CS215941B1 - Heparin imobiliaovaný na hydroxyalkylakrylátových a hydroxyalkylmethakrylátových nosičích a způsob jeho výroby - Google Patents

Abstract

Heparin imobilizovaný na hydroxyalkylakrylátovýoh a hydroxyalkylmethakrylátových nosičích jako sorbent plasmatických bílkovin, koagulačních faktorů, enzymů, inhibitorů enzymů, receptorů steroidních hormonů, lipoproteinů, faktorů proteosynthesy a imunoaktivních bílkovin, vyznačující se tím, že na makroporesníoh, trojrozměrných hydrofilních kopolymerech hydroxyalkylakrylátů, popřípadě hydroxyalkylmethakrylátů, ve kterých alkyl obsahuje 1 až 4 atomy uhlíku, s alkylendiakryláty nebo s alkylendimethakrýláty, ve kterých alkylen obsahuje 2 až 4 atomy uhlíku, je kovalentně navázán heparin. Předmětem vynálezu je déle způsob výroby shora uvedenýoh sloučenin, který spočívá v tom, že se makroporesní, trojrozměrné hydrofilní kopolymery hydroxyalkylakrylátů případně hydroxyalkylmethakrylátů, ve kterých alkyl obsahuje 1 až 4 atomy uhlíku, s alkyl.endiakryláty nebo s alkylendimethakryléty, ve kterých alkylen obsahuje 2 až 4 atomy uhlíku, aktivují reakcí s epichlorhydrinem, produkt aktivace se ponechá reagovat s roztokem heparinu v tlumivém roztoku pH 8 až 10 při teplotě 10 až 45 °C po dobu 10 až 100 hodin a po skončení reakce se zbylé nezreagované epoxidové skupiny odstraní působením ethanolaminu. Sloučeniny podle vynálezu se používají jako sorbenty plasmatických bílkovin a podobných systémů.

Description

Vynález ss týká heparlnu imobilisovaného kovalentní vazbou na trojrozměrných makroporesníoh hydrofilních kopolymereoh hydroxyalkylakrylátů případně hydroxyalkylmethakrylátů a alkylendlakryláty nebo dlmethakryláty a způsobu imobillsaoe, která je charakterizována vazebnou reakoi noslěe obsahujíoího na vnitřním povrchu makropórů reaktivní epoxidové skupiny s heparinem.

Hydrofilní trojrozměrné makroporesní kopolyméry hydroxyalkylakrylátů a hydroxyalkylmethakrylátů s alkylendlakryláty nebo alkylendimethěkryláty a způsob jejich přípravy řízenou suspensní kopolymerisaoí v přítomnosti inertních organickýoh sloučenin ve vodném nebo v organickém dispersním prostředí jsou známy z čs. autorských osvědčení č. 143 828 a 150 819, Kopolyméry se vyznačují velmi dobrými meohaniokými vlastnostmi a jejloh sférioký tvar a makroporesní struktura je předurčují k oelé řadě aplikaci při dělení složitýoh směsí přírodního i syntetického původu, Hydroxylová funkční skupiny lze chemicky přeměnit řadou substitučních reakoi, oxidací a pod. Polymeranalogickými reakcemi modifikované kopolymery byly využity jako nosiče ionogenníoh skupin (čs. autorské osvědčení č. 171 963,

177 507 a 173 201) nebo jako specificky účinné sorbenty v afinitqí ohromatografii (čs. autorské osvědčení č. 167 530, 175 047 a 193 845).

Heparin je mukopolysaoharid pi jdního původu. Jde o vysoce sulfatovaný glykosaminoglykan, u něhož však část primárních aminoskupin zůstává volná a může reagovat za vhodných podmínek s funkčními skupinami nosiče za vzniku kovalentní vazby. Heparin je antikoagulant, jehož účinnost je zaležena na schopnosti selektivně interagovat a plasmatiokým proteolytiokým inhibitorem antitrombinem lil. Komplex antltrombin III - heparin má zvýšenou lnhibiční aktivitu vůči trombinu a je dále sohop n inaktivovat některé další faktory v koagulačním schématu jako jsou faktory IXa, Xa, Ua a XII. S ohledem na svůj charakter polyaniontu lnteraguje heparin a vétší čl menší selektivitou s celou řadou biologicky aktivníoh sloučenin jako jsou některé další plasmatioké bílkoviny, lipasy, llpoproteiny SNA a DNA polymerasy, reeeptory steroldníoh hormonů, faktory proteosynthesy, imunoaktivní bílkoviny a další.

