CS215790A3 - Polyamines and polypeptides suitable as antagonists of excitation amino acid neurotransmitters and/or blocking agents of calcium channels - Google Patents

Description

'V ... ' '<

Polyaminy a polypeptidy vhodné jako antagonisté excitačníchaminokyselinových neurotransmiterů a/nebo blokující činidlavápníkových kanálů

Vynález se týká určitých polyaminů a polypeptidů,nalezených v jedu pavouka Agelenopsls aperta. Tyto poly-aminy a jejich farmaceuticky přípustné soli antagonizujíexcitační aminokyselinové neurotransmitery, které mají vlivna buňky, včetně nervových buněk, řady organismů včetněbezobratlých a obratlovců. Tyto polypeptidy a jeden z uvede-ných polyaminů a jejich farmaceuticky přípustné soli blokujívápníkové kanálky v buňkách, včetně nervových a svalovýchbuňek různých organismů, včetně bezobratlých a obratlovců.Vynález se rovněž týká použití takových polyaminů a jejichsolí k antagonickému působení na excitační aminokyselinovéneurotransmitery, které mají vliv na buňky nervového systémuorganismu, při léčení chorob a stavů, vyvolaných excitačnímiaminokyselinovými neurotransmitery u savců a k hubení bezobrat-lých škůdců. Vynález se rovněž týká sloučenin, obsahujícíchuvedené polyarainy a jejich soli. Dále se vynález týká použitíuvedených polypeptidů a jednoho z uvedených polyaminů a jejichsolí k blokování vápníkových kanálků v buňkách nervovéhoa svalového systému organismu při léčení chorob a stavů,vyvolaných vápníkovým kanálkem u savců a při hubení bezobratlýchškůdců a přípravků, obsahujících uvedené polypeptidy, poly-amin a jejich soli. - 3 - t

Byl· uveden·, že jed pavouka Agelenopsis aperta obsahuje v alespoň dva toxiny, které působí na proudění vápníku.

Jackson, H. a kel., Sec. Neu. Sci. Abstr. 22’10?8 <19©7).

Uvedení autoři objevili toxin, označený jak· AG2, který mámolekulovou hmotnost menší než 1,000 daltonů a potlačujeproudění vápníkuvmnoha tkáníoh. Dále uvádí Jackson, H., a kol,,Soc. Neu. Sci. Abstr. 22:730 (1986) další toxin z Agelenopsisaperta. obsahující komponent s molekulovou hmostností asi6,000. Tento toxin způsobuje presynaptickou blokádu transmisea je domněnka, že tento toxin blokuje vápníkové kanálkyv důsledku uvolňování neurotransmiterů.

Sloučeniny, které jsou excitatory antagonistů aminokyse-linových neurotransmiterů, mají řadu využití, Antagonistéexcitačních aminokyselinových neurotransmiterů nacházejíklinické využití při léčení stavů, jako jeou záchvaty,mrtvice, mozková ischemie, nervové degenerační poruchy, j&amp;goje Alzheimerova choroba a epilepsie a jako psychetherapeutika.Viz. Excitatory Amlno Aclds in Health and Disease, D. Lodge, Ed.,John Wiley and Sons Ltd., New York, NY 1988. Tyto sloučeninyjsou dále užitečné při studiu fyziologie buňek, například ner-vových buněk a při hubení bezobratlých škůdců, l

Sloučeniny, které působí jako antagonisté vápníku, majířadu použití. Tak mohou antagonisté vápníku nalézat klinickévyužití při léčení angíny, hypertense, kardiomyopathie,supraventikulámích arytmií, aesophogeální achalasie, 4 -

Raynaudovy choroby a dalších. Viz. W. G, Nayler, CalciumAntagonists, Academie Press, Harcourt Brace Javanovichovovydavatelství, New York, NY 1988. Závěry této práce jsouuvedeny v popisu této přihlášky vynálezu. Kromě toho jsoutyto sloučeniny vhodné pro studium fyziologických procesův buňkách, například v nervových a svalových buňkách a prohubení bezobratlého hmyzu.

Vynález se týká polyaminů a polypeptidů, přítomnýchv jedu pavouka Agelenopsis apeřta. Polyaminy podle vynálezua frakce ve kterých jsou přítomny podle vynálezu jsou tyto:Frakce A "/AGEL 452/:

HO

Frakce A1 /AGEL 468/:

Frakce A2 /AGEL 448/:

5

Frakce B /AGEL 505/:

Frakce B2 /AGEL 504/: FAB MS: vysoké rozlišení: 505,3861 vypočteno pro C27H48N6°3-Frakce E /AGEL 489/:

NH.

Polypeptidy podle vynálezu a frakce ve kterých jsoupodle vynálezu přítomny, jsou tyto:

Frakce G:

Koncový amin aminokyselinové sekvence obsahuje:ř^N-glu-lys-gly-leu-pro-glu-gly-ala-glu-cys-asp-gly-asn-glu-ser-asp-cys-lys-cys-ala-gly-gln-trp-ile-lys-cys, arg-cys-pro-trp-lys-trp-his-ile-thr-gly-glu-gly-pro-cys-thr-cys-glu-arg-gly-leu-lys-lys-thr-cys-ile-ser-lys-leu-ser-asp-pro-asn-arg-asn-glu-tr—leu-ser-; molekulová hmotnost celéhopeptidu podle FAB MS: 7267. 6

Frakce :

Koncový amin aminokyselinové sekvence obsahuje:

KnK-ala-lys-ala-leu-pro-pro-gly-ser-val-cys-asp-gly-asn-glu-ser-asp-cys-lys-cys-tyr-gly-lys-trp-his-lys-cys-arg-cys-pro-trp-lys-trp-his-phe-thr-gly-glu-pro-cys-thr-cys-glu-lys-gly-met-lys-his-thr-cys-ile-thr-lys-leu-his-cys-pro-asn-lys-ala-glu-trp-gly-leu-as—trp-;molekulová hmotnost celého peptidu podle Ion-Spray MS . 7793.

Frakce I: í^N-asp-cys-val-gly-glu-ser-gln-gln-cys-ala-asp-trp-ala-gly-pro-his-cys-cys-asp-gly-tyr-tyr-cys-thr-cys-arg-tyr-phe-pro-lys-cys-ile-cys-val-asn-asn-asn-CON^; FABMS: 4158.

Frakce J: H^N-asp-glu-pro-cys-ile-pro-leu-gly-^lys-ser-cys-ser-trp-lys-ile-gly-thr-pro-tyr-f cys-cys-pro-his-pro-asp-asp-ala-gly-arg- í arg-thr-trp-cys-leu-val-asp-tyr-ser-arg- phe-val-thr-ile-cys-ser-gly-arg-lys-tyr-C0NH2;molekulová hmotnost celého peptidu podle FAB MS: 5506

Frakce :

Koncový amin aminokyselinové sekvence obsahuje: gly-asp-tyr-pro-trp-met-val-ser-ile- gln-gln-lys-asn-lys-lys-gly-giy-phe-asp-; přibližnámolekulová hmotnost celého polypeptidu je asi 20 000.

Frakce L2:

Polypeptid, získaný postupem podle příkladu 9.

Frakce M:

Koncový amin aminokyselinové sekvence obsahuje; H2N-glu-ala-thr-glu-ala-ala-lys-val-leu-ser-asn-leu-asp-glu-thr-val-asp-pro-; přibližná mole-kulová hmotnost celého polypeptidu je asi 80 000.

Polyaminy podle vynálezu a jejich farmaceuticky přípustnésoli antagonizují excitační aminokyselinové neurotransmitery,které působí na buňky. To znamená, že uvedené polyaminy jsousami o sobě vhodné k antagonizaci takových neurotransmiterů.Polyaminy podle vynálezu jsou rovněž vhodné k hubení bezobrat-lých škůdců a k léčení chorob a stavů u savců, způsobenýchexcitačními aminokyselinovými neurotransmitery. Uvedené poly-aminy jsou také vhodné jako psychotherapeutika pro savce.

Polyamin , uvedený výše, a polypeptidy podle vynálezublokují vápníkjvé kanálky v buňkách. To znamená, že uvedenýpolyamin B1 a polypeptidy jsou vhodné k blokování vápníkovýchkanálků v buňkách. Polyamin B1 a uvedené polypeptidy jsou dálevhodné k hubení bezobratlých škůdců a k léčení chorob a stavůu savců, způsobených funckí vápníkového kanálku v buňkách.

Do rozsahu vynálezu náleží rovněž polypeptidy, které majístejnou aminokyselinovou sekvenci a stejný blokující účinekna vápníkový kanálek jako výše uvedené polypeptidy. 8

Vynález se rovněž týká farmaceutických přípravků, obsahu-jících uvedené polyaminy a polypeptidy a způsobu podáváníuvedených polyaminů a polypeptidů.

Jed pavouka Agelenopsis aperta se získává o sobě známýmzpůsobem elektrickou stimulací. Je vhodné, aby použitý způsobzískávání jedu zabránil kontaminaci jedu obsahem žaludku nebohemolymfou. Takové způsoby jsou odborníkům dobře známé. Získanýjed se skladuje ve zmrazeném stavu při teplotě -78°C. Následněse před použitím jed vyčistí postupem, popsaným v dalším popisu Čištění, jedu se provádí kapalnou chromatografií s vysokourozlišovací schopností /HPLC/ na preparativních nebo semi-preparativních sloupcích, jako jsou C-4 a C-18 Vyda<^ sloupce/Rainin Instrument Co. Inc., Mack Road, Woburn Massachusetts01801/. Stanovení píku se provádí, monochromaticky při220-230 nm. Další analýza frakcí se může provádět napříkladpomocí polychromomatických hodnot UV, stanovených diodovýmskupinovým detektorem Waters 990 /Millipore Corporation, WatersChromatography Division, 34 Maple Street, Milford, Massachu-setts 01757/. Frakce ze sloupců se jímají známými postupy,například frakčním kolektorem ISCO/"FOXY" a detektorem píkuISCO 2159 /ISCO, 4700 Superior, Lincoln, Nebraska 68504/.

Frakce se jímají do nádoby o vhodném objemu, například donádob ze sterilního polyethylenu. Zahuštění frakcí se následněprovádí lyofilizací z vymývacího roztoku a následně lyofilizacíz vody. Čistota výsledných frakcí se stanoví chromatografickouanalýzou na analytickém sloupci s gradientovým systémem, který 9 je isokratičtější než systém, používaný k finálnímu čištěnífrakcí.

Struktury odpovídajících frakcí se stanoví známými ana-lytickými postupy, například hmotnostní spektrometrií a nukle-ární magnetickou resonancí. Polypeptidy podle vynálezu seřadí ;o sobě známými postupy. Například S-pyridyl-ethylacecystinového zbytku polypeptidu může probíhat v roztoku, načežse provede řazení aminokyselin polypeptidu. Příkladem takové S-pyridylethylace může být tento postup: asi 1 až lO^ulpolypeptidu se;'rozpustí nebo zředí v až 50 ^ul pufru, připra-veného smíšením 1 dílu 1M TrisHCl, pH 8,5, obsahující 4 mMEDTA a 3 dílů 8M guanidin.HC1. Následně se přidá 2,5 ^ul 10%vodného 2-merkaptoethanolu a směs se -nkubuje při teplotěmístnosti ve tmě a pod argonem dvě hodiny. Po inkubaci sepřidají 2 yUl 4-vinylpyridinu /čerstvé látky, uložené podargonem při -20°C/.a směs se inkubuje další dvě hodiny přiteplotě místnosti ve tmě a pod argonem. Následně se směsodsolí, výhodně chromatografií na krátkém sloupci při zpětnéfázi. Regenerovaný alkylovaný polypeptid se následně řadío sobě známým způsobem. Při provádění způsobu podle vynálezu výše popsaným obecněn i postupem se zjistilo, že vhodným sloupcem pro počáteční frakcionování jedu je C-18 sloupec Vydaéí^ 22 mm x 250 mm, o veli-kosti pórů 300 8 a velikosti částic 10 ^u. Takový sloupecse vymývá při rychlosti proudění 15 ml/min. při použití line- 10

árního gradientového programu 95% -> 80% A, 5 % -> 20% B

/5 -30 min^/ a dále 80% --30% A, 20% -> 70% B /30 --> 55 míru/ kde A je 0,1% vodná kyselina trifluor- octová /TFA/ a B je acetonitril. Pro další analýzu se zvolilo10 frakcí, získaných popsaným způsobem a označených A, B, E, G, Η, I, J, K, L a M. Dále bylo zjištěno, že frakcionacejedu při použití kolony C-18 Vydac^ 22 mm x 250 mm o velikostipórů 300 8 a velikosti částic 10 ^u , vymývaného při rychlosti15 ml/min. při použití lineárního gradientového programu

5% -10% B, 95% -90% A / 0 -> 30 min._/kde A a B mají výše uvedený význam, poskytla dále frakci, označenou A'.Vymývací doby frakcí jsou uvedeny v příkladech 1 a 2.

Frakce A, B, G, H, I/J a L se dále čistí pomocí řady sloupcůa gradientových programů. Podrobné údaje pro každou subfrakcio-naci a získané výsledky jsou uvedeny v příkladech 3, 4, 6, 7, 8 a 10.

Jak je uvedeno v následujících příkladech, frakce k', A^, A2, B^, B2 a E obsahují polyaminové sloučeniny. Tyto slou-čeniny a frakce ve kterých jsou obsaženy, jsou uvedeny v násle-dujícím popisu:

Frakce A' /AGEL 452/:

OH

HO 11

Frakce Αχ /AGEL 468/:

Frakce /AGEL 505/:

Frakce B2 /AGEL 504/: FAB MS: s vysokou rozlišovací schopností: 505.3861vypočteno pro C27H48N6°3’

Frakce E /AGEL 489/:

HO 12

Jak je uvedeno v následujících příkladech, frakce G, H2,I, J, 1^ , L2 a M obsahují polypeptidy. Tyto polypeptidya frakce ve kterých se vyskytují, jsou následující:

Frakce G:

Koncový amin aminokyselinové sekvence obsahuje: H2N-glu-lys-gly-le--pro-glu-gly-ala-glu-cys-asp- gly-asn-glu-ser-asp-cys-lys-cys-ala-gly-gln-trp- ile-lys-cys-arg-cys-pro-trp-lys-trp-his-ile-thr- gly-glu-gly-pro-cys-thr-cys-glu-arg-gly-leu-lys- lys-thr-cys-ile-ser-lys-leu-ser-asp-pro-asn-arg- asn-glu-trp-leu-ser-; molekulová hmotnost celého poly- peptidu je podle FAB MS: 7267.

Frakce H2:

Koncový amin aminokyselinové sekvence obsahuje: H2N-ala-lys-ala-leu-pro-pro-gly-ser- val-cys-asp-gly-asn-glu-ser-asp-cys-lys- cys-tyr-gly-lys-trp-his-lys-cys- arg-cys-pro-trp-lys-trp-his-phe-thr- gly-glu-gly-pro-cys-thr-cys-glu-lys-gly- met-lys-his-thr-cys-ile-thr-lys-leu-his- cys-pro-asn-lys-ala-glu-trp-gly-leu-asp-trp-; molekulová hmotnost celého polypeptidu je podle

Ion-Spray MS: 7793.

