CS218182B1 - Sposob žirenia konverznýťh zmesi pri biosyntetických výrobách - Google Patents

Description

2

Vynález sa týká spósobu čírenia konverz-ných zmesí pri biosyntetických výrobách. Výroba mnohých látok používaných najmav potravinárskom, farmaceutickom a inýchodvetviach priemyslu je možná len biosyn-tézou., V skutočnosti je každý biologický pro-ces sledom enzymatických reakcií, pri kto-rých z východzích substrátov vznikajú a izo-lujú sa požadované produkty. Takto je napr.možné previesť pri výrobě kyseliny askor-bovej sorbit na sorbózu, kyselinu fumarovúna kyselinu asparágovú, 6-azauracil na 6-aza-uracilribozid, sacharózu na kyselinu glukó-novú a získavať kyselinu 6-aminopeniciláno-vú zo solí penicilínov. Příprava týchto látok sa realizuje v pod-statě tak, že sa připraví kultura biologickyaktívneho materiálu a po odseparovaní fer-mentačného média sa použije na enzymatic-ká konverziu. V niektorých prípadoch však nie je anipotřebné biologicky aktívnu kul túru z fer-mentačného média separovat, konverzia sarobí přidáním Substrátu k enzymaticky aktív-nej kul túře počas fermentácíe. V poslednom čase sa tieto procesy sústavnezdokonalujú. Dokazom je tá skutočnosť, žešá ná enzymatické konverzie čoraz viac po-užívá jú postupy, pri ktorých sa enzým izolujez buniek producenta a 'naviaže sa na vhodnýnosič. Takéto postupy sú však nákladné. Eko-nomicky výhodnejšie sú tie procesy pri kto-rých sa enzým ineizoluje, ale buňky produ-centa sa naviažu ria vhodný anorganický,organický alebo prírodňý nosič. Takto při-pravený biokatalyzátor sa použije na enzy-matická konverziu. V CSSR sa realizuje priemyslová výrobakyseliny 6-amiriopenicilánovej (ďalej len 6--APK) a kyseliny L-asparágovej enzymatic-kou cestou. Postupuje sa tak, že sa enzýmz kultúry producenta neizolu je. Na enzyma-tická konverziu sa pouzí vajú buď samostat-né buňky, v ktorých je enzým viazaný pomo-cou chemických činidiel, alebo nativně buňkyzabudované vo vhodnom nosiči. Výhoda tých-to postupov je v tom, že takto připravenébiokatalyzátory sa móžu používat na enzy-matické reakcie opakované, čo značné zhos-podárňuje výrobný proces.

Nedostatok týchto postupov spočívá v tom,že sa buňky pri opakovanom používaní ná-sledkom mechanických operácií porušujú,připadne sa uvolňujú zo zabudovaného no-siča. Po odsepa,rovní podstatnej časti bioka-talyzátora vznikne disperzný systém s velmijemnými čiastočkami. Ich velkost sa pohy-buje v rozmedzí 0,1—1 μη\. Takýto systémnie je možné vyčíriť na bežne používanýchkontinuálně pracujúcich odstředivkách.Vzhladom na to, že v niektorých prípadochnapr. pri enzymatickej prípraye 6-APK jevýsledný produkt enzymatickej reakcie vovodných roztokoch málo stahilný, musí sapočas izolácie spracovávať rýchlo. V takýchtoprípadoch nie je vobec možné použit na čí-reinie klasické filtračně zairiadenia ako napr. nuče, tlakové alebo vákuové filtre. Filtračnědošky, připadne pomocná filtračná hmota sarýchlo zanesie malými čiastočkami, rýchlosťfiltrácie sa spomafuje až klesne na nulu. Ďalšia nevýhoda spočívá v tom, že ak jekonverzná zrnes po enzymatickej reakcii za-kalená, zhoršuje v mnohých prípadoch izo-láciu a kvalitu výsledných produktov. Taknapr. pri výrobě 6-APK pri terajšom spó-sobe výroby, bývá konečný produkt v róznejmiere znečistěný fragmeňtami buniek, príp.celými buňkami. Tieto nie je možné odstrániťz krystalu ani viacnásobným premývaním.Pri konverzii 6-APK na polosyntetické peni-cilíny móžu tieto čiastočky v konečnom dó-sledku ovplyvniť výťažnosť a kvalitu koneč-nej liekovej formy.

Podobné problémy inastávajú aj pri ostat-ných biosyntetických výrobách.

Pokusmi sme ověřili, že v takýchto prípa-doch je možné získat číře roztoky, ak po se-parácii biokatalyzátora sa ku kvapaline přidámalé množstvo polyelektrolytu.

