CS214546B1 - sposob izolácie enzýmov cholínesterázového typu - Google Patents

Abstract

Vynález sa týká sposobu izolácie en - zýmov cholínesterázového typu. Podstata vynálezp spočívá v tom, že biologický roztok obsahuje enzým chlínesterázového typu s výhodou acetylcholínesterázu alebo pseudocholín esterázu po úpravě na pH 7,5 až 9 a iónovej sily pod 0,01 M sa nechá v prvom stupni interagovať s výhodou na koloně s gélom sieťovaného a metylová - ného polyestylénimínu a po následnom premytí gelu rovnakým tlraivým roztokom sa v druhom stupni vytěsní zakotvený enzým elúciou roztokom o pH 8 a iónovej sile vyššej ako 0,1 M alebo účinkom zriedeného roztoku cholínu, připadne inej alkylamóniovej soli. Vynález má použitie pri izolácii alebo purifikácii enzýmov cholínesterázového typu pre výskům alebo priemyselnú prax.

Description

Vynález sa týká sposobu izoláeie enzýmov cholínesterázového typu, a to acetylcholínesterázy/acetyloholín hydroláza, EC 3. 1. 1. 7/ a pseudocholínesterážy /acylcholín acylhydro láza, EC 3. 1. 1· 8/.

Pri izolácii a purifikácii enzýmov cholínesterázového typu sa obyčejné vychádza z homo genátu ckaniva / aoetylcholínesteráza, pseudocholínnesteráza/ alebo krvnej plazmy za použi tia etanolovej frakcionácie /pseudocholíneateráza /, Surgenor D.M., Ellias D.j.J.Amer. chem.soo.76 6049, 1954, připadne áalšej chroraatografie na géli z fosforečnanu vápenatého, resp.lonomeniči / Malstrom B.G., Levin S,,Boman H.GtiActa Chem.Scand.,10, 1077, 1956/ ,’ připadne áalšej géůpvej filtrácie / Das P.K.,Liddell J.jBiochem.J.,116,875, 1970/. Rých lou metodou purifilácie aoetylcholínesterázy z hovadzíoh erytrocytov afinitnou gélovou chromatograflou na Sepharoze s naviazaným d-tubukarinom a elúciou s chloridom sodným popisujú Jung J. a Belleau B.j Mol.Pharmaool.,8, 589, 1972. Trimetyl/m-aminofenyl/ amónium chlorid, hydrochlorid ako afinAtný ligand viazaný na Bio-Gel A popisujú Berman J.D. a Young M.jProc.Nat.Acad.Sci US 68, 395, 1971. Nevýhodou uvedených postupov je ich zdíha vosí, připadne nákladná příprava afinitných ligandov a v áalšom nie jednoduché viazanie na nosič.

Podstata vynálezu spočívá v tom, že biologický roztok obsahujúci enzým cholínesterázového typu s výhodou acetylcholínesterázu alebo pseudocholíncesterázu po úpravě pH na 7,5 až 9 a iónovej sily pod 0,01 M sa nechá v prvom stupni interagovaí s výhodou na koloně s gélom sieíovaného a metylovaného polyetylénimínu o napúčavora objeme 6 až .12 ml/g a po následnom premytí gélu rovnakým tlmivým roztokom sa v druhom stupni vytěsní zakotvený enzým elúciou tlmivým roztokom o pH 8 a iónovej sile vyášej ako 0,1 M, alebo tlmivým roztokom o pH alebo úóinkom zriedeného roztoku cholínu, připadne inej alkylamóniovej soli.

Postup možno aplikovaí tak vsádkovým sposobom, alebo výhodnejšie je praoovaí tak,že polyetylénimínový modifikovaný ligand je naplněný v koloně, cez ktorú sa prelieva biologický roztok obsahujúci cholínesterázové enzymy. Kapacita nosiča dosahuje niekoíko tisíc jednotiek enzýmu na gram suchého nosiča. Po zakotvení enzýmu sa gél na koloně premýva 60 násobným objemom tlmivého roztoku o pH 8 aby sa vytěsnili nežiaduce sprievqdné látky. Po vymytí sprievodných látok sa viazaný čistý enzým uvolní z nosiča na koloně elúciou s tlmivým roztokom o pH 8 a iónovej sily vysšej ako 0,1 M alebo tlmivým roztokom o pH 6, alebo zriedeným roztokom cholínu, připadne inej alkylamóniovej soli. Uvedeným postupom sa dosiahne takmer 50 násobná purifikácia enzýmu.

Metylováný sieíovaný polyetylénimín představuje afinitný' ligand obsahujúci opakujúce sa strukturálně jednotky cholínu, čo je základora vysokej účinnosti izoláeie a puri fikáoie cholínových enzýmov.