Frakce I: 13 H2N-asp-cys-val-gly-glu-ser-gln-gln-cys-ala-asp-trp-ala-gly-pro-his-cys-cys-asp-gly-tyr-cys-thr-cys-arg-tyr-phe-pro-lys-cys-ile-cys-val-asn-asn-asn-CONH2; FABMS: 4158.

Frakce J: H2N-asp-glu-pro-cys-ile-pro-leu-gly-lys-ser-cys-ser-trp-lys-ile-gly-thr-pro-tyr-cys-cys-pro-his-pro-asp-asp-ala-gly-arg-arg-thr-trp-cys-leu-val-asp-tyr-ser-arg-phe-val-thr-ile-cys-ser-gly-arg-lys-tyr-CONH2; FAB MS: 5506.

Frakce :

Koncový amin aminokyselinové sekvence obsahuje: H2N-ile-val-gly-gly-lys-thr-ala-lys-phe- gly-asp-tyr-pro-trp-met-val-ser-ile- gln-gln-lys-asn-lys-lys-gly—ly-phe-asp-; a přibližnámolekulová hmotnost celého polypeptidu je asi 20 000.

Frakce L2:

Polypeptid, získaný postupem podle příkladu 9.

Frakce M:

Koncový amin aminokyselinové sekvence obsahuje:H2N-glu-ala-thr-glu-ala-ala-lys-val-leu-ser-asn-leu-asp-glu-thr-val-asp-pro-; a přibližnámolekulová hmotnost celého polypeptidu je asi 80 000.Na základě analýzy sloučenin, obsažených ve frakcích 14 jedu pavouka Agelenopsis aperta, je nyní možné získat tytosloučeniny rovněž jinými postupy než izolací/vyčištěnímze surového jedu. Všechny takové postupy náleží do rozsahupředkládaného vynálezu. Například polyaminy, obsažené vefrakcích A', Αχ, A2, B1, B2 a E, je možno připravit přímosynthetickými postupy. Polypeptidy, obsažené ve frakcíchG, H2, I, J, , L2 a M a u kterých je popsána celá sekvenceaminokyselin, mohou být připraveny syntheticky in vitroo sobě známými postupy. Tyto polypeptidy mohou být připravenynapříklad v peptidovém syntetizátoru na pevné fázi ABI 43OA/Applied Biosystems, lne., 850 Lincoln Center Drive, FosterCity, California 94404/ při použití standartního postupu podleMerrifielda nebo jiných o sobě známých postupů v pevné fázi.Polypeptidy je možno připravit rovněž pomocí rekombinačníchDNA postupů klonováním značených sekvencí pro polypeptidynebo jejich části. Takové polypeptidy, u kterých je známapouze část aminokyselinové sekvence, mohou být klonoványnapříklad hybrydizačními zkouškami, využívajícími informaciznámé aminokyselinové sekvence. K výrobě polypeptidů podlevynálezu je možno použít kombinaci DNA postupů a syntézyproteinu in vitro..

Je známo, že určité aminokyselinové substituce je možnoprovádět tak, aby neovlivňovaly, nebo podstatně neovlivňovalyfuncki takových polypeptidů. Tyto substituce se mění v závislostina určitém polypeptidů. Stanovení přípustnosti takových substi-tucí se převádí o sobě známými postupy. Takže do rozsahu 15 předkládaného vynálezu náleží všechny polypeptidy, které majív podstatě stejnou sekvenci aminokyselin a v podstatě stejnévlastnosti blokády vápníkového kanálku. V následujícím popisu je uvedeno syntetické schéma určitých polyaminů podle vynálezu vzorce

ve kterém R značípísmeny A až D. H nebo OH. Reakční schéma je označeno

REAKČNÍ SCHÉMA A

(I)

'N-BOC

H (II)

[BOC]2O

(V) + -►

H

BOC

BOC

N-BOC

H (VI)

(BOC)2O ▼

BOC BOC I »

(VII) 1 17

I 18

REAKČNÍ SCHÉMA B

(XI)

BOC (XII)

BOC (XIII) 19

REAKČNÍ SCHÉMA C H3C\

OH N-

H OCH2OCH3

(XVII) h3cz

NH

CH. CH. (XVIII)

(XX) (XIX)

BOC (XXII)

OCH2CH=CH2 (XXI) 20 X + XIII nebo XXII ->

REAKČNÍ SCHÉMA D

BOC BOC

BOC (R’ » H(XIV), R’ » OCH2OCH3(XXIII)]

OH BOC BOC

f I I

BOC

N-BOC

H

BOC

[R* H(XV), R' « OCH2OCH3(XXIV)]

(XXIV ) 21

REAKČNÍ SCHÉMA E

OCH2CH=CH2

REAKČNÍ SCHÉMA F

OH O

OH

OH

(XXIX)

(XXXI)

(XXX) 22

REAKČNÍ SCHÉMA G

+ XXVIII nebo XXXI

(XXXII) nebo

(XXXIII)

BOC

I Ν'

,Ν-BOC

H

BOC

N-BOC

H (XXXIV) nebo

(XXXV) 23 REAKČNf SCHÉMA G /pokračováni/

(XXXVI) nebo

(XXXVII) 24 reakCnJ schéma h

BOC

' N—BOC

(XXXVIII)

XXXVIII + XXII

BOC (XXXIX)

(XL') 25

Podle reakčního schématu A se sloučenina polyaminovéhomeziproduktu vzorce X připraví sekvencí, začínající diamino-butanem. Reakční podmínky, vhodné pro přípravu meziproduktuvzorce X podle reakčního schématu A jsou uvedeny v částechA až I příkladu 11. Reakční schéma B uvádí způsob přípravysloučeniny meziproduktu vzorce XIII. Reakční podmínky, vhodnépro přípravu meziproduktu podle reakčního schématu B jsouuvedeny v příkladu 11, částech J až L. Příprava sloučeninymeziproduktu vzorce XXI je uvedena v reakčním schématu C.

Reakční podmínky, vhodné pro přípravu sloučeniny vzorce XXIpodle reakčního schématu C jsou uvedeny v částech A až Fpř-kladu 12. Přípravy polyaminových sloučenin podle vynálezuvzorce XVI a XXV jsou uvedeny v reakčním schématu D. Reakčnípodmínky, vhodné pro spojování meziproduktů vzorce X a XIIInebo X á XXI a následnou přípravu sloučenin vzorce XVI a XXVjsou uvedeny v příkladu 11, části M až 0 a příkladu 12, částiG až I.

Reakční schéma E a F popisuje způsoby přípravy meziproduktůXXVIII a XXXI. Reakční podmínky, vhodné pro přípravu meziproduktupodle reakčního schématu E jsou uvedeny v částech A až C příkladu 13. Reakční podmínky, vhodné pro přípravu meziproduktupodle reakčního schématu F jsou uvedeny v příkladu 14, částechA až C. Příprava polyaminových sloučenin podle vynálezu vzorceXXXVI a XXXVII jsou uvedeny v reakčním schématu G. Reakční pod-mínky, vhodné pro spojování sloučenin meziproduktu vzorce X aXXVIII nebo X a XXXI a následnou přípravu sloučenin vzorce 26 XXXVI a XXXVII jsou uvedeny v příkladu 13, částech D až F av příkladu 14, částech D až F.

Reakční schéma H uvádí způsob přípravy polyaminové slou-čeniny podle vynálezu vzorce XLI. Reakční podmínky, vhodné propřípravu meziproduktu vzorce XXXVIII, jeho spojování do formys-oučeniny meziproduktu vzorce XXII a následná příprava poly-aminové sloučeniny podle vynálezu vzorce XLI jsou uvedenyv příkladu 15.

Polyaminy podle vynálezu antagonizují vratným způsobemexcitační aminokyselinové neurotransmitery, které působína buňky, například na buňky nervového systému řady organismů,včetně bezobratlých a obratlovců. Termín obratlovci zahrnujesavce. Termín bezobratlí zahrnuje v daném případě napříkladhmyz, ektoparazity a endoparazity. Polyaminy výše uvedenéfrakce rovněž vratným způsobem blokují vápníkové kanálky,přítomné v řadě buněk, například v buňkách nervového systémua svalů, včetně kardiovaskulárního systému bezobratlovců aobratlovců· • Schopnost polyaminů podle předkládaného vynálezu antago-nizovat excitační aminokyselinové neurotransmitery je prokázánajejich schopností blokovat zvyšování obsahu cGMP, vyvolanákyselinou N-methyl-D-asparagovou v malém mozku čerstvě narozenýchkrys podle následujícího postupu. Malé mozky 8-14 dhí starýchkrys Wistar se rychle vyjmou a umístí při 4°C v pufru, tvořeném 27

Krebsovým roztokem a hydrogenuhličitanem sodným, pH 7,4 a následně rozřežou na segmenty 0,5 mm x 0,5 mm pomocí

Mcllwainovy řezačky tkání /The Nickle Laboratory EngineeringCo., Gomshall, Surrey, Anglie/. Segmenty malého mozku se vložído Krebs/bikarbonátového pufru při 37°C. Pufr se kontinuálněudržuje v rovnováze směsí 95:5 02/C02. Segmenty malého mozkuse popsaným způsobem inkubují devadesát minut při třech výměnáchpufru. Závěrem se pufr dekantuje, tkáň -dstředí /1 minutupři 3200 otáčkách za minutu/ a tkáň suspenduje ve 20 mlKrebs/bikarbonátového pufru. Následně se 250 ^ul podílu/přibližně 2 mg/ vyjme a umístí v 1,5 ml mikrozkumavkách. Přidáse 10 /Ul testované sloučeniny ze zásobního roztoku a 10 ^ul 2,5 mM roztoku NMDA k zahájení reakce. Finální koncentraceNMDA je 100 ^uM. Do kontrolních směsí se nepřidává NMDA.

Zkumavky se inkubují jednu minutu při 37°C v třepané vodní 1-zni a následně se k ukončení reakce přidá 750 ^ul 50 mM roztokuTris-Cl, 5mM EDTA. Zkumavky se okamžitě ponoří na pět minutdo vroucí vodní lázně. Obsahy každé zkumavky se následně soni-zují 15 sekund pomocí testovacího sonizátoru při stupni tři. Dále se odebere deset mikrólitrú a protein se stanoví postupempodle Lowry, Anal. Biochem. 100:201-220 /1979/. Zkumavky senásledně odstředí /5 min., 10 000 ot./, 100 ^ul supernatantuse odstraní a obsah cyklického GMP /cC-MF/ se stanoví postupempodle New England Nuclear cGMP RIA zkoušky /Boston, Massachu-setts. Získané údaje jsou uvedeny jako pmol cGMP, generovanéna mg proteinu. 28

Polypeptidy podle vynálezu nevratně blokují vápníkovékanálky, přítomné v různých buňkách, například v buňkáchnervového a svalového systému bezobratlých a obratlovců.

Schopnost polyaminu frakce a polypeptidů frakcí G, , H2, I, J, K, , L2 a M blokovat vápníkové kanálky, se stanovínásledujícím postupem. Rozštěpené krysí neokortikální neuronyse suspendují v Krebsově bikarbonátovém pufru, pH 7,4, obsahu-jícím 2mM CaCl2 a 1 % albuminu z hovězího séra/BSA/. Neuronyse sedimentují ve stejném pufru, který dále obsahuje 1 ^uMfura2/AM /Sigma Chem. Co., P.O.Box 14508, St. Louis, Missouri63178/. Buňky se inkubují dalších 15 minut ve stejném pufruale bez fura2/AM. Následně se buňky promyjí v uvedeném pufru,ale tentokrát s obsahem 1,5 mM CaCl2 a udržují v rovnovázepři teplotě místnosti ve formě koncentrované buněčné suspense5 až 10 minut. Do kyvety z křemenného skla se nalije 1,2 mlpředehřátého /37°C/ pufru bez obsahu ESA, obsahujícího 1,5 mMCa.Cl2 a 10 mM glukózy a následně 0,3 ml koncentrované buněčnésuspense, připravené výše uvedeným postupem. Kyveta se umístív termostatovaném /37°C/ držáku, opatřeném magnetickým míchadlema fluorescenčním spektrofotometrem, například Perkin Elmer650-40 /Perkin Elmer, Wilton, Connecticut 06897/ se měřífluorescence. Fluorescenční signál se ponechá stabilizovatasi jednu minutu. Následně se do kyvety přidá 1-4 ^ul zásobníhoroztoku testované sloučeniny v Krebsově bikarbonátovém pufruo vhodné koncentraci. Kalibrace fluorescenčních signálůa korekce rozptylu fura-2 se provádějí postupem podle Nemethaa kol., J. Biol. Chem. 262:5188 /1987/. Po ukončení každého testu 29 se stanoví maximální hodnota fluorescence /Fmax/ přídavkemionomycinu a minimální hodnota fluorescence /Fmin/ se stanovínásledným přídavkem 5 mM EGTA k vápníkovému cHeiátu. Při použitípopsaného postupu se blokování vápníkového kanálku účinkemtestované sloučeniny projeví snížením fluorescence po přídavkutestované sloučeniny.

Do rozsahu daného vynálezu náleží rovněž polypeptidy,mající, v podstatě stejnou sekvenci aminokyselin jako polypeptidyfrakcí G, , I, J, L , L2 a M a které mají stejný blokujícíúčinek na vápníkové kanálky jako uvedené polypeptidy.

Polyaminy podle vynálezu působí antagonicky na excitačníaminokyselinové neurotransmitery. Proto jsou tyto polyaminyvhodné k hubení bezobratlých škůdců a k léčení chorob a stavů,způsobených poruchami axcitačních aminokyselinových neurotrans-miterů u savců, jako je mrtvice, záchvaty, mozková ischemie,nervové degenerační poruchy, například Alzheimerova chorobaa epilepsie. Uvedené polyaminy jsou rovněž vhodnými psycho-terapeutiky savců. Uvedené polyaminy jsou rovněž vhodné kestudiu fyziologie buněk, například buněk nervového systému.

Polyaminy frakce a polypeptidy podle vynálezu jsou vhodné ·k blokování vápníkových kanálků a proto nacházejí uplatněnípři hubení bezobratlých škůdců a při léčení chorob a stavů,způs-bených funkcí vápníkových kanálků u savců, jako je angina,hypertense, kardiomyopathie, supraventrikulární arytmie, aeso-phogeální achalásie, předčasný porod a Raynaudova choroba.

Kromě toho jsou tyto sloučeniny vhodné při studiu fyziologiebuněk, včetně buněk nervového a svalového systému. 30

Do rozsahu předkládaného vynálezu náleží rovněž farma-ceuticky přípustné soli polyaminů a polypeptidů podle vynálezu.Tyto soli se připravují o sobě známými postupy. Tak mohou býtběžnými postupy připraveny kyselé adiční soli polyaminů a bazickésoli polyppetidů.

