CS215941B1

CS215941B1 - Heparin immobilized on hydroxyalkyl acrylate and hydroxyalkyl methacrylate carriers and process for its production

Info

Publication number: CS215941B1
Application number: CS466580A
Authority: CS
Inventors: Miroslav Rybak; Jiri Coupek
Original assignee: Miroslav Rybak; Jiri Coupek
Priority date: 1980-06-30
Filing date: 1980-06-30
Publication date: 1982-10-29

Abstract

Heparin imobilizovaný na hydroxyalkylakrylátovýoh a hydroxyalkylmethakrylátových nosičích jako sorbent plasmatických bílkovin, koagulačních faktorů, enzymů, inhibitorů enzymů, receptorů steroidních hormonů, lipoproteinů, faktorů proteosynthesy a imunoaktivních bílkovin, vyznačující se tím, že na makroporesníoh, trojrozměrných hydrofilních kopolymerech hydroxyalkylakrylátů, popřípadě hydroxyalkylmethakrylátů, ve kterých alkyl obsahuje 1 až 4 atomy uhlíku, s alkylendiakryláty nebo s alkylendimethakrýláty, ve kterých alkylen obsahuje 2 až 4 atomy uhlíku, je kovalentně navázán heparin. Předmětem vynálezu je déle způsob výroby shora uvedenýoh sloučenin, který spočívá v tom, že se makroporesní, trojrozměrné hydrofilní kopolymery hydroxyalkylakrylátů případně hydroxyalkylmethakrylátů, ve kterých alkyl obsahuje 1 až 4 atomy uhlíku, s alkyl.endiakryláty nebo s alkylendimethakryléty, ve kterých alkylen obsahuje 2 až 4 atomy uhlíku, aktivují reakcí s epichlorhydrinem, produkt aktivace se ponechá reagovat s roztokem heparinu v tlumivém roztoku pH 8 až 10 při teplotě 10 až 45 °C po dobu 10 až 100 hodin a po skončení reakce se zbylé nezreagované epoxidové skupiny odstraní působením ethanolaminu. Sloučeniny podle vynálezu se používají jako sorbenty plasmatických bílkovin a podobných systémů.Heparin immobilized on hydroxyalkylacrylate and hydroxyalkylmethacrylate carriers as a sorbent of plasma proteins, coagulation factors, enzymes, enzyme inhibitors, steroid hormone receptors, lipoproteins, proteosynthesis factors and immunoactive proteins, characterized in that heparin is covalently bound to macroporous, three-dimensional hydrophilic copolymers of hydroxyalkylacrylates or hydroxyalkylmethacrylates, in which alkyl contains 1 to 4 carbon atoms, with alkylene diacrylates or alkylene dimethacrylates, in which alkylene contains 2 to 4 carbon atoms. The subject of the invention is a method for producing the above-mentioned compounds, which consists in activating macroporous, three-dimensional hydrophilic copolymers of hydroxyalkyl acrylates or hydroxyalkyl methacrylates, in which alkyl contains 1 to 4 carbon atoms, with alkyl endiacrylates or with alkylene dimethacrylates, in which alkylene contains 2 to 4 carbon atoms, by reaction with epichlorohydrin, the activation product is allowed to react with a heparin solution in a buffer solution pH 8 to 10 at a temperature of 10 to 45 ° C for 10 to 100 hours and after the reaction is complete, the remaining unreacted epoxide groups are removed by the action of ethanolamine. The compounds according to the invention are used as sorbents of plasma proteins and similar systems.

Description

Vynález ss týká heparlnu imobilisovaného kovalentní vazbou na trojrozměrných makroporesníoh hydrofilních kopolymereoh hydroxyalkylakrylátů případně hydroxyalkylmethakrylátů a alkylendlakryláty nebo dlmethakryláty a způsobu imobillsaoe, která je charakterizována vazebnou reakoi noslěe obsahujíoího na vnitřním povrchu makropórů reaktivní epoxidové skupiny s heparinem.The invention relates to heparin immobilized by covalent bonding to three-dimensional macroporous hydrophilic copolymers of hydroxyalkyl acrylate or hydroxyalkyl methacrylate and alkylene acrylate or dl-methacrylate, and to a method of immobilization which is characterized by a hepatic reactive carrier-containing epoxide-containing macrophage reactive group.

