chlorovodíkové

62,4 litrů 96% etanolu (obj./obj,)

Voda k doplnění celkového objemu na 100 litrů. Hodnota pH při teplotě 25 °C je 7,3.

1,3 kg měniče aniontů uvedeného v příkladu 2 »e nechá nabobtnat v pufru a nejjemnější Sástice se odstraní dekantací. Materiál se použije k. naplněni kolony průměru 15 cm a výšky í5 čni. Kolona se ekvilibruje pufrem.

g překrystalovaného vepřového nebo hovězího inzulínu, obsahujícího 0,4 % zinku, :e rozpustí ve směsi 0,72 g dvojsodné soli kyseliny etylé-ndiaaintetraoctová, 10,2 g tris;hydroxymetyl)aminometanu a 720 ml 60% etanolu (obj./obj.). Nerozpustný materiál se odstraní odstředěním. K čirému roztoku se přidá 10,7 ml 6 N roztoku kyseliny chlorovodíkové

Ί 225134 a roztok se nanese na kolonu, Vymývání se provéčí pufrem při teplotě 25 °C a rychlostí 1,2 litr/h. Jímají se frakce po 0,5 litru.

Extinkce se měří při 276 nm (Egyg) ^a vynášejí proti číslům frakcí. Frakce odpovídající střední hlavní Sásti inzulínového maxima (největší maximum), která elektroforázou na polyakrylamidovém gelu (tzv. LISC PAGE) vykázala esenciálně jedinou komponentu, se spojí. Inzulín se sráží ze spojených frakci přidáním stejného objemu 0,02 M roztoku octanu zinečnatého. Sraženina se izoluje odstředěním a krystaluje ze směsi aceton-citrátový pufr známým způsobem.

Získá se 8,2 g čištěného inzulínu. Inzulín se překrystaluje z pufru následujícího složení:

2,0 inzulínu

0,8 % Zn⁺⁺ (ve formě chloridu) vztaženo na hmotnost inzulínu

0,1 U roztok octanu sodného

7,0 % chloridu sodného

Kyselina chlorovodíková do hodnoty pH 5,45 až 5,55.

Inzulín se rozpustí ve vodě obsahující kyselinu chlorovodíkovou a chlorid zinečnatý, načež se přidá roztok obsahující příslušné množství octanu sodného a chloridu sodného. Krystalizace se provádí za mechanického mícháni při teplotě místnosti. Krystalizace je skončena během jednoho nebo dvou dnů. Inzulín se izoluje filtraci, promyje vodou a suší ve vakuu. Výtěžek je 8,0 g.

Čištěného inzulínu lze.používat pro přípravu všech druhů farmaceutických inzulínových přípravků pro klinické použití.

Claims (4)

1. Způsob čištění komerčního nebo surového inzulínu pro jeho zbavení pankreatických · bílkovin o molekulové hmotnosti vyšěí než je molekulová hmotnost inzulínu, totiž nad 6 000, i antigenních inzulínu podobných nečistot o přibližně téže molekulové hmotnosti jako má inzulín, aplikací k čiětění určeného inzulínu na sloupec měniče aniontů vyznačující se tím, že jako vodného roztoku inzulínu, který má být čiětěn, se používá roztoku o hodnotě pH v rozsahu 6 až 10, ze sloupce se frakce vymývají alifatickým C,-Cy-alkanolem misitelným s vodou, který obsahuje vodu v množství 20 až 70 % obj. a který má hodnotu pH v rozsahu 6 až 10, jímá se nebo jímají se frakce eluátu vykazující při analýze pomocí elektroforézy na polyakrylamidovém gelu (DISC PAGE) esenciálně jedinou složku, a inzulín takto vyčištěný se izoluje ze zjímané frakce nebo ze zjímaných frakcí.

2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se jako elunetu používá s vodou mísitelného 0,-Cyalkanolu obsahujícího 30 až 50 % objemových vody.

3. Způsob podle bodu 1 nebo 2, vyznačující se tím, že se používá elunetu o hodnotě pH 6,5 až 8,5.

4. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že jako měniče aniontů se používá silně bázického měniče aniontů.