Polyamin nebo polypeptid podle vynálezu může být savcůmpodáván samotný nebo ve směsi s farmaceuticky přípustnýminosiči nebo ředidly ve farmaceutických přípravcích, běžně pou-žívaných pro daný účel. Polyaminy a polypeptidy mohou být podá-vány orálně nebo parenterálně, přičemž v případě polypeptidůje dávána přednost parenterálnímu způsobu podávání. Parenterálnípodávání zahnuje intravenózní , intramuskulární, intraperito-neální, subkutánní a topikální podávání. Při orálním způsobu podávání, polyaminů nebo polypeptidůpodle vynálezu mohou být uvedené sloučeniny například obsaženyv tabletách nebo kapslích nebo ve vodných roztocích nebo sus-penzích. V případě tablet pro orální aplikaci se běžně používajínosiče, jako je například laktóza á kukuřičný škrob a mazadla,jako je například stearát hořečnatý. Pro orální aplikaci v podoběkapslí jsou vhodnými ředidly laktóza a sušený kukuřičný škrob.

Ve vodných suspenzích je účinná složka smíšena s emulgátoremnebo suspendačním činidlem. Do výsledného přípravku je možnopřidat sladidla a/nebo příchutě.

Pro intramuskulární, intraperitoneální, subkutánní a intra-venózní použití se připraví sterilní roztoky účinné složky a pHroztoků se upraví pufrem. Pro intravenózní použití je nutnozajistit, aby byl roztok isotonický. 31 Při použití polyaminu nebo polypeptidu nebo jejich solípodle vynálezu v humánní medicíně určí denní dávku ošetřujícílékař. Dávka se bude měnit v závislosti na věku, hmotnosti,a individuální odezvy každého pacienta, stejně jako v závislostina symptomech pacienta a síle konkrétního přípravku. Při použití polyaminu nebo polypeptidu nebo jejich solípodle vynálezu k hubení bezobratlých škůdců se uvedená sloučeninapodává škůdcům přímo nebo se umístí v prostředí výskytu těchtobezobratlých. Tak může být sloučenina podle vynálezu nastříkánave formě roztoku na škůdce. Množství sloučeniny, nezbytné k hubeníbezobratlých škůdců se bude měnit v závislosti na konkrétnímbezobratlém organismu a podmínkách prostředí a musí být určenoosobou, používající tuto sloučeninu. Při použití polyaminu nebo polypeptidu nebo jejich solípodle vynálezu ke studiu fysiologie buněk se uvedené sloučeninyaplikují na buňky o sobě známými postupy. Tak mohou být uvede-né sloučeniny aplikovány ve vhodném fyziologickém pufru.

Vhodná koncentrace sloučenin podle vynálezu pro taková studiaje 100 /UM. Koncentrace těchto látek však může být na jedné straněvyšší nebo naopak mnohem nižší než 100 ^uM. Konkrétní množstvípoužité sloučeniny se pro daný účel stanoví individuálně. 32 Příklad 1

Počáteční frakcionace surového jedu pavouka Agelenopsis aperta

Surový jed pavouka Agelenopsis aperta, získaný od firmyNatural Product Sciences lne., Salt Lake City, Utah 84108a uložený ve zmrazeném stavu při teplotě asi -78°C se rozmrazía 10 až 60 /Ul dávky tohoto jedu, zředěné na 200 /Ul se vložína sloupec C-18 Vydac^ /22 mm x 250 mm, o velikosti pórů300 8 a velikosti částic 10 ^u/ a vymývají při rychlostiproudění 15 ml/min. systémem rozpouštědel při použití lineár-ního gradientového programu 5% -20% B, 95% --r 80% A

/"o ->- 30 min._7 a následně'£.0% -r 70% B, 80% -30% A

/~30 -> 55 min._/ kde A značí 0,1% vodný roztok TFA a B ✓ značí acetonitril. Stanoven1 píku se provádí monochromatickypři 220-230 nm a frakce se jímají ve sběrači frakcí ISC0/"F0XY"a detektoru píku ISCO 2159. Frakce se jímají 20 až 60 minut. V závislosti na detekci píku byly jímány následující frakce:

Frakce Doba vymývání A asi 21 minut B asi 22,75 minut E asi 27,5 minut G asi 38 minut H asi 39 minut I asi 40 minut J asi 40 minut L asi 43 minut p ř i k i ad 2

Frakcionace surového jedu pavouka Agelenopslsaperta k získání frakce A*

Surový jed pavouka Agélenopsis aperta se vloží na kolonu fR-') C-18 Vydac^—', popsanou v příkladu 1. Kolona se vymývá přirychlosti 15 ml/min. systémem rozpouštědel podle lineárního gradientového programu 5% -10% B, 95% -> A ^5 '-30 mir.._/ kde A značí 0,1% vodný roztok TFA a B značí acetonitril.Stanovení píku a jímání frakcí se provádí postupem, popsanýmv příkladu 1. Frakce A'byla vymyta asi za 12,5 minuty. Prospektrální analýzu se frakce A^následně lycfilizuje z vymývacíhoroztoku z destilované vody podle standardních postupů.

Struktura sloučeniny, obsažené ve frakci A', se stanovípostupem podle FAB MS. Získané hodnoty jsou tyto: A': FAB MS: M/Z 453 /M+l/

Struktura: benzamid, N-/20-amino-4-hydroxy-4,8,12,17-tetraazeicos-l-yl/-4-hydroxy

HO 34 p ř i fc 1 a d 3

Subfrakcionace frakce A a stanovení její struktury

Frakce A, získaná v příkladu 1 se vloží na kolonu C-4Vydac^S^ /10 mm x 250 mm o velikosti pórů 300 S a velikostičástic 5 ^u/ a vymývá při rychlosti 4,0 ml/min systémem rozpouštědel s gradientovým programem 0% - 10% B, 100% -

90% A /0 - 30 min._7 kde A značí 0,1% vodný roztok TFA a B značí acetonitril. Stanovení, píku se provádí při použití « diodového detektoru Waters 990 a jímání frakcí probíhá postupem,popsaným v příkladu 1. Dvě získané frakce vykazují následujícícharakteristiky:

Frakce Doba vymýváni A^ asi 7 minut A2 asi 9 minut

Frakce A^ a A2 byly následně upraveny pro spektrální ana-lýzu lyofilizací z vymývacího roztoku z vody podle standartníchpostupů.

Struktura sloučenin, obsažených ve frakcích A^ a A2 senásledně stanoví pomocí FAB MS. Získané hodnoty jsou následující

Al: FAB MS: M/Z 469 /M+l/, vysoké rozlišení: 469.3863 vypočteno pro C^H^N^O s chybou 2,0 mitýustruktura: benzamid, N-/20-amino-4-hydroxy-4,8,12,17-tetraazeicos-l-yl/-2,5-dihydroxy 35

FAB MS:M/Z 449 /M+l/, 433, 376, 260, 203

Struktura: lH-indol-3-acetamid, N-/16-amino-4-hydroxy-4,8,137triazahexadec-l-yl/-4-hydroxy

P ř í k 1 a d 4

Subfrakciónace frakceB a stanovení její struktury

Frakce B, získaná postupem podle příkladu 1 se vloží na V) n kolonu C-4 Vydac^-^/22 mm x 250 mm, velikost pórů 300 A a ve-likost částic 10 /U/ a vymývá při rychlosti 15 ml/min. systémem rozpouštědel s nelineárním gradientovým programem 0% - 0% B, 100% -*· 100% A [_ 0 ->· 5 min._/ a následně 0% -> 10% B, 100% -> 90% A / 5 —-^-20 min._7/vodní křivky 1/, následně 10% -?· 20% B, 90% -> 80% A /“20 -z” 30 min._/ /vodní křivka 11/ kde A značí 0,1% vodný roztok TFA a B je 36 acetonitril. Stanovení píku se provádí pomocí diodového de-tektoru Waters 990 a jímání frakcí postupem, popsaným v příkladu 1Získané dvě frakce vykazují tyto hodnoty:

Frakce Doba vymývání asi 18,5 minut B2 asi 21,5 minut

Tyto frakce se následně upraví pro spektrální analýzulyofilizací z vymývacího roztoku, následovanou lyofilizací2 vody podle standartního postupu.

Struktura sloučeniny, obsažené ve frakci se stanovípomocí FAB MS. Získané hodnoty jsou následující: FAB MS:M/Z 506 Λΐ+1/, 489, 461, 433, 378, 333, 260, 231, 215, 203, 155, 119 vysoká rozlišovací schopnost: 506.3810 vypočteno pro C26H48N7°3

Struktura: lH-indol-3-acetamid, N-/20-amino-4-hydroxy- 4,8,12,l7-tetraazeicos-l-yl/-4-hydroxy

Molekulová hmotnost sloučeniny, obsažené ve frakci B2byla stanovena pomocí FAB MS s nesledujícími výsledky: FAB MS: vysoké rozlišení: 505.3861 vypočteno pro C27H48N6°3* - 37 - P ř í k 1 a d 5

Struktura sloučeniny/ obsažené ve frakci E

Frakce E, získaná postupem podle příkladu 1,byla upravena pro spektrální analýzu lyofilízací z vymývacího roztoku a násled ně lyofilízací z vody pomocí standardních postupů. Struktura sloučeniny, obsažené ve frakci E byla stanovena pomocí FAB MS, 1 13 H-NMR a .C-NMR. Získané hodnoty a odvozená struktura jsoutyto: FAB MS:M/Z 490 /M+l/, 472, 433, 362, 333, 260, 215, 203, 177, 155, 119 vysoké rozlišení: 490.3860 vypočteno pro C26H48N7°2s chybou O,6 miiýu 3H-NMR /500 Mhz, d6-DMS0/; 10,89 /s, 1H/, 8,90-7,85 /m, 6H/, 7',_5 /d, J=8,0 Hz, 1H/, 7,34 /d, J=8,0 Hz, 1H/, 7,19 /s, 1H/, 7,08 /dd, JZ8,0 Hz, J=8,0 Hz, 1H/, 6/98/dd, Jz8,0

Hz, J-8,0 Hz, 1H/, 3,50 /s, 2H/, 3,13 /m, 2H/, 3,03-2,82 /m, 18H/, 1,88 /m, 6H/, 1,78 /m, 2H/, 1,62 /m, 4H/ 13C-NMR /125,76 Mhz, d6-DMS0/: 170,94, 136,10, 127,17, 123,75, 120,92, 118,67, 118,26, 111,33, 108,97, 57,39, 57,07, 46,12, 46,12, 44,06, 43,89, 43,89, 36,52, 36,22, 32,78, 26,71, 23,79, 23,06, 22,65, 22,65, 22,45

Struktura: lH-indol-3-acetamid, N-/20-amino- 4-hydroxy-4,8,12,17-tetraazeicos-l-yl/ 38

Alternativně a s výhodou se surový jed frakcionujepostupem podle příkladu 1 s tou výjimkou, že se použijesystém roztpouštědel a lineární gradientní program 0% -20% B, 100 % -^80% A {0 -^>30 min._/s detekcí píku při 220 nm. Frakce, která se vymyje přibližně během26,0 minut, se vloží na kolonu Dynamax Fenyl /4,6 mm x 250 mm,s velikostí pórů 60 8 a velikostí částic 8 ^u/ a vymývápři rychlosti 1 ml/min. a při isokratických podmínkách 10% B, 90% A kde A a B mají význam, popsaný v příkladu 1. Stanovenípíku se provádí pomocí diodového detektotu Waters 990 /X -220 nm/ a frakce se jímají postupem podle příkladu 1. Frakce,které se vymyje přibližně během 55,27 minut se lyofilizujez vymývacího roztoku a následně z vody podle standardních postupů, čímž se získá sloučenina podle tohoto příkladu. Příklad 6

Subfrakcionace frakce G

Frakce G, získaná postupem, popsaným v příkladu 1 se vložína kolonu C-18 Vydac^—' /22 mm x 250 mm, s velikostí pórů300 8 a velikostí částic 10 ^u/ a vymývá při rychlosti 10 ml/mi systémem rozpouštědel při použití nelineárního gradientového programu 20% -> 30% B, 80% -^70% A {Q -> 40 min ..7 /vodní křivka 6/ a při použití diodového detektoru Waters 990tFrakce se jímají postupem, popsaným v příkladu 1. Frakce Gse po popsané subfrakcionaci vymyje ze sloupce kolony běhemasi 22 minut. Tato frakce, obsahující polypeptid, se následněpřipraví pro spojování lyofilizací z vymývacího rozpouštědlaa následnou lyofilizací z vody o sobě známými postupy.

Analýza aminokyselin alkylovaného polypeptidu z frakcese provádí postupem podle Waters Pico-Tag. Sekvenční hodnotyse stanoví sekvencerem Protein/peptid model 47OA výrobceApplied Biosystems, lne., 850 Lincoln Center Drive, Foster City,California 94404/ s konverzí vodným roztokem TFA. Analýzavýsledných fenylthiohydantoinových aminokyselin se provádíon line s analyzátorem výrobce Appl-ed Biosystems model 120APTH nebo off line na koloně DuPont Zorbax PTH /BiomedicalProduct Department, Chromatography Products, E. I. duPontde Nemours and Co., Inc., 1007 Markét Street, Wilmington,Delaware 19898/.

Analýza aminokyselin a FAB MS celého polypeptidu prokázalynásledující strukturu koncového aminu aminokyselinové sekvencečásti polypeptidu, obsaženého ve frakci G: l^N-glu-lys-gly-leu-pro-glu-gly-ala-glu-cys-asp-gly-asn-glu-ser-asp-cys-lys-cys-ala-gly-gln-trp-ile-lys-cys-arg-cys-pro-trp-lys-trp-his-ile-thr-gly-glu-gly-pro-cys-thr-cys-gl—arg-gly-leu-lys-lys-thr-cys-ile-ser-lys-leu-ser-asp-pro-asn-arg-asn-glu-trp-leu-ser-; a FAB S: 7267. 40 Přiklad 7

Subfracionace frakce H a stanoveni její struktury

Frakce H, získaná postupem podle příkladu 1, se vložína C-18 kolonu Vydac® /22 mm x 250 mm, velikost pórů 300 8a velikost částic 10 ^u/ a vymývá při rychlosti proudění10 ml/min. systémem rozpouštědel při použití nelineárního

gradientního programu 20% -25% B, 80% ->-75% A Z o -30 min._7/vodní křivka 6/ * následně 25% - 50% B, 75% -50% A /30 -45 min._7(vodní křivka 11), kde A je 0,1% TPA a B značí acetonitril a při použití diodovéhodetektoru ffaters 990 · Frakce se jímají postupem, popsanýmv příkladu 1. Z jímaných frakcí jsou důležité tyto:

Frakce Doba vymýváni H2 asi 36 minut asi 41 minut

Frakce Hg a obsahující polypeptidy, byly následněupraveny pro spojování a spojovány postupem, popsaným v pří-kladu 6. *ový terminál aminokyselinové sekvence části poly-peptidu, obsažené ve frakci H^, byl stanoven takto: H^N-ala-lys-ala-leu-pro-pro-gly-ser- val-cys-asp-gly-asn-glu-ser-asp-cys-lys- cys-tyr-gly-lye-trp-his-lys-cys- arg-cys-pro-trp-lys-trp-his-phe-thr- gly-glu-gjjr-pro-cys-thr-cys-glu-lys-gly- 41 met-lys-his-thr-cys-ile-thr-lys-leu-his-cys-pro-asn-lys-ala-glu-trp-gly-leu-asp-trp-ja molekulová hmotnost oelého polypeptidu byla stanovena pomocí Ion-Spray MS na 7793. Přiklad 8

Subfrakclonace frakci I a J a stanovení jejich struktury

Frakce I a J, získané postupem podle příkladu 1, kterénebyly dostatečně odděleny v důsledku podobných vymývacíchdob, jak je uvedeno v příkladu 1, byly společně umístěnyna sloupci kolony C-4 Vydacv~>(22 mm x 250 mm, s velikostípórů 300 X a velikostí částic 10/u) a vymývány při rychlostiproudění 10 ml/min. systémem rozpouštědel při použití nelineárního gradientového programu 20% -30%. B, 80% - 70% A /0 -> 30 min._7( vodní křivka 6) a dále 30% - 50% B, 70% - 50% A ^30 —45 min._7(vodní křivka 11) kde A značí 0,1% vědný roztok TFA a B je acetonitril. Stanovenípíku a jímání frakcí se provádí postupem, popsaným v příkladu 6Z jímaných frakcí byly zajímavé tyto:

Frakce Doba vymývání I asi 22 minut J asi 27,5 minut

Frakce I a J, které obsahují polypeptidy, se připravípro spojování a spojují postupem, popsaným v příkladu 6. 42 -

Aminokyselinová sekvence a FAB MS polypeptidu,obsaženého ve frakci I, byly stanoveny takto: H2N-asp-cys-val-gly-glu-ser-gln-gln-cys-ala-asp-trp-ala-gly-pre-his-cys-cys-asp-gly-tyr-tyr-cys-thr-cys-arg-tyr-phe-pre-lys-cys-cys-ile-cys-val-asn-asn-asn-CONH^ aPAB MS: 4158.