Hydrofilní trojrozměrné makroporesní kopolyméry hydroxyalkylakrylátů a hydroxyalkylmethakrylátů s alkylendlakryláty nebo alkylendimethěkryláty a způsob jejich přípravy řízenou suspensní kopolymerisaoí v přítomnosti inertních organickýoh sloučenin ve vodném nebo v organickém dispersním prostředí jsou známy z čs. autorských osvědčení č. 143 828 a 150 819, Kopolyméry se vyznačují velmi dobrými meohaniokými vlastnostmi a jejloh sférioký tvar a makroporesní struktura je předurčují k oelé řadě aplikaci při dělení složitýoh směsí přírodního i syntetického původu, Hydroxylová funkční skupiny lze chemicky přeměnit řadou substitučních reakoi, oxidací a pod. Polymeranalogickými reakcemi modifikované kopolymery byly využity jako nosiče ionogenníoh skupin (čs. autorské osvědčení č. 171 963,Hydrophilic three-dimensional macroporous copolymers of hydroxyalkyl acrylate and hydroxyalkyl methacrylate with alkylene acrylate or alkylene dimethacrylate and a process for their preparation by controlled suspension copolymerization in the presence of inert organic compounds in aqueous or organic dispersion media are known from U.S. Pat. 143 828 and 150 819, copolymers are characterized by very good meohaniocan properties and their spheroidal shape and macroporous structure predispose them for a wide range of applications in the separation of complex mixtures of natural and synthetic origin. Hydroxyl functional groups can be chemically converted by a number of substitution reactions, oxidation and so on. Polymer-analogous reactions modified by copolymers have been used as carriers of ionogenic groups (cf. No. 171 963,

177 507 a 173 201) nebo jako specificky účinné sorbenty v afinitqí ohromatografii (čs. autorské osvědčení č. 167 530, 175 047 a 193 845).177 507 and 173 201) or as specifically active sorbents in affinity chromatography (cf. No. 167 530, 175 047 and 193 845).

Heparin je mukopolysaoharid pi jdního původu. Jde o vysoce sulfatovaný glykosaminoglykan, u něhož však část primárních aminoskupin zůstává volná a může reagovat za vhodných podmínek s funkčními skupinami nosiče za vzniku kovalentní vazby. Heparin je antikoagulant, jehož účinnost je zaležena na schopnosti selektivně interagovat a plasmatiokým proteolytiokým inhibitorem antitrombinem lil. Komplex antltrombin III - heparin má zvýšenou lnhibiční aktivitu vůči trombinu a je dále sohop n inaktivovat některé další faktory v koagulačním schématu jako jsou faktory IXa, Xa, Ua a XII. S ohledem na svůj charakter polyaniontu lnteraguje heparin a vétší čl menší selektivitou s celou řadou biologicky aktivníoh sloučenin jako jsou některé další plasmatioké bílkoviny, lipasy, llpoproteiny SNA a DNA polymerasy, reeeptory steroldníoh hormonů, faktory proteosynthesy, imunoaktivní bílkoviny a další.Heparin is a mucopolysaoharid of actual origin. It is a highly sulfated glycosaminoglycan, but some of the primary amino groups remain free and can react under appropriate conditions with the functional groups of the carrier to form a covalent bond. Heparin is an anticoagulant whose efficacy is based on its ability to selectively interact with a plasma proteolytic inhibitor antithrombin III. The anti-thrombin III-heparin complex has increased thrombin inhibitory activity and is further able to inactivate some other factors in the coagulation scheme such as factors IXa, Xa, Ua and XII. Due to its nature of the polyanion, heparin and greater selectivity does not interact with a variety of biologically active compounds such as some other plasmatic proteins, lipases, SNA and DNA polymerases, sterile hormone receptors, proteosynthesis factors, immunoactive proteins and more.