Kovalentní vazbou heparlnu na polysaoharidový nosič agarosu byl pomooí bromkyanové aktivace připraven švédskou firmou Pharmacia Uppsala sorbent Heparin-Sepharose CL-6B. Vedle vysoké botnaoí schopnosti ve vodných roztocích, závislosti objemu zbotnalých částic na hodnotě pH a iontové síle roztoku, nepříliš vysoké chemické odolnosti vůči extrémním hodnotám pH určené polysaoharidovým charakterem nosiče a konečně omezené stálosti vůči působení mikroorganismů, patří ke značné nevýhodě tohoto sorbentu aminolytické odbourávání afinantů vázaných pomooí bromkyanové metody, při kterém vznikají deriváty guanidinu. Ani podmínky aktivační reakoe s ohledem na vysokou toxioitu bromkyanu, ani prokázaná hydrolysa afinantů při vlastním použití, nepatří k ideálním vlastnostem polysaoharidového nosiče obsahujícího vázaný heparin. Některé z uvedenýoh vlastností komerčního imobilisovaného heparinu na agarovém nosiči byly odstraněny u jiného typu sorbentu - polymsthylmethakrylátu, jehož polymerieaoe byla iniciována heparinovýml radikály. Výsledný produkt obsahoval ooa 10 % hmot. vázaného heparlnu, jehož aktivita vůči antitrombinu odpovídala 1 % hmot. Sorbent byl věak připraven v amorfhí práškovité formě a již při samotné polymerisační reakoi

215 941 v přítomnosti heparinu docházelo ke štěpení, projevujícím se snížením molekulové hmotnosti heparinu a ke snížení jeho aktivity na 20 %. Hydrofobní nosič (polymethylmethakrylát) rovněž přispívá ke snížení aktivity konečné formy imobilisovaného heparinu (M.C.Boffa et al. Thrombos, Haemostas.(Stuttg.) 41(1979/346).

Z uvedeného je zřejmé, že pro dosažení dobré mechanické a hydrolytioké stability imobilisovaného heparinu pro použití v laboratorní, případně v průmyslové biospecifické ohromatografická separační technice je žádoucí volit nosič na bázi rigidního makroporesního materiálu s pravidelným tvarem částic, který má vhodné hydrodynamické vlastnosti při kolonovém uspořádání procesu a který je dostatečně hydrofilní. Provedení vazby heparinu musí být jednoduché, technologicky nenáročné a musí zaručit dostatečnou stabilitu afinantu vůči hydrolyse bez ztráty jeho biochemické aktivity. Těohto vlastností je dosaženo imobilisací heparinu na hydroxyalkylmethakrylátovýoh a hydroxyalkylakrylátových nosičích.

Předmětem vynálezu je heparin imobilisovaný na hydroxyalkylakrylátových a hydroxyalkylmethakrylátových nosičích jako sorbent plasmatických bílkovin, koagulačních faktorů, enzymů, inhibitorů enzymů, reoeptorů steroidních hormonů, lipoproteinů, faktorů proteosynthesy a imunoaktivníoh bílkovin, který spočívá v tom, že sestává z epichlorhydrinem aktivovaného makroporesního, trojrozměrného, hydrofilního kopolymerů hydroxyalkylakrylátů nebe hydroxyalkylmethakrylátů, ve kterých alkyl obsahuje 1 až 4 atomy uhlíku s alkylendiakryláty nebo s alkylendimethakryláty, ve kterých alkylen obsahuje 2 až 4 atomy uhlíku, na kterém je kovalentně navázán heparin v množství 0,5 až 100 mg/g suohého aktivovaného nosiče.

Dále je předmětem vynálezu způsob výroby uvedených sloučenin, který je charakterizován tím, že se makroporesní, trojrozměrné a hydrofilní kopolymery hydroxyakrylátů popřípadě hydroxyalkylmethakrylátů, ve kterých alkyl obsahuje 1 až 4 atomy uhlíku, s alkylendiakryláty nebo s alkylendimethakryláty, ve kterých alkylen obsahuje 2 až 4 atomy uhlíku, aktivují reakcí s I až 5 ml epiohlorhydrinu/g suchého kopolymerů, produkt aktivace se ponechá reagovat s roztokem heparinu v tlumivém roztoku o pH 8 až 10 o koncentraci 0,1 až 1 g heparinu/g suchého aktivovaného nosiče při teplotě 10 až 45 °C po dobu 10 až 100 hodin a po skončení reakoe se zbylé nezreagované epoxidové skupiny odstraní působením 8 až 20 ml ethanolaminu ve vodném roztoku.

Sorbenty podle tohoto vynálezu obsahují vázaný heparin v aktivní formě a proti dosud známým preparátům využívajícím jiné typy nosičů mají řadu výhod.