Polyelektrolyty ako je známe, sú lineárněalebo rozvětvené polyméry s vysokým poly-merizačným stupňom. Ich charakteristickouvlastnosťou je velmi dobrá rozpustnost vovodě. Už v nízkých koncentráciách tvoriaviskózne roztoky. V roztoku tieto polymérydisociujú ako dlhé vlákna o dížke niekofkodesiatok pm. Rozhodujúci význam pre cha-rakter organických polyelektrolytov má po-vaha aktívnych skupin, ktoré sú naviazanéna polyměrnom reťazci. N.ajbežnejšie sa vy-skytuju skupiny neionické (-CÓNH2), anio-nické (-CÓOH), alebo kationické {-NH2,-NH-)a pod. Účinky organických polyelektrolytov pod-mieňujú hlavně tieto dva faktory: — naviazahie rózinych častí dlhého reťazcamakromolekuly na čiastočky disperznéhosystému Wan der Waalsovými silami, čímsa tieto čiastočky premostia, za tvorbyváčších častíc s vysokou pórovitosťou —flokúl. Tieto flokuly potom 1’ahšie sedi-mehtujú, čím dochádza k čirému disperz-ného· systému. — elektrický náboj funkčných skupin po-lyméru pomáhá zvyšovat jeho rozpust-nost a výrazné ovplyvňujé tvar molekulyv roztoku. Tým sa napomáhá tvoreniumostíkov časticami. Významnější je všakúčin ok elektricky nabitých .funkčnýchskupin na elektricky 'nabité částice poly-disperzného systému. Pomáhajú neutrali-zovat náboj týchto častíc a tým urýchlujúflokuláciu a sedimentáciu. Výhoda navrhovaných polyelektrolytovspočívá v tom, že ich možno použit v širokomteplotnom rozmedzí. pH sústavy počas reak-cie sa móže pohybovat od silné kyslej, až pomieme alkalickú. Pósobia už v nepatrnýchkoncentráciách. Je potřebné aby sa přidávaliv dostatočne zriedenom vodnom roztoku. Naj-výhodnejšie sú roztoky, v ktorých je kon-centrácia polyelektrolytu 0,1—0,25 %-ná.Takto zriedené roztoky sú však málo stabil-

I né. Ich životnost je maximálně 24 hodin. Ztohoto dóvodu je potřebné připravovat si zá-sobný roztok o koncentrácii 0,5—1 % a tentopřed upotřebením nariediť. Z dostupných odskúšaných polyelektroly-tov sa nám pri riešení tohoto problému naj-lepšie osvědčili katioiniaktívine príp. anioaktív-ne polyelektrolyty vyrábané na báze poly-etylénímínu a polyakrylajnidu.

Tieto reagujú a fragmentami buniek, príp.s celými buňkami biokatalyzátor a. Vznikajúflokuly, ktoré sú niekolkonásobne váčšie nežfragmenty buniek a preto je na vyčírenietakto upraveného systému možné použit běž-né filtračně zariadenia.

Princip námi navrhovaného postupu spo-čívá v tom, že k reakčnej zmesi po predchá-dzajúcej separácii biokatalyzátory sa po prí-padnej úpravě pH přidá predpísané množstvopolyelektrolytu. Sústava sa krátko premiešaa nechá v pokoji tak dlho kým systém vyflo-kuluje. Potom sa pevný podiel separuje navhodnom separačnom alebo filtračnom zaria-dení. Výhoda tohto postupu spočívá v tom, žesa získá úplné číry filtrát. Takýmto spóso-bom je možné bez váčších nákladov (surovi-nových a investičných) Standardizovat napr.výrobu 6-APK, kyseliny asparágovej a inýchduktov chemických reakcií.

Zlepšia sa tým podmienky kryštalizácie,produkty sú úplné biele a bez akýchkotvekpříměsí buňkových fragmentov. Vytvoria salepšie podmienky pre konverziu 6-APK napolosyntetické penicilíny, príp. kys. aspará-govej na umělé sladidlo. Táto skutočnosť po-zitivně ovplyvní aj výťažnosť výsledných pro-duktov reakcií.

Spósob realizácie bližšie objasňujeme naviacerých príkladoch. Příklad 1 200 ml konverznej zmesi o obsahu 36,6g . I'1 6-APK sa upraví s H2SO4 na pH 6,5.Přidá sa 0,2 ml roztoku Sedipuru CL 930o koncentrácii 5 g . I"1 (výrobca firma BASF-Ludwigshafen NSR). Sústava sa krátko pre-mieša a nechá stát v pokoji 15 minút. Potomsa filtruje vákuové za pomoci filtračnej hmo-ty — kremeliny. K vyčírenému filtrátu sa při-kládá 50 ml butylacetátu a zmes sa ochladína 5 °C. pH sa upraví pomocou H2SO/, na 4,2.Krystalizuje 2 hod. za chladenia a občasnéhopremiešavania. Získainý kryštál sa oddělí,premyje rozsuspendovaním striedavo v schla-denej vodě a acetone. Suší sa 2 hodiny pri40 °C vo vákuovej sušiarni. Získá sa 5,8 g6-APK, čo představuje 79,23 %-nú výtažnosť.Příklad 2 300 ml zmesi, ktorá obsahuje 16,5 g.l16-APK sa upraví pH na 8,0. Přidá sa k nej 1.5 ml roztoku Magnaflocu 155 (vyrába fir- ma Állied Colloids — Ánglla) koncentrácia 2.5 g. I’1, dókladne sa premieša a nechá v po- koji 10 min. Tekutina sa potom rovnoměrněrozdělí do kyviet a vyčíri na laboratórnej od-stredivke pri 4000 obr./min. Úplné číry su-pernatant sa kvantitativné vpraví do banky.Zahustí sa na vákuovom rotačnom odparo-vacom zariadení pri 40 °C na 150 ml. Dalšípostup získania kryštálu je rovnaký akov příklade 1. Získá sa 3,46 g bieleho kryštálu6-APK. Výťažnosť pokusu je 69,9%-tná.Příklad 3 200 litrov roztoku 6-APK o koncentrácii36,2 g . I1 sa upraví na pH 6,4 s H2SO4. Přidása 0,5 litra sedipuru CF 900 (vyrába firmaBASF — NSR), o koncentrácii 2,5 g . Γ*.