Kovalentní vazbou heparlnu na polysaoharidový nosič agarosu byl pomooí bromkyanové aktivace připraven švédskou firmou Pharmacia Uppsala sorbent Heparin-Sepharose CL-6B. Vedle vysoké botnaoí schopnosti ve vodných roztocích, závislosti objemu zbotnalých částic na hodnotě pH a iontové síle roztoku, nepříliš vysoké chemické odolnosti vůči extrémním hodnotám pH určené polysaoharidovým charakterem nosiče a konečně omezené stálosti vůči působení mikroorganismů, patří ke značné nevýhodě tohoto sorbentu aminolytické odbourávání afinantů vázaných pomooí bromkyanové metody, při kterém vznikají deriváty guanidinu. Ani podmínky aktivační reakoe s ohledem na vysokou toxioitu bromkyanu, ani prokázaná hydrolysa afinantů při vlastním použití, nepatří k ideálním vlastnostem polysaoharidového nosiče obsahujícího vázaný heparin. Některé z uvedenýoh vlastností komerčního imobilisovaného heparinu na agarovém nosiči byly odstraněny u jiného typu sorbentu - polymsthylmethakrylátu, jehož polymerieaoe byla iniciována heparinovýml radikály. Výsledný produkt obsahoval ooa 10 % hmot. vázaného heparlnu, jehož aktivita vůči antitrombinu odpovídala 1 % hmot. Sorbent byl věak připraven v amorfhí práškovité formě a již při samotné polymerisační reakoiCovalent binding of heparin to a polysaoharide carrier of agarose was prepared by the Swedish company Pharmacia Uppsala sorbent Heparin-Sepharose CL-6B by means of cyanogen bromide activation. In addition to the high swelling capability of aqueous solutions, the swelling of the swollen particles to the pH and ionic strength of the solution, the low chemical resistance to extreme pH values determined by the polysaoharide nature of the carrier, and ultimately limited stability to microorganisms by the cyanogen bromide method, which produces guanidine derivatives. Neither the conditions of the activation reaction due to the high toxicity of cyanogen bromide nor the proven hydrolysis of the affinants in their own use are among the ideal properties of the polysaoharide carrier containing bound heparin. Some of these properties of commercial immobilized heparin on an agar carrier have been removed with another type of sorbent - polymethyl methacrylate, whose polymer has been initiated by heparin radicals. The resulting product contained about 10 wt. of bound heparln, whose activity towards antithrombin was 1% by weight; However, the sorbent was prepared in amorphous powder form and already during the polymerization reaction itself

215 941 v přítomnosti heparinu docházelo ke štěpení, projevujícím se snížením molekulové hmotnosti heparinu a ke snížení jeho aktivity na 20 %. Hydrofobní nosič (polymethylmethakrylát) rovněž přispívá ke snížení aktivity konečné formy imobilisovaného heparinu (M.C.Boffa et al. Thrombos, Haemostas.(Stuttg.) 41(1979/346).215 941 in the presence of heparin, cleavage, resulting in a decrease in the molecular weight of heparin and a decrease in its activity to 20%. The hydrophobic carrier (polymethyl methacrylate) also contributes to reducing the activity of the final form of immobilized heparin (M. C. Boffa et al. Thrombos, Haemostas. (Stuttg.) 41 (1979/346).