Ve srovnání s heparinem vázaným na polysaoharidových nosičích je při srovnatelné specifické aktivitě podstatný rozdíl ve vlastnostech sorbentů podle tohoto vynálezu, jsou-li v kontaktu s vodnými roztoky dělených složek. Makroporesní charakter hydroxyalkylakrylátových a hydroxyalkylmethakrylátovýoh nosičů zaručuje stálost objemu sorbentů při změně pH a iontové síly roztoku; sférický tvar a mechanická pevnost částic umožňuje vysoké průtokové rychlosti kapalného media v kolonovém uspořádání. Makroporesní charakter struktury dovoluje penetraci molekul s molekulovou hmotností do cca 2.10& daltonů do vnitřní domény sorbentů bez podstatných omezení způsobených zpomalením difuse, která je často pozorována u homogenních xerogelů polysacharidového typu. Sorbenty umožňují dokonce práce za zvý215 941 šeného tlaku nebo ve vyeokýoh preparátivníoh sloupcích bez nebezpečí jejioh sesedání a ucpávání. Syntetická matrioe nosiče zaručuje odolnost proti působení mikroorganismů.

Aktivace akrylátových a methakrylátovýoh nosičů přímou reakoí s epiohlorhydrinem je teohnologicky nenáročná a poskytuje reaktivní produkt, který je v suchém stavu možno beze ztráty aktivity skladovat. Důležitou skutečností je, že aktivace nosiče probíhá pouze na vnitřním hydrof líním povrchu pórů, nikoli ve hmotě, takže po následné vazebné reakci s heparinem je eliminace zbylých reaktivních skupin úplná, poměrně rychlá a konečná.

Vlastní vazba heparinu se uskutečňuje adicí primárních aminoskupln heparinu na epoxidový kruh aktivovaného kopolymerů. Nutnou podmínkou je, aby aminoskupiny nebyly protonisovány, je proto nutno upravit alkalitu roztoku heparinu vhodným pufrem na hodnotu pH 8 až 10. S výhodou lze použít 0,1 M borátovýoh pufrů a pH 9,4. Teplota a čas reakoe určují stupeň konverse, s výhodou lze vázat heparin při teplotách 10 až 45 °G po dobu 10 až 100 hodin při mírném míchání suspense. Stanovení obsahu vázaného heparinu bylo provedeno titrací sulfoskupin louhem v methanoliokém roztoku (L.B. Jaques and H.J.Bell, in Methods of Biochemioal Analysis, Ed.D.Gliek.Vol. 7,254-309, Intersoienoe Publishers Ino., New York, London, 1959). Účinek sorbentů podle předmětu vynálezu byl ověřován v reálnýoh systémech.

Předmět vynálezu je objasněn v ''sledujících příkladech provedení, aniž by vSak byl jimi jakkoli omezován.

Příklad 1

100 g kopolymerů ethylendimethakrylátu e 2-hydroxyethylmethakrylátem o vylučovacím limitu 10^ daltonů s velikostí sfériokých částic 100 až 200/um se nabotná v 500 ml 50% hydroxidu draselného po dobu 15 hodin při teplotě 5 °C. Takto zbotnalý nosič se odfiltruje a za stálého míchání se vnese do reaktoru opatřeného zpětným ohladičem a teploměrem, ve kterém bylo předloženo 400 ml epichlorhydrinu. Asi po 1 hodině vystoupí teplota reakční směsi na teplotu varu epichlorhydrinu. Po odeznění reakoe se přidá 100 ml nasyceného roztoku bromidu draselného a reakční směs se zahřívá k varu po dobu 3 hodin. Po skončení reakce se aktivovaný sorbent odfiltruje, na filtru se promyje 3 x 500 ml acetonu, rychle 2x1000 ml vody do neutrální reakce filtrátu, znovu 3 x acetonem, etherem a vysuší se ve vakuové sušárně při 20 °C po dobu 24 hodin. Obsah epoxidových skupin se stanovuje titračně: 0,420 tnmol/g suchého kopolymerů.

g aktivovaného nosiče připlaveného podle uvedeného postupu se neohá stát 3 hod. v 5 ml čerstvě destilované nebo převařené vody (30 minut varu). Voda se odfiltruje a vlhký nosič se promyje- borátovým pufrem (0,1 M, pH 9,4). Ve stejném pufru se přidá roztok 0,2 až 0,3 g heparinu (100 m.j. v 1 mg preparátu). Po dobu 70 hodin se směs protřepává při teplotě 20 až 25 °C, pak se pufr se zbytkem nezreagovaného heparinu oddělí od pevné fáze filtrací nebo odstředěním a případně po přidání čerstvého heparinu se použije k nové reakci s aktivovaným nosičem.