Koncový amin aminokyselinové sekvence části polypeptidua PAB MS celého polypeptidu, obsaženého ve fl?akci J byly stanevény takto: H2N-asp-glu-pro-cys-ile-pro-leu-gly-lys- ser-cys-ser-trp-lys-ile-gly-thr-pro-tyr- cys-cys-pre-his-pro-asp-asp-ala-gly-arg- arg-thr-trp-cys-leu-val-asp-tyr-ser-arg- phe-val-thr-ile-cys-ser-gly-arg-lys-tyr-CONHgj a PAB MS: 5506. Přiklad 9

Subfrakcionace frakce L a stanovení její struktury

Frakce L, získaná postupem podle příkladu 1 se vložína sloupec kolony C-18 Vydacv—(10 mm x 250 mm, velikostpórů 300 X a velikost částic 5 /U) a vymyla při rychlostiproudění 3,5 ml/min. systémem rozpouštědel s lineárním gradient ním programem 25%-40% B, 75% -60% A /0 —30 min._7 kde A značí 0,1% vodný roztok TPA a B je acetonitril. - 43 -

Stanovení píku * jímání frakcí se převáděl· postupem, popsanýmv příkladu 6. Z jímaných frakcí byly zajímavé tyt· frakce:

Prakce Doba vymývání L.j asi 20,25 minut

Lg aei 22,5 minut

Prakce L·^ a L·^, které obsahují polypeptidy, bylypřepraveny pře spojování a spojovány postupem, popsanýmv příkladu 6.

Koncový amin aminokyselinové sekvence části polypeptidu, obsaženého ve frakci L1 byl stanoven takto: • ·

HgN-ile-val-gly-gly-lys-thr-ala-lys-phe- gly-asp-tyr-pro-trp-met-val-ser-ile- gln-gln-lys-asn-lys-gly-gly-phe-asp- a molekulová hmotnost celého polypeptidu byla stanovenagelovou elektroforézou známými postupy na 20,000. Přiklad 10

Stanoveni struktury sloučeniny, obsažené ve frakci M

Prakce M, získaná postupem podle příkladu 1 a obsahujícípolypeptid, byla připravena pro spojování a spojována postupem,popsaným v příkladu 6.

Koncový amin aminokyselinové sekvence části polypeptidu,obsaženého ve frakci M, byl stanoven takto: 44 -

HgN-glu-ala-thr-glu-ala-ala-lys-val-leu- ser-asn-leu-asp-glu-thr-val-asp-pro- a molekulová hmotnost, stanovená o sobě známým postupemgelovou elektroforézou, byla asi 80,000. Přiklad 11 1H-indol-3-acetamid, N-(20-amino-4-hydroxy-4,8,12,17-tetraazeicos-1-yl

Syntéza titulní sloučeniny, která byla stanovena jakosoučást frakce E, popsané v příkladu E, se provádí následujícímzpůsobem

(I) V atmosféře dusíku se míchá 13,22 g (0,15 mol) diamino-butanu a 3,5 ml metanolu a po dobu dvou hodin se při chlazenína 0 - 5*C přidává injekční stříkačkou 5,94 ml (0,15 mol)akry1onitrilu. Asi po 18 hodinách se směs chromatografuje na600 g silikagelu při použití systému rozpouštědel 3:1 CH^Clg/MeOH (2 litry) a následně 3:1 CHgClg/MeOH s obsahem 5 obj. %isopropylaminu (2 litry). Frakce, obsahující spojený produktse zahustí odpařením ve vakuu za vzniku viskozního oleje. NMR analýza potvrdila, že se jedná o spojený produkt vzorce I. 45 - Η

(III) V atmosféře dusíku se přidá 5,78 g (0,041 mel) sloučeninyvzorce I, připravené postupem podle Části A výše, k 75 mlCH-jCN a 11,48 g KF Celitu a reakční směs se míchá. K míchanésměsi se přidá roztok 9,75 g (0,041 mol) sloučeniny vzorce II,připravené postupem, popsaným v části A ve 25 ml CH-jCN. Re-akční směs se zahřívá k refluxu a monitoruje TLC (3:1CHgClg/MeOH). Po třech hodinách se nechá reakční směs zchladnouta nechá stát při teplotě místnosti. Následně se Celit odfiltrujea filtrační koláč dobře promyje dichlormetanem. Filtrát sezahustí ve vakuu. Surový produkt, obsažený v zahuštěném fil-trátu se chromatograluje na silikagelu a vymyje 2 litry 3:1CHgClg/MeOH a následně 2 litry 3:1 CHgClg/MeOH a 30 ml isopro-pylaminu. Produkt, vymytý ze sloupce po nasycení sloupce iso-propylaminem, byl však stále nečistý. Všechny frakce produktuse spojí a zahustí. Silikagel se připraví rozmícháním 500 gsilikagelu v CHgClg a 125 ml isopropylaminu a nanesením nasloupec o sobě známým způsobem. Surový produkt se nanese nakolonu pomocí dichlořmetanu. Následně se kolona promyje 500 mldichlořmetanu a dále jedním litrem 3:1 CH^Clg/MeOH. Frakce - 46 - produktu se spojí a zahustí ve vakuu za vzniku 1,5 g produktuvzorce III. Další 2 g produktu vzorce III se vymyjí ze sloupcejedním litrem 3;1 CHgClg/MeOH a 30 ml isopropylaminu. c. ni + [boc]2o -►

BOC

(IV) V dusíkové atmosfcře se míchá 3,5 g (11,3 mmol) sloučeninyvzorce III, připravené postupem podle části B a 150 ml dichlor-metanu, načež se přidá 5,2 g (23,6 mmol) di-t-butyldikarbonátu.Směs se míchá přibližně 68 hodin při teplotě místnosti. Následněse směs zahustí ve vakuu a chromatografuje na 400 g silikagelua vymyje 60:40 směsí hexanu/ethylacetátu za vzniku 5,62 gsloučeniny vzorce IV v podobě oleje.

D. BOC

BOC (V) - 47 - V atmosféře dusíku se rozpustí 3,0 g sloučeniny vzerce IV,připravené postupem podle části C, ve 30 ml kyseliny octovéve 250 ml Parrevě^-^ baňce· K rozteku se přidá 3,0 gPd(0H)2/uhlíku a směs se hydrogenuje za tlaku 50 p.s.i. H2dvě hodiny. Následně se katalyzátor odstraní a koláč dobřepromyje kyselinou octovou. Filtrát se zahustí, vyjme v 75 mldichlormetanu, promyje dvakrát 75 ml 1N NaOH a vysuší nadK2C®3* ee zahustí ve vakuu za vzniku 2,86 g produktu vzorce V. E. V + -—>

Nxz'\X\N-B0CBOC H (VI)

V atmosféře dusíku se rozpustí 2,86 g (5,7 mmol) slou-čeniny vzerce V, připravené postupem podle části D, v 75 mlmetanolu. Za míchání se přidá 0,41 ml (6,3 mmol) akrylonitrilua reakční směs se míchá přes noc. Následně sereakční směszahustí, rekencentruje třikrát 30 ml dichlormetanu a rozpou-štědle se edstripuje ve vakuu za vzniku 3,18 g sloučeniny vzorceVI v podobě oleje. - 48 - F. VI -►

BOC BOC « ·

NN - BOC

BOC (VII) V dusíkové atmosÉře se smísí 3,18 g (5,7 mrael) sloučeninyvzorce VI, připravené podle části E, se 100 ml dichlermetanua míchá se. do rozpuštění. K takto získanému rozteku se přidá1,37 g (6,3 mmel) di-t-butyldikarbonátu a reakční směs semíchá 90 minut při teplotě místnosti. Následně se reakčnísměs zahustí a chremategrafuje na 300 g silikagelu a vymyjesměsí 60:40 hexanu/ethylacetátu. Frakce produktu se spojí,zahustí, extrahují 3 x 20 ml dichlermetanu a rozpouštědlose odstripuje ve vakuu za vzniku 3,12 g produktu vzorce VII.

Postupem podle části D se rozpustí 3,12 g (4,76 mmel)sloučeniny vzorce VII, připravené postupem F ve 30 mlkyseliny octové a hydrogenuje při 55 p.s.I. 2 hodiny v pří-tomnosti 3,0 g Pd(0H)2/uhlíku za vzniku 3,02 g produktuvzorce VIII v podobě oleje. - 49 - Η. VIII + NC^x^» -:->

„ BOC BOC

Η I I

• boc *’B0C (IX) v dusíkové atmosféře se rozpustí 1,0 g (1,5 mraol)sloučeniny vzorce VIII, připravené podle části G, uv 10 ml raethanolu. K tomuto roztoku se přidá 0,1 ml (1,67 ramol)akry1onitrilu a reakční směs se míchá přes noc. Následné sereakční směs zahustí, rozředí třikrát 20 ml dichlormetanua rozpouštědlo se odstripuje ve vakuu za vzniku 1,0 g pro-duktu vzorce IX. I. ix

Postupem popsaným v části D se rozpustí 1,0 g (1,4 mmol)sloučeniny vzorce IX, připravené postupem v části H, ve 30 mlkyseliny octové a hydrogenuje 2,5 hodiny při tlaku 50 p.s.i.za vzniku 0,85 g produktu vzorce X. - 50 -

Η

Roztek, obsahující 6,78 (20 mmol) tetrabutylamraenium-hydrogensíranu a 75 ml HgO se připraví mícháním reakčníchsložek, načež se přidá 3,36 g (40 mmel) NaHCO^ a reakční směsse nechá vypěnit. Dále se přidá 3,5 g (20 mmel) kyselinyindolylectové, směs se míchá 5 minut a přidá se 75 ml CHCl^.Směs se míchá dalších 5 minut a dvě vrstvy na dně se oddělí.Vodní vrstva se vyseli NagSO^ a extrahuje CHCl^. VšechnyCHCl^ extrakty se spojí a vysuší nad NagSO^. Výsledný čirýjantarově zbarvený roztek se zahustí, vyjme 3 x 75 ml ace-tonu a závěrem rozpustí v 75 ml acetonu. Následně se přidá1,9 ml (22 mmol) allybremidu a směs se nechá stát 30 minut.Směs se zahustí a chromatografuje na silikagelu a vymyjesměsí 3:1 hexan/etylacetát za vzniku 3,57 g produktu .vzorceXI ve formě světležlutéhe oleje. K.

XI

BOC

Postupem, popsaným v Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 23:298 (XII) - 51 - (1984) se emíeí 2,15 g (10 omel) sloučeniny vzorce XI,připravené postupem pedle části J, se 20 ml acetenitrilua ke směsi se přidá 2,61 g (12 mmol) di-t-butyldiuhličitanu.Dále se přidá 0,122 g (1 mmol) 4-(N,N-dimethylaraino)pyri-dinu a reakce se ponechá probíhat 15 minut. Následně se směszředí na 125 ml ethylacetátem, promyje 2 x zředěnou HC1, 3 x 25 ml HgO, ,1 x solankou, vysuší a zahustí. Produkt sevyčistí chromatografií na silikagelu a vymyje směsí 14,5:1hexanu a ethylacetátu za vzniku 2,87 g sloučeniny vzorce XIIv podobě bezbarvého oleje.

(XIII) K 3,27 g (10,4 mmol) sloučeniny vzorce XII, připravenépodle části K, ve 20 ml dichlormetanu se přidá 7,4 ml 2-ethylhexanoátu sodného v etylacetátu (0,231 g/ral). Následněse přidá 0,5 g 0^P a 0,5 g ^^PJ^Pd a směs se míchá 60 minut.Směs se zahustí, vyjme ve 150 ml ethylacetátu a promyje5 x 25 ml HgO. Vodné extrakty se spojí a zpětně extrahují1 x 25 ml ethylacetátu a 1 x 25 ml diethyletheru. K vodnívrstvě se přidá 75 ml čerstvého ethylacetátu a směs se okyselí - 52 - na pH 3. Ethylacetátová vrstva se eddělí a vodní vrstvaextrahuje 1 x 50 ml čerstvého ethylacetátu. Dva ethylacetá-tové extrakty se spojí a promyjí 2 x 20 ml HgO, následně1 x 20 ml solankou, vysuší, zahustí, premyjí 3 x 30 mlhexanu, přičemž se během druhého promytí vytvářejí krystaly.Směs se zředí na 75 ml hexanem. Pevné podíly se přefiltrují,debře premyjí hexanem a vysuší na vzduchu za vzniku 1,37 gbílé pevné látky. NMR potvrdila titulní strukturu vzorce XIII.

Μ. XIII

(XIV) V atmosféře dusíku se smísí 200 mg (0,73 mmel) slouče-niny vzorce XIII s 25 ml dichlormetanu, 84 mg (0,73 mmel)N-hydroxysukcinimudu a 150 mg (0,73 mmol) dicyklehexylkarbediimidu, načež se vytvoří téměř okamžitě sraženina. Směs semíchá 3 hodiny. Následně se dicyklohexylmočevina odfiltrujea k filtrátu se přikapává 40 ml roztoku sloučeniny vzorce X,připraveného podle příkladu 11, části A-I v dichlormetanu.