Z uvedeného je zřejmé, že pro dosažení dobré mechanické a hydrolytioké stability imobilisovaného heparinu pro použití v laboratorní, případně v průmyslové biospecifické ohromatografická separační technice je žádoucí volit nosič na bázi rigidního makroporesního materiálu s pravidelným tvarem částic, který má vhodné hydrodynamické vlastnosti při kolonovém uspořádání procesu a který je dostatečně hydrofilní. Provedení vazby heparinu musí být jednoduché, technologicky nenáročné a musí zaručit dostatečnou stabilitu afinantu vůči hydrolyse bez ztráty jeho biochemické aktivity. Těohto vlastností je dosaženo imobilisací heparinu na hydroxyalkylmethakrylátovýoh a hydroxyalkylakrylátových nosičích.From this it is apparent that in order to achieve good mechanical and hydrolytic stability of immobilized heparin for use in laboratory or industrial biospecific ohromatographic separation techniques, it is desirable to choose a carrier based on a regular particle shape rigid macroporous material having suitable hydrodynamic properties in column process design and which is sufficiently hydrophilic. The binding of heparin must be simple, technologically undemanding and must guarantee sufficient stability of the affinity for hydrolysis without loss of its biochemical activity. This property is achieved by immobilizing heparin on hydroxyalkyl methacrylate and hydroxyalkyl acrylate carriers.

Předmětem vynálezu je heparin imobilisovaný na hydroxyalkylakrylátových a hydroxyalkylmethakrylátových nosičích jako sorbent plasmatických bílkovin, koagulačních faktorů, enzymů, inhibitorů enzymů, reoeptorů steroidních hormonů, lipoproteinů, faktorů proteosynthesy a imunoaktivníoh bílkovin, který spočívá v tom, že sestává z epichlorhydrinem aktivovaného makroporesního, trojrozměrného, hydrofilního kopolymerů hydroxyalkylakrylátů nebe hydroxyalkylmethakrylátů, ve kterých alkyl obsahuje 1 až 4 atomy uhlíku s alkylendiakryláty nebo s alkylendimethakryláty, ve kterých alkylen obsahuje 2 až 4 atomy uhlíku, na kterém je kovalentně navázán heparin v množství 0,5 až 100 mg/g suohého aktivovaného nosiče.The subject of the invention is heparin immobilized on hydroxyalkyl acrylate and hydroxyalkyl methacrylate carriers as a sorbent of plasma proteins, coagulation factors, enzymes, enzyme inhibitors, steroid hormone reoeptors, lipoproteins, proteosynthesis factors and immunoactive proteins consisting of a three-dimensional, phosphoric, copolymers of hydroxyalkyl acrylates or hydroxyalkyl methacrylates in which alkyl contains 1 to 4 carbon atoms with alkylene diacrylates or with alkylene dimethacrylates in which alkylene contains 2 to 4 carbon atoms to which heparin is covalently bound in an amount of 0.5 to 100 mg / g of dry activated carrier.

Dále je předmětem vynálezu způsob výroby uvedených sloučenin, který je charakterizován tím, že se makroporesní, trojrozměrné a hydrofilní kopolymery hydroxyakrylátů popřípadě hydroxyalkylmethakrylátů, ve kterých alkyl obsahuje 1 až 4 atomy uhlíku, s alkylendiakryláty nebo s alkylendimethakryláty, ve kterých alkylen obsahuje 2 až 4 atomy uhlíku, aktivují reakcí s I až 5 ml epiohlorhydrinu/g suchého kopolymerů, produkt aktivace se ponechá reagovat s roztokem heparinu v tlumivém roztoku o pH 8 až 10 o koncentraci 0,1 až 1 g heparinu/g suchého aktivovaného nosiče při teplotě 10 až 45 °C po dobu 10 až 100 hodin a po skončení reakoe se zbylé nezreagované epoxidové skupiny odstraní působením 8 až 20 ml ethanolaminu ve vodném roztoku.The invention further provides a process for the preparation of said compounds, characterized in that the macroporescent, three-dimensional and hydrophilic copolymers of hydroxyacrylates or hydroxyalkyl methacrylates in which the alkyl contains 1 to 4 carbon atoms, with alkylene diacrylates or alkylene dimethacrylates in which alkylene contains 2 to 4 atoms activated with 1 to 5 ml epiohlorohydrin / g dry copolymers, the activation product is reacted with a solution of heparin in a buffer solution of pH 8 to 10 at a concentration of 0.1 to 1 g heparin / g dry activated carrier at a temperature of 10 to 45 ° C for 10 to 100 hours and at the end of the reaction, the remaining unreacted epoxy groups are removed by treatment with 8 to 20 ml of ethanolamine in aqueous solution.