Pevný podíl se promyje vodou a pomooí ethanolaminu se vysytí zbývající nezreagovaná epoxidové skupiny. Na 1 g aktivovaného nosiče se přidá roztok 4 ml ethanolaminu v 8 ml vody a při 20 °C se suspense míchá 2 hodiny, roztok se odsaje a přidá se nový roztok 4 ml

215 941 athanniaminu v 16 ml vody a při 20 °C se produkt míohá po dobu 4 hodin. Nezreagovaný ethanolamin ee odstraní odsátím a produkt na filtru se promývé vodou a 0,1 M borátovým pufrem do negativní reakce vůči Na-1,2-naftochinon-4-sulfonátu (J.M.McKibbin in Methods of Biochemical Analysis, Ed.D.Glick,Vol.7,111-143, Interscience Publishers lne., New York, London, 1959). Účinek připraveného sorbentu byl ověřen isolací některých bílkovin z lidské plasmy. 1 g takto imobilisovaného heparinu váže 45 až 60 mezinárodních jednotek (NIH) trombinu. Obsah vázaného heparinu 3,9 mg/g suchého nosiče.

Příklad 2

Aktivace kopolymerů 2-hydroxyethylakxylátu s ethylenglykoldimethakrylátem (vylučovací limit molekulové hmotnosti 500 000 daltonů) se provádí analogioky jako v příkladu 1. Reakce a heparinem se provádí za stejných podmínek jako v příkladu 1 s tím rozdílem, že teplota reakce se udržuje na 10 °0, při trvání reakce 100 hodin při pH tlumivého roztoku 10. Obsah vázaného heparinu stanovený titrací sulfoskupin činí 2,8 mg/g suchého nosiče.

Příklad 3

Imobilisace heparinu se provádí analogicky jako v příkladu 1 s tím rozdílem, že jako nosiče bylo použito kopolymerů 2-hydroxyethylakrylátu s ethylendiakrylátem o vylučovacím limitu molekulové hmotnosti 10^ daltonů. Obsah vázaného heparinu činí 3,0 mg/g suchého nosiče.

Příklad 4

Aktivace kopolymerů 2-hydroxyethylmethakrylátu s ethylendimethakrylátem o vylučovaeím limitu molekulové hmotnosti 2.10 daltonů se provádí stejně jako v příkladu 1. Reakce s heparinem se rovněž provádí analogicky, jako v příkladu 1 a tím rozdílem, že množství heparinu nasazeného k reakci činí 0,5 g ve 4 ml 0,1 M borátového pufru pH 9,4. Reakční teplota činí 40 až 45 °C a doba reakce 30 hodin. Po dosycení zbývajících epoxidových funkčních skupin se soxbent zbaví ethanolaminu elucí v chromatografické koloně. Obsah vázaného heparinu činí 4 mg/g suchého nosiče.

Claims (2)

1. Heparin imobilisovaný na hydroxyalkylakrylátovýeh a hydroxyalkylmethakrylátových nosičích jako sorbent plasmatiekých bílkovin, koagulačníoh faktorů, enzymů, inhibitorů enzymů, receptorů steroidníoh hormonů, lipoproteinů, faktorů proteosynthésy a imunoaktivních bílkovin vyznačující se tím, že sestává z epichlorhydrínem aktivovaného makxoporésního, trojrozměrného, hydrofilního kopolymerů hydroxyalkylakrylátů nebo hydroxyalkylmetakrylátů, ve kterýoh alkyl obsahuje 1 až 4 atomy uhlíku, s alkylendlakryláty nebo s alkylendimethakryláty, ve kterýoh alkylen obsahuje 2 až 4 atomy uhlíku, na kterém je kovalentně navázán heparin v množství 0,5 až 100 mg/g suchého aktivovaného nosiče.

215 941

2. Způsob výroby sloučenin podle bodu 1, vyznačující se tím, že se makroporésní, trojrozměrné a hydrofilní kopolymery hydroxyakrylátů případně hydroxyalkylmethakrylátů, ve kterých alkyl obsahuje 1 až 4 atomy uhlíku, s alkylendiakryláty nebo s alkylendimethakryléty, ve kterých alkylen obsahuje 2 až 4 atomy uhlíku, aktivují reakcí s 1 až 5 ml epiohlorhydrinu/g suchého kopolymeru, produkt aktivace se poneohá reagovat s roztokem heparihu v tlumivém roztoku pH 8 až 10 o konoentraoi 0,1 až 1 g heparinu/g suchého aktivovaného nosiče při teplotě 10 až 45 °C po dobu 10 až 100 hodin a po skončení reakce se zby lé nezreagované epoxidové skupiny odstraní působením 8 až 20 ml ethanolaminu ve vodném roztoku.