Směs se míchá 12 hodin a následně promyje 0,1 NaOH a vysušína KgCOp zahustí a chromatografuje na 150 g silikagelua vymyje směsí 9:1 dichlormetanu a methanolu (0,5 litru)

I -53- k odstranění nečistot a následně směsí 9:1:0,1 dichlormetanu,metanolu a isopropylaminu (2 litry). Produkt se následnězahustí, promyje dichlormetanem a dále zahustí za vzniku 400 mg N. ' XIV -►

(xv) V dusíkové atmosféře se smísí 0,34 g (0,35 mmol)sloučeniny vzorce XIV, připravené postupem podle výše uvedenéhoschématu, se 30 ml acetonu, rozmíchá do roztoku a ochladí asina 0°C v lázni ledu a acetonu. Následně se po dobu 8-10 minutpřikapává 0,212 g (1,05 mmol) 85% kyseliny 3-chloroperoxy-benzoové ve 20 ml acetonu. Reakční směs se míchá 30 minuta následně zředí na 150 ml dietyleterem a promyje 2 x 25 mlHgO a vysuší nad KgCO^. Směs se zahustí, promyje 2 x 30 mldichlormetanu a zahustí ve vakuu na stálou hmotnost 0,33 g. NMR analýza prokázala, že produkt je směsí požadovanéhoproduktu vzorce XV, výchozího materiálu a vedlejšího produktu.Směs produktu se přidá ke 3 ml kyseliny octové, načež sepřidá 20 mg NaCNBH^. Směs se míchá přes noc, kyselina octováse ve vakuu odstripuje, promyje v 50 ml dichlormetanu a promyje-1 x 75 ml vodným pufrem, pH 7. V případě potřeby se pH nastavína -hodnotu 7 1N NaOH a dichlormetanová vrstva se oddělía promyje 1 x 50 ml vodným pufrem, pH 7 a 1 x 25 ml solankou, - 54 - vysuší nad Na2S0^ a zahustí ve vakuu do konstantní hmotnosti0,31 g. Získaný produkt se chromatogrsCije na 100 g silika-gelu při použití směsi 95:5 ethyleacetátu a metanolu k vymytíproduktu a získání 25 ml frakcí. Vyčištěný produkt vzorce XVodchází v ÍO&amp;Í8&amp; 18-25· Tyto ilíij se spojí, zahustí, pro- myjí 2 x 5 ml dichlormetanem a zahustí ve vakuu za vzniku68 mg bílé pěny, která se uloží při -80*C. Šarže 26-40, kterérovněž obsahují požadovaný produkt, obsahují také určiténečistoty. Šarže 26-40 se spojí, zahustí, promyjí dichlor-metanem a zahustí ve vakuu do konstantní hmotnosti 66 mg.Produkt, takto získaný, se spojí s předchozím produktem(6 mg), který byl použit pro NMR studia a se směsí, připravenouvýše uvedeným postupem. Výsledná směs se chromatografuje na75 g silikagelu a vymyje směsí 9:5 ethylacetátu a metanolua shromáždí ve 25 ml frakcích. Vyčištěný produkt vzorce XVbyl přítomen v šaržích 16-21. Tyto šarže se spojí, zahustí,promyjí 2 x 5 ml dichlometánu a zahustí ve vakuu do konstantníhmotnosti 46 mg. Produkt se uchová při -80*1 C. o. xv

(XVI) - 55 - V dusíkové atmosféře se rozpustí 108 mg (0,109 mmol)sloučeniny vzorce XT, připravené výše uvedeným postupem,v 1,5 ml dichlořmetanu. Následně se přidají 2 ml kyselinytrifluoroctové a směs se míchá jednu hodinu při teplotěmístnosti. Následně se reakční směs zahustí do formy filmua přidá se 15 ml dietyletheru. Film se přemění na pevnoulátku a po 30 minutách míchání vznikne bílý prášek. Prášekse přefiltruje, dobře promyje dietyletherem, vysuší poddusíkem a náslidně zahustí ve vakuu do konstantní hmotnosti109 mg za vzniku titulní sloučeniny podle tohoto příkladu. Přiklad 12 1H-indol-3-acetamid, N-(20-amino-4-hydroxy-4,8,12,17-tetraazeices-1-yl)-4-hydroxy

Synthéza titulního produktu, který byl ve frakci podle příkladu 3» se provádí následujícím způsobem.

(XVII) V dusíkové atmosféře se ve skleněné aparatuře, vysušenéplamenem, smísí 4,0 g (30 mmol) 4-hydroxyindolu s 25 ml Aldrichova bezvodého DMP a míchá do formy roztoku. Následně se přidá - 56 - 1»44 g (30 mmol) NaH ve formě 50 % disperse v oleji. Po «končenípěnění se přidá 2,5 ml chlorometalmětyleteru (Aldrich)a výsledný tmavězelený roztek se míchá přes noc. Následněse roztok zředí na 125 ml ethylacetétem, promyje 5 x 25 mlΗ^Ο a 1 x 25 ml solanky, vysuší nad NagSO^ a chromatografujepři použití směsi 4:1 hexanu a etylacetátu. Produkt obsahujícífrakce, se spojí a zahustí za vzniku 2,70 g sloučeniny XVIIv podobě oleje. B. XVII + H3C\

NH

H,C

(XVIII) V 50 ml 3 hrdlé baňce s kulatým dnem, vybavené mecha-nickým míchadlem a přívodem dusíku se v dusíkové atmosféřeochladí 1,3 g vodného formaldehydu (37%) a 2,28 g kyselinyoctové. Následně se přidá 3,23 ml ochlazeného dimethylaminu(25% v HgO). Výsledný chlazený roztek se doplní 2,7 g (15,2mmol) sloučěniny vzorce XVII při použití 1,5-2,0 ml tetrahydro-furanu jako transferního rozpouštědla. Reakční směs se ohřejena teplotu místnosti a míchá přes noc. Následně se přidá40 ml 10% NaOH, čímž se vytvoří sraženina. Po zamíchání se - 57 - sraženina přefiltruje, promyje HgO a vysuší na vzduchuza vzniku 3,26 g sloučeniny vzorce XVIII. C.

XVIII OCH2OCH3

OH

H (XIX) OCH2OCH3 3

NH 2

H (XX) V atmosféře dusíku se smísí 4,62 g KCN s 10 ml HgOa'rozmíchá do roztoku. Následné se přidá 30 ml etanolu a3,26 g (14 mmol) sloučeniny XVIII a směs se míchá a zahřívána teplotu refluxu po debu 65 hodin. Následně se reakčaísměs ochladí a zahustí. Výsledná sraženina, obsahujícísloučeninu vzorce XX se přefiltruje, promyje HgO a vysušína vzduchu. Vodní vrstva se extrahuje 4 x 15 ml dichlorraetanu,čímž se zachovají organické extrakty. Vodní vrstva se následněpřelije 50 ml etylacetátu a okyselí na pH 2. Efrylacetátovávrstva se oddělí, aátjryi odplynuje probubláním dusíkem etyl-acetátovou vrstvou, vysuší a zahustí do formy pevné látky,která se rozetře s diisopropyleterem za vzniku 1,03 gsloučeniny vzorce XIX v podobě bělavé pevné látky. Následněse všechny extrakty z bazické vodní vrstvy spojí, vysuší,spojí s dříve získanými filtráty a zahustí za vzniku 0,4 gsloučeniny vzorce XX v podobě pevné látky. - 58 -

XX --► XIX V atmosféře dusíku se smísí 1,6 g sloučeniny vzorce XXse 7,5 ml etanolu, 30 ml HgO a 1,3 g KOH, Směs se zahřívák refluxu a míchá přes noc. Následně se reakční směs ochladí,extrahuje 2 x 15 ml etylacetátem, přelije čerstvým etylacetátemetylacetátové vrstvy se spojí,pevná látka se rozetře s IPEvzorce XIX. a okyselí na pH 2. Spojenévysuší a zahustí. Výslednáza vzniku 1,1 g sloučeniny E.

XIX

(XXI) V 10 ml H20 se rozpustí 1,44 g (4,25 mmei) TBAHSO^.Následně se přidá 714 mg (8,5 mmol) NaHCO^. Po ukončenípěnění se přidá 1,0 g (4,25 mmel) sloučeniny vzorce XIX asměs se míchá jednu minutu, načež se přidá 40 ral chlorcfcrmu.Reakční směs se míchá 5 minut, chlorofirmová vrstva se oddělía vodní směs se extrahuje 1 x 15 ml chlordbrmu. Spojenéchloroformové extrakty se vysuS, zahustí a promyjí 2 x 30 mlacetonu. Produkt se opětně rozpustí ve 30 ral acetonu v du-síkové atmosféře, přidá se 0,37 ml (4,25 mmol) allybromidua reakční směs se míchá 2 hodiny. Směs se zahustí a chroma- - 59 - tografuje při použití etylacetátu jako vymývacího roz-pouštědla. Produkt se koncentruje za vzniku 1,1 g oleje.Veškerý produkt se smísí s 25 ml dichlorraetanu a přidá se0,98 g (4,5 mmel) di-t-butyldiuhličitanu a 51 mg (0,425 mmol)4-(N,N-dimetylamino)pyridinu. Reakční směs se míchá přes noc.Následně se reakční směs zahustí a chromátograftije a promyjesměsí 9:1 hexanu a etylacetátu. Po zahuštění se získá 1,33 gsloučeniny vzorce XXI v podobě viskózníh© oleje. F.

XXI

(XXII)

Ve 2 ml metanolu se rozpustí 64 mg (0,17 mmol) sloučeninyvzorce XXI. K roztoku se přidá 1,7 ml 0,1 N NaOH a reakčnísměs se míchá přes noc. Reakční směs se následně okyselí,vysuší, extrahuje etylacetátem a zahustí. NMR analýza ukázala,že se odstranil veškerý allyester ze sloučeniny vzorce XXI,avšak došlo do určité míry k trans esterJfLkaci a bylo přítomnourčité množství metylesteru. Proto se produkt spojí se zbylýmmnožstvím sloučeniny XXI (asi 1,26 g), rozpustí v 5 mltetrahydrofuranu a ochladí na 0°C. Následně se přidá 3,8 ml1N NaOH a reakční směs se míchá 5 minut při 0°C a následnězahřeje na teplotu místnosti. Reakce rezultuje ve dvou fázích,proto je nutno přidat daíích 5 ml metanolu. Reakční směs -60- se míchá přes noc. následně se odstripuje tetrahydrofcrana metanol a zbylá vodní vrstva se přelije 50 ml etylacetátua okyselí na pH 2. Etylacetátová vrstva se oddělí, promyje1 x 20 ml H20, jednou solankou, vysuší nad NagSO^, přefiltrujea zahustí do formy gumy, která po rozetření s hexanem krys-talizuje za vzniku 1,08 g bílé pevné látky. Ta se chromato-grafuje a vymyje směsí 70:30 etylacetátu a hexanu a šaržečistého produktu se spojí, zahustí a krystalizují ze směsietylacetátu a hexanu za vzniku 0,884 g sloučeniny vzorce XXII. G. XXII + ff

(XXIII) V dusíkové atmosféře se rozpustí 271 mg (0,81 mtnol)sloučeniny vzorce XXII za míchání ve 4 ml bezvodého tetrahydro-fliranu. Následně se přidá 93 mg (0,81 mmol) N-hydroxysukcinimidua 167 mg (0,81 mmol) dicyklohexylkarbodiimidu za míchání.

Po jedné hodině a padesáti minutách se přidá 0,5θ g (0,8 mmol) - 61 - sloučeniny vzorce X, připravené postupem podle příkladu 11,ve 30 ml a směs se míchá přes neděli· Následně se odfiltrujedicyklohexylmočovina a směs se extrahuje 2 x 3 ml 1N NaOH,vysuší přes KgCO^ a zahustí. Dále se produkt chromatografujena 100 g silikagelu a vymyje směsí 9:1 dichlormetanu ametanolu, přičemž zůstane požadovaný produkt a následněsměsí 90:10:1 dichlormetanu, metanolu a isppropylaminu. Tímto způsobem se vymyje produkt. Frakce s obsahem produktuse zahustí, promyjí několikrát dichlormetaném a rozpouštědlose odstripuje za vzniku 349 mg sloučeniny vzorce XXIII v po-době bílé pěny.

Alternativně a výhodně se smísí 50 ml rozteku,, obsahující-ho 0,480 g (1,43 mmel) sloučeniny vzorce XXII v dichlormetanus 0,165 g (1,43 mmol) N-hydroxysukcinimidu a dále s 0,294 g(1,43 mmol) dicyklohexylkarbodiimidu a míchá se 5 hodin.

Reakční směs se přefiktruje a filtrát, obsahující surovýhydroxysukcinimid se přikape během 20 minut k 100 ml roztoku1,03 g (1,43 mmol) sloučeniny vzorce X, připravené postupempodle příkladu 11, v dichlormetanu. Reakční směs se míchá72 hodin. Následně se surová reakční směs promyje dvakrát20 ml 1N NaOH, vysuší nad KgCO^, přefiltruje a zahustí.

Produkt se chromatografuje na silikagelu a vymyje směsí 4:1dichlormetanu a metanolu a následně směsí 9:1:1 dichlormetanu,metanolu a diisopropylaminu, čímž se získá 912 mg sloučeninyvzorce XXIII. - 62 -

XXIII

OCH2OCH3 Η

OH

BOC BOC

N-BOC

BOC (XXIV) V atmosféře dusíku se rozpustí indolacetamid XXIII(900 mg, 0,87 mmel) ve 40 ml dichlermetanu. K tomute roztekuse přidá 2-(fenylsulfonyl)-3-fenylexaziridin (500 mg, 1,92 mmel).Postup reakce se monitoruje chromátografií na tenké vrstvě.

Pe 1 hodině se reakční směs zahustí ve vakuu, čímž se získápřevážně surevý nitron, který se rozpustí ve 35 ml kyselinyoctové.Přidá se přebytek sodné soli kyaneborohydridu (1,00 g, 15,9 mmel) a reakční směs se míchá asi 2 hodiny. Reakční směsse zahustí ve vakuu, vyjme v dichlormetanu (50 ml), promyjepH 7 pufrem (1 x 50 ml) a pH se nastaví na 7 1N NaOH. Organickávrstva se ©pět promyje pufrem pH 7 (1 x 50 ml), vysuší naduhličitanem draselným a zahustí ve vakuu za vzniku surovéhoproduktu, který se chromategrafuje na silikagelu a vymyjesměsí 95:5 ethylacetátem a metanolem, čímž se získá 612 mg(67%) sloučeniny vzorce XXIV v podobě bílé pěny. I. XXIV ->

OH

OH

NH 2 (XXV) - 63 -

Alternativním postupem při odsátí vzduchu a trojím pro-mytí argonem se odplyní 3 ml kyseliny trifluoroctové. Baňkase obalí v aluminiové fólii a přidá se 98 mg slouČěninyvzorce XXIV při použití asi 2,5 ml dichlormetanu jako tran-portního činidla. Po 45 minutách se směs zahustí za vznikuoleje, který po rozetření s dietyleterem poskytl 88 mg sloučeniny vzorce XXV v podobě bílé pevné látky, která se uloží při-80®C.

Alternativně a výhodně se k nasycenému roztoku dioxanu-HC1, promyténému argonem, přidává 1,5 minuty 0,520 g (0,495ramol) sloučeniny vzorce XXIV, připravené postupem podle částiH, ve 10 ml dioxanu. Okamžitě se vytvoří sraženina a reakčnísměs se míchá 1 hodinu. Následně se přidá dietyleter a po 5minutách se roztok přefiltruje. Výsledné pevné látky se pro-myjí dietyleterem, vysuší v atmosféře dusíku a dále za sníže-ného tlaku, čímž se získá 345 mg kyseliny vzorce XXIV ,která může být uložena při -78®C. K vodnému roztoku, promy-tého argonem, se přidá 150 mg (0,205 mmol) kyseliny vzorceXXIV*. Reakce se monitoruje HPLC. Po ukončení reakce, asi za7 hodin, se reakční směs vymrazí za vzniku 103 mg sloučeninyvzorce XXV v podobě hydrochloridu. - 64 - Příklad 13

Benzamid, N-(20-amine-4-hydroxy-4,8,12,17-tetraazeices- 1-yl)-4-hydroxy

Syntéza titulního produktu, obsaženého ve frakci A* podlepříkladu 2, probíhá následujícím způsobem.