Sorbenty podle tohoto vynálezu obsahují vázaný heparin v aktivní formě a proti dosud známým preparátům využívajícím jiné typy nosičů mají řadu výhod.The sorbents of the present invention contain bound heparin in active form and have a number of advantages over prior art formulations using other carrier types.

Ve srovnání s heparinem vázaným na polysaoharidových nosičích je při srovnatelné specifické aktivitě podstatný rozdíl ve vlastnostech sorbentů podle tohoto vynálezu, jsou-li v kontaktu s vodnými roztoky dělených složek. Makroporesní charakter hydroxyalkylakrylátových a hydroxyalkylmethakrylátovýoh nosičů zaručuje stálost objemu sorbentů při změně pH a iontové síly roztoku; sférický tvar a mechanická pevnost částic umožňuje vysoké průtokové rychlosti kapalného media v kolonovém uspořádání. Makroporesní charakter struktury dovoluje penetraci molekul s molekulovou hmotností do cca 2.10& daltonů do vnitřní domény sorbentů bez podstatných omezení způsobených zpomalením difuse, která je často pozorována u homogenních xerogelů polysacharidového typu. Sorbenty umožňují dokonce práce za zvý215 941 šeného tlaku nebo ve vyeokýoh preparátivníoh sloupcích bez nebezpečí jejioh sesedání a ucpávání. Syntetická matrioe nosiče zaručuje odolnost proti působení mikroorganismů.Compared to heparin bound to polysaoharide carriers, at a comparable specific activity, there is a significant difference in the properties of the sorbents of the invention when in contact with aqueous solutions of the divided components. The macroporous nature of the hydroxyalkyl acrylate and hydroxyalkyl methacrylate carriers guarantees the stability of the sorbent volume when the pH and ionic strength of the solution change; the spherical shape and mechanical strength of the particles allow high flow rates of the liquid medium in the column configuration. The macroporous nature of the structure permits the penetration of molecules with a molecular weight of up to about 2.10 < 6 > < 6 > The sorbents even allow work under increased pressure or in high preparative columns without the risk of falling off and clogging. The synthetic matrioe of the carrier guarantees resistance to the action of microorganisms.

Aktivace akrylátových a methakrylátovýoh nosičů přímou reakoí s epiohlorhydrinem je teohnologicky nenáročná a poskytuje reaktivní produkt, který je v suchém stavu možno beze ztráty aktivity skladovat. Důležitou skutečností je, že aktivace nosiče probíhá pouze na vnitřním hydrof líním povrchu pórů, nikoli ve hmotě, takže po následné vazebné reakci s heparinem je eliminace zbylých reaktivních skupin úplná, poměrně rychlá a konečná.Activation of acrylate and methacrylate carriers by direct reaction with epiohlorohydrin is theoretically undemanding and provides a reactive product that can be stored in a dry state without loss of activity. Importantly, the activation of the carrier takes place only on the internal hydrophilicity of the pore surface, not in the mass, so that following the subsequent binding reaction with heparin, the elimination of the remaining reactive groups is complete, relatively rapid and ultimate.