Roztok sa mieša 5 minút a nato ponecháv pokoji 15 minút. Sústava sa sfiltruje narotačnom vákuovom filtrů za pomoci kreme-liny. Úplné číry filtrát sa ochladí na teplotu5 °C, přidá sa k němu 60 litrov butylacetátua za miešania sa upraví pH na hodnotu 4,2 gomocou kyseliny sírovej o konc. 250 g. I'1. alší postup je rovnaký ako v příklade 1.Získá sa 5780 g bieleho kryštálu 6-APK o čis-totě 98,4 %. Obsah rozkladných látok je0,64%. Příklad 4 1800 litrov konverznej zmesi, ktorá obsa-huje 33,5 g . I’1 6-APK, po oddělení biokata-lýzátora sa upraví na pH 6,7 kyselinou sí-rovou o konc. 250 g. I1. K tomuto roztokusa přidá 10 litrov vodného roztoku PraestoluA 751 (vyrába Chemische Fabrik Stockhau-áén — NSR) o koncentrácii 2,5 g. I"1. Zmessa dókladne mieša 5 minút a 15 minút sa ne-chá stát.’ Potom sa filtruje cez tlakový filters azbestocelulózovými filtračnými doskami.Získá sa číry filtrát, priepustnosť ktorého me-raná na spektrofotometr! Specol pri vlnovejdížke 510 nm je 98,0 %. Filtrát sa ďalej spra-eováva obvyklým spósobom. Získá sa 54,5kg 6-APK, čo odpovedá výtažku 79,8 %. Pro-dukt je bielej farby s obsahom 6-APK 97,5 %.Óbsah rozkladných produktov je 0,57%.Příklad 5 Z 2000 litrov konverznej zmesi, ktorá ob-sahuje 150 g. I'1 kyseliny asparágovej sa od-stráni biokatalyzátor na separátore BRPX —213 Alfa-Laval. pH filtrátu sa upraví s H2SO4o konc. 400 g . I1 na 5,8. Přidá , sa k němu 20lit. roztoku sedipuru CF 900 (vyrába BASF— NSR) o konc. 1,25 g . l t Dókladne sa rozmieša a nechá stát 30 mi-nút. Filtruje sa na vákuovej nuči cez pomoc-nú filtračnú hmotu napr. kremelinu. Círyfiltrát sa upraví na pH 2,8 pomocou roztokukyseliny sírovej o konc. 400 g. I’1. Nechá sakrystalizovat pri zníženej teplote 2 hodiny.Kryštál sa separuje na bubnovej odstredivke.Premýva sa 2X chladenou H2Ó a IX chla-deným etanolom. Získá sa 278,6 kg kys. aspa-rágovej o čistotě 98,5 %.

Claims (1)

1. Příklad 6 Z 200.0 litrov konverznej zmesi, ktorá ob-sahuje 36,5 g . I'1 6-APK sa oddělí biokata-lyzátor na separátore BRPX 213 Alfa-Laval.pH tekutiny sa upraví na 6,6 kyselinou síro-vou. K sústave sa přidá 8 lit. sedipuru CL030 o koncentrácii 2,5 g. I1. Dókladne sa pre- miešaa nechá stáť 20 min. Potom sa sústavaseparuje na kontinuálnej odstredivke AX 213Alfa-Lavál. Círy filtrát sa dfalej spracovávaobvyklým postupom. Dosiahne sa 80,8 %-nejvýťažnosti. Obsah účinnej látky v získanompreparáte je 97,4 %-ný; obsah rozkladnýchproduktoý je 0,74 %. PREDMET VYNALEZU Spósob čírenia konverznýčh zmesí pri bio-syntetických výrobách vyznačujúci sa tým,že disperzný systém sa flokúluje přísadoukationaktívnych príp. anioinaktívnych poly-elektrolytov na báze polyetyléniminov alebo polyakrylamidov, přidávaných vo formě roz-toku vo vodě, v množstve 1 až 100 mg.V1,s výhodou 12,0 mg . V1, pri teplote 0 až 50 °Ca pri pH 1 až 9. Vytlačili TSNP, n. p., Martin Cena Kčs 2,40