Do 400 ml baňky se přidá 6,78 g (20 mmel) tetrabutyl-ammoniumhydrogensíranu a 60 ml HgO a míchá se za vzniku roz-toku. Následně se přidá 3,36 g (40 mmel) NaHCO^ a jakmile todovolí pěnění, přidá se 40 ml roztoku, obsahujícího 2,76 g(20 mmel) kyseliny p-hydroxybenzoové, 0,8 g NaOH a 40 mlH^O. Reakění směs se míchá 5 minut a přidá se 200 ml dichlor-raetanu. Směs se míchá dalších 5 minut a vrstvy se oddělí. Vodnívrfrtva se dvakrát extrahuje 50ral dichlořmetanu. Spojenédichlormetanové extrakty se vysuší nad Na^SO^, zahustí, pro-myjí dvakrát 75 ml acetonu a opětně rozpustí v 50 ml acetonu.Přidá se 1,9 ml (22 mmel) allybromidu a směs se míchá. Reakěnísměs se zahustí, vyjme ve 100 ml etylacetátu, promyfce dvakrát30 ml H^O, jednou 50 ml nasyceného hydrogenuhličitanu sodného,jednou H^O a jednou solankou. Výsledný produkt se vysuší a za- - 65 - hustí za vzniku oleje. Olej se rozetře s 50 ml petreleteru.Směs se přefiltruje, premyje dobře petroleterem a vysušína vzduchu za vzniku 1,7 g sloučeniny vzorce XXVI· B.

XXVI

(XXVII) V atmosféře dusíku se smísí 1,7 g (9,55 mmol) slouče-niny vzorce XXVI, připravené postupem podle části A, s 50 mlAldrichova bezvodého DMP a rozmíchá do roztoku· Dále se přidá0,38 g (9,55 mmol) NaH ve formě 60% disperse v oleji a reakčnísměs se míchá přes noc. Přidá se 0,76 ml chlorometylmetyleteru(Aldrich), načež se vytvoří sraženina. Reakční směs se míchá18 hodin. Dále se přidá 200 ml ethylacetátu/100 ml HgO.etylacetátová vrstva se oddělí, premyje 3krát 50 ml HgO, jednou50 ml 1N NaOH, jednou 50 ml HgO a jednou solankou. Výslednýroztok se vysuší, zahustí a chromatografuje na silikagelua vymyje směsí 4:1 hexanu a etylacetátu za vzniku 1,63 g slou-čeniny vzorce XXVII. - 66 - c.

XXVII

V 75 ml tetrahydrcíiranu ee rozpustí 1,62 g (7,3 mmol)sloučeniny vzorce XXVII, připravené postupem podle Části B. Přidá se roztok, obsahující 0,4 g (10 mmol) NaOH v 15 mlHgO, čímř se vytvoří dvě vrstvy. Přidává se metanol do vytvo-ření homogenní směsi. Reakění směs se míchá přes noc. Tetra-hydroÉUran a metanol se odstripují ve vakuu a zbylý vodníroztok se dvakrát extrahuje 15 ml etylacetátu. Vodní vrstvase přelije 50 ml čerstvého etylacetátu a okyselí na pH 2,56N HC1. Etylacetátová vrstva se oddělí, promyje jednou10 ml HgO a jednou 25 ml solankou. Výsledný roztok se zahustíza vzniku pevných podílů, které se rozetřou hexanem, přefiltrujía vysuěí na vzduchu za vzniku 1,2 g sloučeniny vzorce XXVIII.

D. X

+ XXVIII

N-BOC

H och2och3 (XXXII) - 67 - 20 ml rozteku dichlormetanu, obsahujícího 0,127 g (0,7 mmol)sloučeniny vzorce XXVIII, připravené postupem podle části C,se smísí s 0,081 g (0,7 mmol) N-hydroxysukcinimidu a 0,144 g(0,7 mmol) dicyklohexylkarbodiimidu a míchá se 4 hodiny. Re-akční směs se přefiltruje, a filtrát s obsahem surovéhohydroxysukcinimidu se přikape během 20 minut k 80 ml dichlor-metanu, obsahujícíma 0,50 g (0,7 mmol) sloučeniny vzorce X,připravené postupem podle příkladu 11, části A-I. Reakční směsse míchá hodin. Následně se reakční směs promyje 1N NaOH(2 x 20 ml), vysuší nad uhličitanem draselným, přefiltrujea zahustí. Koncentrát se chroraatografuje na silikagelu a vymyje9:1 směsí dichlormetanu a metanolu a dále 9:1:0,25 dichlořmetanu,metanolu a diisepropylaminu za vzniku 370 mg sloučeniny vzorceXXXII. E. xxxii -----k —

(XXXIV, V atmosféře dusíku se rozpustí 0,335 g (0,38 mmol)sloučeniny vzorce XXXII, připravené postupem podle části D,ve 30 ml dichlormetanu. K tomuto roztoku se přidá 0,230 g - 68 - (0,88 mmol) 2-(sulfonylfenyl)-3-fenyl-oxaziridinu. Po 0,5 hodiněse reakční směs zahustí ve vakuu a koncentrát rozpustí v 15 mlkyseliny octové. Přidá se velký přebytek kyanoborohydridu(0,100 g, 1,6 mmol) a reakční směs se míchá 2 hodiny. Dále sesměs zahustí ve vakuu, vyjme v 50 ml dichlormetanu, promyjejednou 50 ml pH 7 pufru, a pH se nastaví na 7 1N NaOH.

Organická vntva se opět promyje 50 ml pH 7 pufru, vysuší naduhličitanem graselným a zahustí ve vakuu. Koncentrát se chroma-tografuje na silikagelu a vymyje směsí 50:50 acetonu a hexanuza vzniku 253 mg sloučeniny vzorce XXXIV. F. (XXXIV, -►

(XXXVI, V atmosféře argonu se při teplotě místnosti smísí 0,20 g(0,223 mmol) sloučeniny vzorce XXXIV, připravené postupempodle části E, s 5 ml kyseliny trifluoroctové. Reakční směsse míchá 1,5 hodiny. Přidá se další 2 ml kyseliny trifluoroctovék omytí stěn bažky. Následně se reakční směs zahustí ve vakuu,rozetře s etyleterem, přefiltruje a vysuší v atmosféře dusíkuza vzniku 218 mg sloučeniny vzorce XXXVI titulní sloučeninypodle tohoto příkladu. -69- Příklad 14

Benzamid, N-(20-amine-4-hydroxy-4,8,12,17-tetraazeicos--1-y1)-2,5-dihydroxy

Syntéza titulní sloučeniny, obsažené ve frakci podlepříkladu 3, probíhala následujícím petupem :

OH O OH O

OH OH (XXIX)

Postupem podle příkladu 12, část A, avšak při použití3»08 g (20 mmol) kyseliny 2,5-dihydroxybenzoové, se získá3,0 g sloučeniny vzorce XXIX. B.

XXIX

(XXX) V atmosféře dusíku se smísí 3»0 g (15,5 mmol) sloučeniny - 70 - vzorce XXIX s 50 ml Aldrichova bezvodého DMP a rozmíchá sedo roztoku. Přidá se 1,24 g (31 mmol) NaH v 60% olejová disper-si a směs se míchá. Po 3 hodinách se přidá 2,5 ml (33 mmol)chlorometylmetyleteru a reakční směs se míchá 18 hodin. Re-akční směs se přidá k 300 ml etylacetátu a 100 ml HgO.Etylacetátová vrstva se oddělí a promyje 3 krát 75 ml HgO,dvakrát 75 ml 1N NaOH, dvakrát 50 ml HgO a jednou solankou.Výsledný roztok se vysuší a chromatografuje za vzniku 2,9 goleje, který se chromatografiuje na silikagelu a vymyje směsí4:1 hexanu a etylacetátu za vzniku dvou frkkcí, přičemž druháfrakce obsahuje 1,16 g sloučeniny vzorce XXX. C.

XXX

(XXXI) K 10 ml tetrahydrofuramu se přidá 1,16 g (4,1 mmol)sloučeniny vzorce XXX. Dále se přidá 0,24 g (6 mmol) NaOH v10 ml HgO, čímž se vytvoří dvě fáze. Přidá se metanol dovytvoření jedné fáze a reakční směs se míchá 18 hodin. Následněse odstraní rozpouštědla a vodní roztok se dvakrát extrahuje15 ml ethylacetátu. Vodní vrstva se přelije 35 ml čerstvéhoetylacetátu a pH se nastaví na 2,5 6N HC1. Etylacetátová - 71 vrstva se oddělí, promyje jednou 10 ml HgO a jednou solankouvysuší a zahustí za vzniku 1,0 g sloučeniny vzorce XXXI v podobě oleje. D. X + XXXI -►

(XXXIII) Při použití postupu podle příkladu 13, části D, a připoužití 0,17 g (0,7 mmol) sloučeniny vzorce XXXI, připravenépostupem podle části C, 0,081 g (0,7 mmol) N-hydroxysukcini-midu, 0,144 g (0,7 mmol) dicyklohexylkarbodiimidu a 0,50 g(0,7 mmol) sloučeniny vzorce X, připravené postupem podlepříkladu 11, části A-IT se po chromatografii získalo 370 mgsloučeniny vzorce XXXIII. e. xxxiii -:-_►

(XXXV, - 72 - Při použití postupu podle příkladu 13, části E a připoužití 0,308 g (0,33 mmol) sloučeniny vzorce XXXIII, připra·vené postupem podle části D, a 0,250 g (0,96 mmol) 2-(sul-ťbnylfenyl)-3-fenyl-axaziridinu se po chromátografování nasilikagelu a vymytí směsí 50:50 acetonu a hexanu získalo210 mg sloučeniny vzorce XXXV, F. XXXV -► 2

OH (XXXVII) Při použití postupu podle příkladu 13, části P a při použití 0,100 g (0,104 mmol) sloučeniny vzorce XXXV, připravenépostupem E, se získá 108 mg sloučeniny vzorce XXXVII, titulnísloučeniny tohoto příkladu. Příklad 15 1H-indol-3-acetamid, N-(16-amino-4-hydroxy-4,8,13-triazahexadec-1-yl)-4-hydroxy

Syntéza titulního produktu, obsaženého ve frakci Ag podlpříkladu 3, probíhá následujícím způsobem: - 73 -

BOC

(XXXVIII) Při použití postupu podle příkladu 11, části D a připoužití 1,15 g (2,07 mmol) sloučeniny vzorce VI, připravenépostupem podle příkladu 11, části A-E, se získalo 1,10 gsurové sloučeniny vzorce XXXVIII. B· XXXVIII + XXII -►

, .,-BOC

BOC H (XXXIX, Při použití alternativního postupu, popsaného v příkladu12, části G a při použití dichlormetanového roztoku (15 ml)obsahujícího 0,228 g (6,8 mmol) sloučeniny vzorce XXII,připravené postupem podle příkladu 12, části A až P, 0,380 g(6,8 mmol) sloučeniny vzorce XXXVIII, připravené pcstupem podlečásti A, 0,078 g (6,8 mmol) N-hydroxysukcinimidu a 0,140 g(6,8 mmol) dicyklohexylkarbodiimidu se získá 0,407 g - 74 - sloučeniny vzorce XXXIX, která se isoluje chromatografií nasilikagelu a vymyje směsí 9:1 dichlormetanu a metanolu anásledně 9:1:0,5 dichlormetanu, metanolu a diisopropylaminu.

XXXIX

(XL)

Při použití postupu podle příkladu 12, části H a 0,350 g(0,4 mmol) sloučeniny vzorce XXXIX a 0,230 g (0,88 mmol) 2-(sulfonylfenyl)-3-fenyloy>irldinu se získá 0,274 g sloučeninyvzorce XI, která se isoluje chromatografií na silikagelua vymyje směsí 50:50 acetonu a hexanu. Produkt, obsahujícímalé množství feny1sulfonamidu, se dále vyčistí na silikagelua vymyje etylacetátem a následně 50:50 acetonem a hexanem.

(XLI) 'V-.·.? - 75 - Při použití alternativního postupu podle příkladu 12,části I a při použití 0,166 g (0,186 mmol) sloučeninyvzorce XL, připravené postupem podle části C se po zpracováníse směsí dioxanu a HC1 získala surová kyselina. Kyselina vzorceXL se rozpustí ve vodě na 8 hodin a vymrazí se za vzniku88 mg sloučeniny vzorce XLI.

PŘÍPRAVA A

N-BOC

H V atmosféře dusíku se míchá 34,5 g (157,6 mmol) 3-bromo-propylaminu.HBr v 600 ml N,N-dimety]fbrmamidu. K tomuto roztokuse přidá 34,4 g (157,6 mmol) di-t-butyldiuhličitanu a 32,3 ml(236 mmol) trietylaminu. Okamžitě se vytvoří sraženina. Reakčnísměs se míchá přes noc. Reakční směs se následně zředí etylacetá tem na 1,5 litru, promyje Jednou 500 ml 1N HC1, třikrát 500 mLvody, jednou solankou a vysuší nad NagSO^. Po zahuštění seprodukt chromatografiuje na 800 g silikagelu a vymyje směsí4:1 hexanu a etylacetátu a frakce se monitorují chromatografiína tenké vrstvě (KMNO^/Ig). Frakce, obsahující produkt sespojí, zahustí ve vakuu, dvakrát promyjí 50 ml dichlormetanua vy&amp;stí vysokým vakuem za vzniku 25,8 g produktu podle tétopřípravy.