Vlastní vazba heparinu se uskutečňuje adicí primárních aminoskupln heparinu na epoxidový kruh aktivovaného kopolymerů. Nutnou podmínkou je, aby aminoskupiny nebyly protonisovány, je proto nutno upravit alkalitu roztoku heparinu vhodným pufrem na hodnotu pH 8 až 10. S výhodou lze použít 0,1 M borátovýoh pufrů a pH 9,4. Teplota a čas reakoe určují stupeň konverse, s výhodou lze vázat heparin při teplotách 10 až 45 °G po dobu 10 až 100 hodin při mírném míchání suspense. Stanovení obsahu vázaného heparinu bylo provedeno titrací sulfoskupin louhem v methanoliokém roztoku (L.B. Jaques and H.J.Bell, in Methods of Biochemioal Analysis, Ed.D.Gliek.Vol. 7,254-309, Intersoienoe Publishers Ino., New York, London, 1959). Účinek sorbentů podle předmětu vynálezu byl ověřován v reálnýoh systémech.The actual binding of heparin is accomplished by the addition of primary amino groups of heparin to the epoxy ring of the activated copolymers. As the prerequisite is that the amino groups are not protonated, the alkalinity of the heparin solution must be adjusted to a pH of 8 to 10 with a suitable buffer. Preferably 0.1 M borate buffers and pH 9.4 can be used. The temperature and the reaction time determine the degree of conversion, preferably heparin can be bound at temperatures of 10 to 45 ° C for 10 to 100 hours with gentle stirring of the suspension. The determination of bound heparin was performed by titration of sulfo groups with caustic in methanolic solution (L.B. Jaques and H.J.Bell, in Methods of Biochemical Analysis, Ed.D. Gliek.Vol. 7,254-309, Intersoienoe Publishers Ino., New York, London, 1959). The effect of the sorbents of the present invention was verified in real systems.

Předmět vynálezu je objasněn v ''sledujících příkladech provedení, aniž by vSak byl jimi jakkoli omezován.The invention is illustrated by the following non-limiting examples.

Příklad 1Example 1

100 g kopolymerů ethylendimethakrylátu e 2-hydroxyethylmethakrylátem o vylučovacím limitu 10^ daltonů s velikostí sfériokých částic 100 až 200/um se nabotná v 500 ml 50% hydroxidu draselného po dobu 15 hodin při teplotě 5 °C. Takto zbotnalý nosič se odfiltruje a za stálého míchání se vnese do reaktoru opatřeného zpětným ohladičem a teploměrem, ve kterém bylo předloženo 400 ml epichlorhydrinu. Asi po 1 hodině vystoupí teplota reakční směsi na teplotu varu epichlorhydrinu. Po odeznění reakoe se přidá 100 ml nasyceného roztoku bromidu draselného a reakční směs se zahřívá k varu po dobu 3 hodin. Po skončení reakce se aktivovaný sorbent odfiltruje, na filtru se promyje 3 x 500 ml acetonu, rychle 2x1000 ml vody do neutrální reakce filtrátu, znovu 3 x acetonem, etherem a vysuší se ve vakuové sušárně při 20 °C po dobu 24 hodin. Obsah epoxidových skupin se stanovuje titračně: 0,420 tnmol/g suchého kopolymerů.100 g of ethylene dimethacrylate-2-hydroxyethyl methacrylate copolymers with an exclusion limit of 10 .mu.l with spherical particle sizes of 100 to 200 .mu.m are swollen in 500 ml of 50% potassium hydroxide for 15 hours at 5 DEG. The swollen carrier was filtered off and charged with stirring to a reactor equipped with a reflux condenser and a thermometer in which 400 ml of epichlorohydrin was introduced. After about 1 hour the temperature of the reaction mixture rises to the boiling point of epichlorohydrin. After the reaction has subsided, 100 ml of saturated potassium bromide solution are added and the reaction mixture is heated to boiling for 3 hours. After completion of the reaction, the activated sorbent is filtered off, washed on the filter with 3 x 500 ml of acetone, quickly with 2 x 1000 ml of water until neutral of the filtrate, again with 3 x acetone, ether and dried in a vacuum oven at 20 ° C for 24 hours. The content of epoxy groups is determined by titration: 0.420 nmol / g dry copolymers.