Claims (2)

135 C4 PRAHA I, nároků p A T E N T o v E

1. Způsob výroby v podstatě čisté sloučeniny ze skupiny, tvořené

vykazující tyto charakteristiky: •-P cp 77 a/ je obsazena ve frakci surového jedu pavouka Agelenopsis aperta, vymývané z kolony C-18 Vydac's^-^ o rozměrech 22 mm x 250 mm, velikosti pórů 300 8 a velikosti částic 10 ^u při rychlosti průtoku 15 ml/min.., systémem rozpouštědel s lineárním gradientem 5% -=► 20% B, 95% -> 80% A /0 -30 min._/a dále 20% -s» 70% B, 80% > 30% A /30 55 min. 7t kde A značí 0,1% vodní roztok - TFA a B je acetonitril, po dobu asi 22,75 minut; b/ je obsažena ve frakci popsané v části a/, vymývané z kolonyC-18 Vydac 22 mm x 250 mm, s velikostí pórů 300 S a velikostičástic 10 ^u , při průtokové rychlosti 15 ml/min., systémem roz-pouštědel s nelineárním gradientem 0% -0% B, 100% -100% A /0 -> 5 min._7, dále 0% -> 10% B, 100% -90% A /5 ->20 min._//Watersova křivka 1/ a dále 10% ->-20% B, 90% -=5*80% A /20 -> 30 min,_/ /Watersova křivka 6/ a dále 20% -50% B, 80% -50% A /30 -40 mim? /Watersova křivka 11/, kde A je 0,1% vodní roztok TFA a B je aceto-nitril, po dobu asi 21,5 minut; a c/ FAB MS: vysoké rozlišení: 505.3861, a její farmaceuticky přípustné soli, vyznačující se tím, že se v případě sloučeninyvzorce

NH, vymyje surový jed pavouka Agelenopsis aperta z kolony C-18 Vydá

78 /22 mm x 250 mm, 300 8 velikosti pórů a velikosti částic10/U/ při rychlosti proudění 15 ml/min a pomocí systému roz-pouštědel s lineárním gradientem 5% -^10% acetonitril, 95% -ř” 90% 0,1% vodní roztok kyseliny trifluoroctové a při detekci monochromatického píku při 220-230 nm, frakce, vymytéběhem asi 12,5 minut se spojí a s výhodou lyofilizují, suspendujíve vodě a lyofilizují z vody, nebo alternativně sloučenina vzorce

(XXVIII) reaguje v rozpouštědle, interním vůči reakčním složkám, v inert-ní atmosféře s N-hydroxysukcinimidem a následně s dicyklohexyl-karbodiimidem a se sloučeninou vzorce BOC BOC H | I

(X) v rozpouštědle, inertním vůči reakčním složkám, načež produkt 79 reaguje v inertní atmosféře s 2-/sulfonylfenyl/-3-fenyl-oxazi-ridinen a následně s kyanoborohydridem a reakční produkt reagujev inertní atmosféře s kyselinou trifluoroctovou; /b/ v případě přípravy sloučeniny vzorce

se vymyje surový jed pavouka Agelenopsis aperta z kolony C-18Vydac /22 mm x 250 mm, velikosti pórů 300 R a velikosti částic10 /U/ při rychlosti proudění 15 ml/min. systémem rozpouštědel s lineárním gradientem 5% -20% acetonitril, 95% -> 80% 0,1% vodná kyselina trifluoroctová 80% — 30% 0,1% vodná kyselina trifluoroctová /30 -=* 55 min._7 při stanovení monochromatického píku při 220-230 nm, frakce, vymyté během asi 21 minut se spojía vloží na kolonu Vydac /10 mm x 250 mm, veliokost pórů300 R , velikost částic 5 ^u/ a vymyjí při rychlosti proudění4,0 ml/min. systémem rozpouštědel s gradientním programem 0% -*- 10% acetonitril, 100% ->· 90% 0,1% vodná kyselina trifluoroctová a při stanovení monochromatického píku při22-230 nm, frakce, která se vymyje asi během 7 minut se spojí,resuspenduje ve vodě a lyofilizuje, nebo alternativněreaguje sloučenina vzorce 80

(XXXI) v rozpouštědle inertním vůči reakčnímu prostředí s N-hydroxy-sukcinimidem a s dicyklohexylkarbodiimidem a následně sloučenina vzorce

I BOC

BOC N-BOC, H (X) reaguje v inertní atmosféře s 2-/sulfonylfenyl/-3-fenyl-oxaziridinem a s kyanoborohydridem a produkt reaguje v inertníatmosféře s kyselinou trifluoroctovou; /c/ v případě přípravy sloučeniny vzorce

N- H NH se vymyje surový jed pavouka Agelenopsis aperta z C-18 kolonyVydac R /22 mm x 250 mm, velikosti pórů 300 8 a velikosti částic 81 10 yU/ a při rychlosti proudění 15 ml/min. systémem rozpouště-del s lineárním gradientem 5% -20% acetonitril, 95 % -> 80% 0,1% vodná kyselina trifluoroctová /0 -? 3® m±n._7a dále 20% -70% acetonitril, 80% -* SXXMXXX 30% 0,1% vodná kyselina trifluoroctová /30 -> 55 min^/ při stanovení monochromatického píku při 220-230 nm, frakce, která se vymyje během asi 21 minutse jímá a vloží na kolonu C-4 Vydac /lOmm x 250 mm. velikostpórů 300 $ , velikost částic 5 ^u/ a vymyje při rychlosti proudění 4,0 ml/min., systémem rozpouštědel s lineárním programem 0% ->- 10% acetonitril, 100% -* 90% 0,1% vodná kyselina trifluoroctová a při stanovení monochromatického píku při 220-230 nm, frakce,který se vymyje během asi 9 minut se jímá a výhodně lyofilizuje,resuspenduje ve vodě a lyofilizuje nebo alternativně sloučenina vzorce

reaguje v interním rozpouštědle s N-hydroxysukcinimidem a s dicyklohexylkarbodiimidem a produkt vzorce 82 BOC

(XXXVIII) reaguje v inertní atmosféře s 2-/sulfonylfenyl/-3-fenyl-oxaziridinema následně s kyanoborohydridem a reakční produkt reaguje buds kyselinou trifihuoroctovou v iet inertní atmosféře nebo podinertní atmosférou, rozpustí se v nasyceném dioxanu-HCl, regene-ruje z z této směsi a přidá se k vodnému roztoku v inertní atmosféře; /d/ v případě px sloučeniny vzorce

se vymyje surový jed pavouka Agelenopsis aperťa z kolony C-18Vydac ^-^/22 mm x 250 mm, velikost pórů 300 δ, velikost částic 10 ^u/při rychlosti proudění 15 ml/min. systémem rozpouštědel s lineár-ním gradientem 5% -20% acetonitril, 95 % ->-80% 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové /5 -=> 30 min._7a dále 20% 70% acetonitril, 80% ->30% 0,1% vodný roztok - kyseliny trifluoroctové /30 ->55&amp;in._7a monochromatický pík se stanoví při 220-230 nm, frakce, která se vymyje v době asi 22,75 minut se oddělí a vloží na kolonu C-4 VydacC^)/22 mm x 83 250 mm, velikost pórů 300 2, velikost částic 10 ^u/ a vymyjepři rychlosti proudění 15 ml/miq., systémem rozpouštědel s ne-lineárním gradientem 0% -=? 0% acetonitril, 100% ->-100% 0,1% vodný roztok kyseliny trif luoroctové /0 -- 5 min. ~J, následně 0% -10% acetonitril, 100% -> 90% 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové_/5 -5» 20 min._7/Watersova křivka 1/, potom 10% -> 20% acetonitril, 90% -> 80% 0,1% vodný roztok kyseliny trif luoroctové /20 -=?- 30 min. _//Water sova křivka 6/, následně 20% -? 50% acetonitril, 80% -p- 50% 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové /30 -^40 min._7 /Watersova křivka 11/ a monochromatický pík se stanoví při220-230 nm, frakce, která se vymyje v době asi 18,5 minutse jímá a výhodně lyofilizuje, resuspenduje ve vodě a lyofilizujenebo alternativně reaguje sloučenina vzorce

(XXII) v inertním rozpouštědle a v inertní atmosféře s N-hydroxysukcinimidema následně s dicyklokexylkarbodiimidem a následně sloučenina vzorce 84 BOC

(X) ve formě produktu reaguje v inertní atmosféře s 2-/sulfonyl-fenyl/-3-fenyl-oxaziridinem a dále s kyanoborohydridem a reakčníprodukt reaguje buď s kyselinou trifluoroctovou v inertní atmos-féře nebo pod inertní atmosférou, rozpustí se v nasyceném dioxanu-HC1, regeneruje z této směsi a přidá se v inertní atmosféřek vodnému roztoku; /e/ v případě přípravy sloučeniny vzorce

se surový jed pavouka Agelenopsis aperta vymyje z kolonyC-18 Vydaá-^/22 mm x 250 mm, velikost pórů 300 δ, velikostpórů 10 /u/ při rychlosti proudění 15 ml/min., systémem rozpou-štědel s lineárním gradientem 5% -=> 20% acetonitril, 95% -r* 80% 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové /5 -> 30 min._/ a následně 20% -70% acetonitril, 80% -30% 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové /-30 -55 min._/ 85 a monochromatický pík se stanoví při 220-230 nm, frakce, kterýse vymyje během asi 27,5 minut se jímá a výhodně lyofilizuje,suspenduje ve vodě a lyofilizuje nebo se alternativně surovýjed pavouka Agelenopsis aperta vymyje z uvedené kolony přirychlosti proudění 15 ml/min. systémem rozpouštědel s lineárním gradientem 0% -=»> 20% acetonitril, 100% -^>80% 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové a pík se stanoví při 220 nm,frakce, která se vymyje při asi 26,0 minut se jímá a vloží nasloupec Dynamax Phenyl /4,6 mm x 250 mm, velikost pórů 60 8,velikost částic 8 ^u/ a vymyje při. rychlosti proudění 1 ml/min.,při isokratických podmínkách 10% acetonitrilu, 90% 0,1% vodnéhoroztoku kyseliny trifluoroctové a pík se stanoví při 220 nm,frakce, vymývaná během asi 55,27 minut se jímá a výhodně lyofi-lizuje, resuspenduje ve vodě a lyofilizuje nebo alternativněsloučenina vzorce

reaguje v inertním rozpouštědle v inertní atmosféře s N-hydroxy-sukcinimidem, dicyklohehylkarbodiimidem a následně reaguje produkt vzorce 86 BOC BOC H

(X) v acetonu v inertní atmosféře s kyselinou 3-chloroperoxybenzoo-vou, regeneruje se z rozpouštědla a reaguje s kyanoborohydridemv přítomnosti kyseliny octové a reakční produkt reaguje v inertníatmosféře s kyselinou trifluoroctovou; /f/ v případě přípravy sloučeninami s následujícími charakte-ristikami /a/ přítomnost ve frakci surového jedu pavouka Agelenopsis ’ R aperta , která je vymývána z kolony C-18 Vydac 22 mm x 250 mm,velikosti pórů 300 8, velikosti částic 10 ^u při rychlostiproudění 15 ml/min. a při použití systému rozpouštědel s line-árním gradientovým programem 5% -? 20% B, 95% -=>80% A /5 30 minx7 a následně 20% ->70% B, 80% -?> 30% A -=> /30 -=*- 55 min._7z kde A značí 0,1% vodný roztok TFA a B je acetonitril, po dobu asi 22,75 minut; /b/ přítomnost ve frakci popsané pod /a/, která se vymyjez kolony C-18 VydacR 22 mm x 250 mm, velikosti pórů 300 8a velikosti částic 10 ^u při rychlosti proudění 15 ml/min.a při použití systému rozpouštědel s nelineárním gradientem 0% -> 0% B, 100% -100% A_/0 -=* 5 min._7z následně 0% -?> 10% B, 100% -90% A /”5 -20 min._7 /Watersova křivka 1/ a následně 10% -> 20% B, 90% ->· 80% A / 20 ->· 30 min._7 /Watersova křivka 6/, potom 20% -=>· 50% B, 80% -·> 50% A /_0 -^40 min._7/Watersova křivka 11/, kde A je 0,1% vodný roztok TFA a B je acetonitril, po dobu asi 21,5 minut; 87 a /c/ FAB MS: vysoká rozlišovací schopnost: 505.3861,surový jed pavouka Agelenopís aperta se vymyje z kolony C-18Vydac^^/22 mm x 250 mm, velikost pórů 300 8, velikost částic10 /U/ při rychlosti proudění 15 ml/min., a systému rozpouště-del s lineárním gradientem 5% -> 20% acetonitril, 95% -’r- 80% 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové /0 -30 min. / a následně 20% -=?- 70% acetonitril, 80% -30% 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové /30 ->55 min.a monochromatický pík se stanoví při 220-230 nm, frakce, která se vymyje během asi 22,75 minut se jímá a vloží na kolonu C-4 Vydac R /22 mm x 250 mm,velikost pórů 300 8, velikost částic 10 ^u/ a vymyje při rychlosti) proudění systémem rozpouštědel s nelineárním gradientem 0% - 0% acetonitril, 100% -> 100% 0,1% vodný roztok kyseliny trif luoroctové /0 -ř* 5 min._7, následně 0% -10% aceto-nitril, 100% -> 90% 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové / 5 -> 20 min._7/Watersova křivka 1/. následně 10% -> 20% acetonitril, 90% -> 80% 0,1% vodný roztok kyseliny trifluor-octové l_ 20 -Τ' 30 min. _77watersova křivka 6/, následně 20% - 50% acetonitril, 80% -*50% 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové /"30 ->40 min._7/Watersova křivka 11/ a mono- chromatický pík se stanoví detekcí při 220-230 nm, frakce,vymývaná během 21,5 minut se jímá a výhodně lyofilizuje, resuspen-duje ve vodě a lyofilizuje; a uvedené sloučeniny se výhodně pře-vedou o sobě známým způsobem na odpovídající farmaceutocky přípustné soli. 88