g aktivovaného nosiče připlaveného podle uvedeného postupu se neohá stát 3 hod. v 5 ml čerstvě destilované nebo převařené vody (30 minut varu). Voda se odfiltruje a vlhký nosič se promyje- borátovým pufrem (0,1 M, pH 9,4). Ve stejném pufru se přidá roztok 0,2 až 0,3 g heparinu (100 m.j. v 1 mg preparátu). Po dobu 70 hodin se směs protřepává při teplotě 20 až 25 °C, pak se pufr se zbytkem nezreagovaného heparinu oddělí od pevné fáze filtrací nebo odstředěním a případně po přidání čerstvého heparinu se použije k nové reakci s aktivovaným nosičem.g of activated carrier floated according to the above procedure is not allowed to stand for 3 hours in 5 ml of freshly distilled or boiled water (30 minutes of boiling). The water was filtered off and the wet support was washed with borate buffer (0.1 M, pH 9.4). A solution of 0.2 to 0.3 g heparin (100 IU in 1 mg preparation) is added in the same buffer. For 70 hours, the mixture is shaken at 20-25 ° C, then the buffer with the residual unreacted heparin is separated from the solid phase by filtration or centrifugation and optionally, after addition of fresh heparin, is used for a new reaction with the activated carrier.

Pevný podíl se promyje vodou a pomooí ethanolaminu se vysytí zbývající nezreagovaná epoxidové skupiny. Na 1 g aktivovaného nosiče se přidá roztok 4 ml ethanolaminu v 8 ml vody a při 20 °C se suspense míchá 2 hodiny, roztok se odsaje a přidá se nový roztok 4 mlThe solid was washed with water and the remaining unreacted epoxide group was saturated with ethanolamine. A solution of 4 ml of ethanolamine in 8 ml of water is added per g of activated carrier and the suspension is stirred at 20 DEG C. for 2 hours, the solution is filtered off with suction and a new solution of 4 ml is added.

215 941 athanniaminu v 16 ml vody a při 20 °C se produkt míohá po dobu 4 hodin. Nezreagovaný ethanolamin ee odstraní odsátím a produkt na filtru se promývé vodou a 0,1 M borátovým pufrem do negativní reakce vůči Na-1,2-naftochinon-4-sulfonátu (J.M.McKibbin in Methods of Biochemical Analysis, Ed.D.Glick,Vol.7,111-143, Interscience Publishers lne., New York, London, 1959). Účinek připraveného sorbentu byl ověřen isolací některých bílkovin z lidské plasmy. 1 g takto imobilisovaného heparinu váže 45 až 60 mezinárodních jednotek (NIH) trombinu. Obsah vázaného heparinu 3,9 mg/g suchého nosiče.215 941 of athanniamine in 16 ml of water and at 20 ° C the product was stirred for 4 hours. Unreacted ethanolamine is removed by aspiration and the product on the filter is washed with water and 0.1 M borate buffer to a negative reaction to Na-1,2-naphthoquinone-4-sulfonate (JMMcKibbin in Methods of Biochemical Analysis, Ed.D.Glick, Vol. 7,111-143, Interscience Publishers Inc., New York, London, 1959). The effect of prepared sorbent was verified by isolation of some proteins from human plasma. 1 g of such immobilized heparin binds 45 to 60 International Units (NIH) of thrombin. Bound heparin content 3.9 mg / g dry carrier.

Příklad 2Example 2

Aktivace kopolymerů 2-hydroxyethylakxylátu s ethylenglykoldimethakrylátem (vylučovací limit molekulové hmotnosti 500 000 daltonů) se provádí analogioky jako v příkladu 1. Reakce a heparinem se provádí za stejných podmínek jako v příkladu 1 s tím rozdílem, že teplota reakce se udržuje na 10 °0, při trvání reakce 100 hodin při pH tlumivého roztoku 10. Obsah vázaného heparinu stanovený titrací sulfoskupin činí 2,8 mg/g suchého nosiče.Activation of the copolymers of 2-hydroxyethyl alkoxylate with ethylene glycol dimethacrylate (molecular weight exclusion limit of 500,000 daltons) is carried out analogously to Example 1. The reaction and heparin are carried out under the same conditions as in Example 1, except that the reaction temperature is maintained at 10 °. at a reaction time of 100 hours at pH of buffer 10. The bound heparin content determined by titration of the sulfo groups is 2.8 mg / g dry carrier.

Příklad 3Example 3

Imobilisace heparinu se provádí analogicky jako v příkladu 1 s tím rozdílem, že jako nosiče bylo použito kopolymerů 2-hydroxyethylakrylátu s ethylendiakrylátem o vylučovacím limitu molekulové hmotnosti 10^ daltonů. Obsah vázaného heparinu činí 3,0 mg/g suchého nosiče.The immobilization of heparin is carried out analogously to Example 1, except that copolymers of 2-hydroxyethylacrylate with ethylenediacrylate having a molecular weight cut-off of 10 .mu.l were used as carriers. The bound heparin content was 3.0 mg / g dry carrier.

Příklad 4Example 4

Aktivace kopolymerů 2-hydroxyethylmethakrylátu s ethylendimethakrylátem o vylučovaeím limitu molekulové hmotnosti 2.10 daltonů se provádí stejně jako v příkladu 1. Reakce s heparinem se rovněž provádí analogicky, jako v příkladu 1 a tím rozdílem, že množství heparinu nasazeného k reakci činí 0,5 g ve 4 ml 0,1 M borátového pufru pH 9,4. Reakční teplota činí 40 až 45 °C a doba reakce 30 hodin. Po dosycení zbývajících epoxidových funkčních skupin se soxbent zbaví ethanolaminu elucí v chromatografické koloně. Obsah vázaného heparinu činí 4 mg/g suchého nosiče.Activation of 2-hydroxyethyl methacrylate-ethylene dimethacrylate copolymers with a molecular weight cut-off of 2.10 daltons is carried out as in Example 1. The reaction with heparin is also carried out analogously to Example 1, except that the amount of heparin used for the reaction is 0.5 g in 4 ml of 0.1 M borate buffer pH 9.4. The reaction temperature is 40 to 45 ° C and the reaction time is 30 hours. After saturation of the remaining epoxy functional groups, the soxbent is freed from ethanolamine by elution in a chromatography column. The bound heparin content is 4 mg / g dry carrier.

Claims

Heparin immobilized on hydroxyalkylacrylate and hydroxyalkyl methacrylate carriers as a sorbent of plasma proteins, coagulation factors, enzymes, enzyme inhibitors, steroid hormone receptors, lipoproteins, proteosynthesis factors and immunoactive proteins, characterized in that it consists of a three-dimensional copolymer, epoxy polymer, hydroxyalkyl methacrylates in which the alkyl contains 1 to 4 carbon atoms, with alkylene acrylates or with alkylene dimethacrylates in which the alkylene contains 2 to 4 carbon atoms, to which heparin is covalently bound in an amount of 0.5 to 100 mg / g dry activated carrier.

215 941

2. A process for the preparation of the compounds according to claim 1, characterized in that the macroporous, three-dimensional and hydrophilic copolymers of hydroxyacrylates or hydroxyalkyl methacrylates in which the alkyl contains 1 to 4 carbon atoms, alkylene diacrylates or alkylene dimethacrylates in which the alkylene contains 2 to 4 carbon atoms. , activated by reaction with 1 to 5 ml of epiohlorohydrin / g dry copolymer, the activation product is reacted with a solution of heparan in a buffer solution of pH 8 to 10 with a concentration of 0.1 to 1 g heparin / g dry activated carrier at 10 to 45 ° C for 10 to 100 hours and after completion of the reaction, the remaining unreacted epoxide groups are removed by treatment with 8 to 20 ml of ethanolamine in aqueous solution.