2. Způsob přípravy v podstatě Čistého polypeptidu ze skupiny,tvořené polypeptidem /1/ s následujícími charakteristikami: /a/ je přítomný ve frakci ze surového jedu pavouka Ageleno- ' R ) psis aperta, která je vymývána z kolony C-18 Vydac—22 mm x 250 mmvelikost pórů 300 2 , velikost částic 10 ^u při rychlosti prou- dění 15 ml/min. a systému rozpouštědel s lineárním gradientem 5% -5>20% B, 95% -^80% A /0 —> 30 min/ a dále 20% —^>70% B, 80% —30% A /30 —> 55 min. /, kde A je 0,1% vodný roztok TFA a Bje acetonitril, po dobu asi 38 minut; • /b/ je přítomný ve frakci, popsané pod /a/, vymývané zkolony C-18 VydacR 22 mm x 250 mm, velikosti pórů 300 2,-velikosti částic 10 ^u , při rychlosti proudění 10 ml/min a systé-mu rozpouštědel s nelineárním gradientem 20% —> 30% B, 80% -r- 70% A /0 -> 40 min./ /Watersova křivka 6/, kde A je 0,1% vodný roztok TFA a B je acetonitril po dobu asi 22 minut; /c/ koncový amin aminokyselinové sekvence obsahuje: H2N-glu-lys-gly-leu-pro-glu-gly-ala-glu-cys-asp- gly-asn-glu-ser-asp-cys-lys-cys-ala-gly-gln-trp- ile-lys-cys-arg-cys-pro-trp-lys-trp-his-ile-thr- gly-glu-gly-pro-cys-thr-cys-glu-arg-gly-leu-lys- lys-thr-cys-ile-ser-lys-leu-ser-asp-pro-asn-arg- asn-glu-trp-leu-ser-;a /d/ FAB MS: 7267; a polypeptid se stejnou sekvencí aminokyselin a se stejnou 89 účinností při blokování vápníku jako uvedený polypeptid /1/,polypeptid /11/ vzorce asp-cys-val-gly-glu-ser-gln-gln-cys-ala- asp-trp-ala-gly-pro-his-cys-cys-asp-gly-tyr- tyr-cys-thr-cys-arg-tyr-phe-pro-lys-cys-ile-cys- val-asn-asn-asn-CONH2 a polypeptid se stejnou aminokyselinovou sekvencí a se stejnouúčinností při blokování vápníkového kanálku jako uvedený poly-peptid /11/, polypetid /111/ se stejnými identifikačními charakteristikami;•/a/ přítomný ve frakci surového jedu Agelenopsis aperta která se vymývá z kolony C-18 Vydac 22 mm x 2£0 mm, velikost pórů300 2 , velikost částic 10 /U , při průtokové rychlosti 15 ml/min.a systému rozpouštědel s lineárním gradientem 5% —20% B, > 95% —> 80% A /0 —> 30 min /následně 20% —> 70% B, 80% -> 30% A /30 —> 55 min. /, kde A je 0,1% vodný roztok TFA a B je aceto-nitril, po dobu asi 39 minut; /b/ přítomný ve frakci podle části /a/, která se vymýváz kolony C-18 Vydac R 22 mm x 250 mm, velikosti pórů 300 2 a veli-kosti částic 10 /U při průtokové rychlosti 10 ml/min. systémemrozpouštědel s nelineárním programem 20% —>25% B, 80% —=?-75% A/0 —-> 30 min./ /Watersova křivka 6/ a následně 25% —50% B, 75% —> 50% A /30 —>45 min./ /Watersova křivka 11/, kde A je0,1% vodný roztok TFA a B je acetonitril, po dobu asi 36 minut; a /c/ koncový amin aminokyselinové sekvence obsahuje: 90 * I^N-ala-lys-ala-leu-pro-pro-gly-ser-val-cys- asp-gly-asn-glu-ser-asp-cys-lys-cys-tyr-gly-lys-trp-his-lys-cys-arg-cvs-pro-trp-lys-trp-his-phe-thr-gly-glu-gly-pro-cys-thr-cys-glu-lys-gly-met-lys-his-thr-cys-ile-thr-lys-leu-his-cys-pro-asn-lys-ala-glu-trp-gly-leu-asp-trp-; a /d/ Ion-Spray MS: 7793; a polypeptid se stejnou sekvencí aminokyselin a se stejnou schop-ností blokovat kalciový kanálek jako uvedený polypeptid /111/, polypeptid /IV/ vzorce H2N, asp-glu-pro-cys-ile-pro-leu-gly-lys-ser-cys-ser-trp-lys-ile-gly-thr-pro-tyr-cys-cys-pro-his-pr—asp-asp-ala-gly-arg-arg-thr-trp-cys-leu-val-asp-tyr-ser-arg-phe-val-thr-ile-cys-ser-gly-arg-lys-tyr-C0NH2 a polypeptid se stejnou sekvencí aminokyselin a se stejným účin-kem na blokování vápníkového kanálku jako polypeptid /IV/, polypeptid /V/ s následujícími identifikačními charakteristi kami: /a/ přítomen ve frakci surového jedu pavouka Agelenopsssaperta , kfeerá se vymývá z kolony C-18 Vydac 22 mm x 250 mm,velikosti pórů 300 S , a velikosti částic 10 ^u, při průtokovérychlosti 15 ml/min. a systému rozpouštědel s lineárním gradi-entem 5% —ss» 20% B, 95% —> 80% A /0 —30 min. / a následně 91 20% —=*· 70% B, 80% —30% A /30 —> 55 min./, kde A je 0,1%vodný roztok TFA a B je acetonitril, po dobu asi 43 minut; /b/ přítomen ve frakci podle části /a/, která se vymýváz kolony C-18 Vydac^^lO mm x 250 mm, velikosti pórů 300 2a velikosti částic 10 ^u, při průtokové rychlosti 3,5 ml/min.systémem rozpouštědel s lineárním gradientem 25% —>-40% B, 75% —60% A /0 —> 30 min./,kde A je 0,1% vodný roztok TFAa B je acetonitril, po dobu asi 20,25 minut; /c/ koncový amin aminokyselinové sekvence obsahuje:í^N-ile-val-gly-gly-lys-thr-ala-lys-phe-gly-asp-tyr-pro-trp-met-val-ser-ile-glu-glu-lys-asn-lys-lys-g^y-gly-phe-asp- ; a /d/ molekulová hmotnost odpovídá asi 20 000;a polypeptid se stejnou aminokyselinovou sekvencí a stejnouúčinností při blokování vápníkového kanálku jako polypeptid /V/, polypeptid /VI/ s následujícími identifikačními charakteristi kami: /a/ je obsažen ve frakci surového jedu pavouka Agelenopsisaperta, který se vymývá z kolony C-18 Vydac 22 mm x 250 mm,velikosti pórů 300 2 a velikosti částčc 10 ^u, průtokové rychlosti 15 ml/min. a systému rozpouštědel s lineárním gradientem 5% -> 20% B, 95% —ř» 80% A /0 ->30 min./ a následně 20% —=> 70% B, 80% —30% A /30 —> 55 min./, kde A je 0,1% vodný roztok TFA aB je acetonitril, po dobu asi 43 minut; a /b/ je obsažen ve frakci podle části /a/, která se vymývá 92 z kolony C-18 VydacC?xlO mm x 250 mm, velikosti pórů 300 8 a velikosti částic 5 ^u, při průtokové rychlosti 3,5 ml/min.a systému rozpouštědel s lineárním gradientem 25% —^40% B, 75% —=» 60% A /0 —>30 min./, kde A je 0,1% vodný roztok TFA aB je acetonitril, po dobu asi 22,5 minut; a pojbypeptid se stejnou sekvencí aminokyselin a se stejnou účinností při blokování vápníkového kanálku jako u polypeptidu /VI/,polypeptid /VII/ s následujcími identifikačními charakteris- tikamu: /a/ je přítomen ve frakci surového jedu pavouka Agelenopsisaperta , která se vymývá z kolony C-18 Vydac^-^22 mm x 250 mm,velikosti pórů 300 8 a velikosti částic 10 ^u, při průtokovérychlosti 15 ml/min. a syst-mu rozpouštědel s lineárním gradien-tem 5% ->20% B, 95% —?=-80% A /0 —>30 min./ a následně 20% —> 70% B, 80% —> 30% A /30 —z* 55 min./, kde A je 0,1%vodný roztok TFA a B je acetonitril, po dobu asi 48,3 minut; /b/ koncový amin aminokyselinové sekvence obsahuje: I^N-glu-ala-thr-gl—ala-ala-lys-val-leu-ser-asn-leu-asp-glu-thr-val-asp-pro- ; a /c/ molekulová hmostost odpovídá asi 80 000 a polypeptidmá stejnou aminokyselinovou sekvenci a stejný účinek na blokovánívápníkového kanálku jako polypeptid /VII/, a jeho farmaceutickypřípustné soli, vyznačující se tím, že se v případě přípravy/a/ čistého polypeptidu /1/ vymývá surový jed Agelenopsis apertaz kolony C-18 Vydac'^,'/22 mm x 250 mm, velikosti pórů 300 8,a velikosti částic 10 ^u/ při průtokové rychlosti 15 ml/min,, 93 systémem rozpouštědel s lineárním gradientem 5% -?»20% aceto-nitril, 9 5% —$>80% 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové * /0 —30 min/ a následně 20% —70% acetonitril, 80% —> 30% V 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové /30 —ť* 55 min./ astanovení monochromatického píku při 220-230 nm, frakce, ktergse vymývá po dobu asi 38 minut se jímá a vloží na kolonu C-18Vyda<P^/22 mm x 250 mm, velikosti pórů 300 2 a velikosti částic10 /u/ a vymývá se při průtokové rychlosti 10 ml/min. systémemroztpouštědel s nelineárním gradientem 20% —> 30% acetonitril, 80% -? 70% 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové /0^40 min./ /Watersova křivka 6/ a pík se stanoví při 220-230 nm, frakce,která se vymývá po dobu asi 22 minut se jímá a výhodně lyoftbli-zuje, suspenduje ve vodě a lyofilizuje; /b/ v případě přípravy čistého polypeptidu /11/ se surový jedAgelenopsis aperta vymývá z kolony C-18 Vydac /22 mm x 250 mm,velikosti pórů 300 &amp; a velikosti částic 10 ^u/ při průtokovérychlosti 15 ml/min. a systému rozpouštědel s lineárním gradi-entem 5% —? 20% acetonitril, 95% —80% 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové /0 -? 30 min./ a následně 20% -?>70% acetonitril, 80% —$» 30% 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové/30 —?· 55 min./ a při detekci monochromatického píku při 220-230 . nm, frakce, která se vymývá po dobu asi 40 minut se jímá a vloží „ o na kolonu C-4 Vydac /22 mm x 250 mm, velikost pórů 300 A a velikostčástic 10 /U/ a vymývá při průtokové rychlosti 10 ml/min. systé-mem rozpouštědel s nelineárním gradientem 20% -?>30% scetonitril, 80% —>70% 0,1% vodný roztok kyseliny trif luoroctové /0 94 /Watersova křivka 6/, následně 30% —>50% acetonitril, 70% -> 50% 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové /30 —>45 min./ /Watersova křivka 11/ a pík se stanoví při 220-230 nm, frakce,která se vymývá po dobu 22 minut se jímá a výhodně lyofilizuje,resespenduje ve vodě a lyofilizuje; /c/ pokud se připravuje čistý polypeptid /111/, vymývá se surovýČÍT) jed Agelenopsis aperta z kolony C-18 Vydac^--/22mm x 250 mm,velikost pórů 300 8, velikost částic 10 ^u/ při průtokové rychlos-ti 15 ml/min., a systému rozpouštědel s lineárním gradientem 5% —20% acetonitril, 95% - 80% 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové /0 —>30 min./ a následně 20% —>70% acetonitril, 80% —> 30% 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové /30 —-ř3 55 min./a monochromatický pík se stanoví při 220-230 nm, frakce, která se R vymývá po dobu asi 39 minut se jímá a vloží na kolonu C-18 Vydac/22 mm x 250 mm, velikost pórů 300 8, velikost částic 10 ^u/a vymývá se průtokovou rychlostí 10 ml/min, systémem rozpouštědels nelineárním gradientem 20% —> 25 % acetonitril, 80% —75% 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové /0 —>30 min./ /Watersova křivka 6/, následně 25% —ř* 50% acetonitril, 75% -> 50% 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové /30 —>45 min.//Watersova křivka 11/ a pík se stanoví při 220-230 nm, frakce,která se vymývá po dobu asi 36 minut se jímá a výhodně lyofilizuje,resuspenduje ve vodě a lyofilizuje; /d/ v případě přípravy čistého polypeptidu /IV/ se surový jed Agelenopsis aperta vymývá z kolony C-18 Vydac/22 mm x 250 mm, 95 velikosti pórů 300 2 a velikosti částic 10 ^u/, průtokové rychlosti 15 ml/min. a systémem rozpouštědel s lineárním gradientem 5% -* 20% acetonitril, 95% —80% 0,1% vodný roztok kyseliny trifluor- octové /0 —> 30 min./, následně 20% —70% acetonitril, 80% - 30% 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové /30 —5^55 min./a monochromatický pík se stanoví při 220-230 nm, frakce, kteráse vymývý po dobu asi 40 minut se jímá a vloží na kolonu C-4Vydac /22 mm x 250 mm, velikost pórů 300 A, velikost částic10 /u/ a vymývá průtokovou rychlostí 10 ml/min. systémem rozpouš-tědel s nelineárním gradientem 20% —r- 30% acetonitril, 80% —ť-70% 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové /0 —30 min.//Watersova křivka 6/, potom 30% —>-50% acetonitril, 70% —50% 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctová /30 —>»45 min./ /Watersova křivka 11/ a pík se stanoví při 220-230 nm, frakce,která se vymývá po dobu asi 27,5 minut se jímá a výhodně lyofilizuje,resuspenduje ve vodě a lyofilizuje; /e/ v případě přípravy čistého polypeptidu /V/ se surový jed Agelenopsis aperta vymývá z kolony C-18 VydacC?>/22 mm x 250 mm,velikost pórů 300 8, veli-ost částic 10 ^u/ průtokovou rychlostí15 ml/min. systémem rozpouštědel s lineárním gradientem 5% - 20% acetonitril, 95% —80% 0,1% vodný roztok kyseliny trifluor- octová /0 —? 30 min./, následně 20% - 70% acetonitril, 80% —P 30% 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové /30 —z- 55 min./ a monochromatický pík se stanoví při 220-230 nm, frakce, která seCŘ Ί vymývá během asi 43 minut se jímá a vloží na kolonu C-18 Vydac- > 96 /10 mm x 250 mm, velikost pórů 300°A, velikost částic 5 ^u/ a vymývá systémem rozpouštědel s lineárním gradientem 25% —>40%acetonitril, 75% —>60% 0,1% vodný roztok kyseliny trifluor-octové /0 —> 30 min./ a pík se stanoví při 220-230 nm, frakce,která se vymývá po dobu asi 20,25 minut se jímá a výhodně lyofi-lizuje, resuspenduje ve vodě a lyofilizuje; v případě přípravy /f/ čistého polypeptidu /VI/ se vymývá surový jed Agelenopsis aperta z kolony C-l 8 VydacC5^/22 mm x 250 mm, velikost pórů 300 8, velikost částic 10 ^u/ průtokovou rychlostí 15 ml/min. systémem rozpouštědel s lineárním gradientem 5% — 20% acetonitril, 95% —>-80% 0,1% vodný roztok kyseliny trifluor- octové /0 - 30 min./, následně 20% —> 70% acetonitril, 80% —>»30% 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové /30 —>55 min./ a monochromatický pík se stanoví při 220-230 nm, frakce, která se£ vymývá během asi 43 minut se jímá a vloží na kolonu C-18 Vydac/10 mm x 250 mm, velikost pórů 300 8, velikost částic 5 ^u/a vymývá průtokovou rychlostí 3,5 ml/min. systémem rozpouštědels lineárním gradientem 25% —> 40% acetonitril, 75% —> 60% 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové /0 —> 30 min./a pík se stanoví při 220-230 nm, frakce, který se vymývá po dobuasi 22,5 minut se jímá a výhodně lyofilizuje, resuspenduje se vevodě a lyofilizuje; /g/ při přípravě čistého polypeptidu /VII/ se surový jed Agelenopsis aperta vymývá z kolony C-18 Vydacz/22 mm x 250 mm,velikost pórů 300 8 , velikost částic 10 ^u/ průtokovou rychlostí 97 * 15 ml/min., systémem rozpouštědel s lineárním gradientem 5% — 20% acetonitril, 95% —^80% 0,1% vodný roztok kyseliny trifluor-·octové /0 —30 min./, následně 20% —>70% acetonitril, 80% —> 30% 0,1% vddný roztok kyseliny trifluoroctové /30 —> 55 min,/ a stanovení monochromatického píku se provádí při 220-230 nm, frakce, která se vymývá po dobu asi 48,3 minuty se jímáa výhodně lyofilizuje, resuspenduje ve vodě a lyofilizuje, nebose alternativně kterýkoli z uvedených polypeptidů systetizujeo sobě známým postupem; v případě polypeptidů se stej- nou sekvencí aminokyselin jako má některý z uvedených polypeptidů,se takový polypeptid nebo polypeptidy připraví o sobě známýmipostupy a výhodně se převedou o sobě známými postupy na far-maceuticky přípustné soli. Zastupuje: JUDr. Pavel

é 1 e n ý 7 r, h f "7”λ·ι ! Λ> C, Advokátní ] č. 10