Výhodou nového postupu je, že práprava afinitného liganda je jednoduchá a nevyžaduje drahé chemikálie, umožňuje praoovaí vsádzkovým alebo kolonovým spósobom, afinitný ligand je stály a možno ho použivaí mnohonásobné, umožňuje dosahovaí jednoduchým postupom mnohonásobná purifikáoiu izolovaných enzýmov.

Přikladl

K 10 g vodného roztoku polyetylénimínu obsahujúceho 5 g suchej hmotnosti polyetylónimípu sa přidal 1 ml 25 %-ného roztoku hydroxidu sodného a 0,5 g 2-chlórmetyloxiránu.

Po dokonalom premiešaní reakčnej zmesi za vzniku emulzie dochádza k reakci! za súčasného zahrievania zmesi. Vonkajším chladením sa udržiavala teplota reakčnej zmesi pri teplote 40 až 50 °C. Po skončení sieíovania / 1 h/ sa zosieíováný polyetylenimín mixoval vo vodnom roztoku v mixéri na potřebnú veíkosí častíc /0,1 až 0,3 mm/. Takto připravený sieíovaný polyetylénimín mal napúčací objem 6 ml/g, stupeň sieíovania 0,046 otylénimínových jednotiek pripadajúcich na jednu prieonu hydín 'ypropánovú vazbu a obsah araino skupin 1,65 mol/g, strednú dlžku vonkajších reíazcov 17,4 A, čo odpovedá 4 etylénimínovým jednotkám. Takto připravený sieíovaný polyetylénimín sa suspendoval v 25 ml vody a miešal.ňa elektromagnetickéj miešačke s 5 g metyljodidu pri izbovej teplote po do\u 16 hodin. Nadbytočný metyljodid sa odpařil na vákuovej odparke. Získaný sieíovaný metylovaný polyetylénimín s obsahem amino skupin 0,01 mmol/g sa premyl 500 ml vody a použil po predchádzajúco, premytí 30 ml 0,1 % roztokom albuminu hovadzieho séra a 50 ml fosfátového pufru /5 mM, pH 8/. Ne, takto připravený stípec/15 x 1,5 cm/ sg mahieslo 5 ml konskej plazmy, zriedenej 5 mM fosfátového pfru /5 ml, pH 8/ s aktivitou 200 jednotiek. Stípec sa na to premyl okolo 300 inl horouvedeného fosfátového pufru /do negativnéj reakcie na proteiny v eluáte/. Naviazaná butyrylcholínesteráza sa vytěsnila 150 ml 5 mM fosfátového pufru / pH 7,5/ obsahujúceho 0,1 M chlorid sodný.Uvedená vytěsněná frakcia obsahovala 12,5 mg bielkovín a 148 jednotiek butyrylcholínesterázovoj aktivity, čo představuje 72 % celkovej aktivity a 48,5 násobné prečistenie.

Příklad 2

Postup podía příkladu 1, s tým rozdielom, že sa pracovalo vsádkovým sposobom, t.j.nie na koloně a gél zosieíovaného metylovaného polyetýléniminu /5 g/ o napúSacorn objeme 12 ml/g sa adjústoval 30 ml 0,1 % roztoku albuminu v 50 mM borátovom pufri / ph 9 /. Takto adjustovaný gél sa zmiešal s 5 rol íudskej plazmy, zriedenej do 10 ml horeuvedeným borátovým pufrom /celkový obsah bielkovín 442 mg a celková aktivita 165 jednotiek butyrylcholínesterázovej aktivity. Naviazaná butyrylcholínesterázová aktivita sa vytěsnila 0,2 M roztokom cholínu v 5 iriM borátovom pufri / pH 9, 150 ml/. Vytěsněná frakcia obsahovala 16,8 mg bielkovín a 105 jednotiek aktivity, čo představuje 16,8 násobné prečistenie.

Příklad 3

Ako zdroj acetylcholínesterázy sa použil extrakt z hovadzích erytrooytov, připravený z Tritonu-X-100 postupom podía Ciliv G. a Ožand P.T.: Biochem.Biophys. Acta, 248, 136, 1972 a po odcentrifugovaní / 10 fliOO g, 30 min./sa uvedený extrakt / 5 sil / adjustoval na pH 8,5 mM fosfátovým pufrom / 5 ml / a naniesel na stípec / 20x1,5 cm/ sieíovaného metylovaného polyetylénimínu. Po premytí stípoa 300 ml fosfátového pufru / ph 8 / sa naviazaná acetyl cholínesteráza uvolnila 150 ml 50 mM fosfátového pufru / pH 6 /.

Výíažok 18,7 mg bielkovín a celková aktivita enzýmu 193 jednotiek.

Příklad 4

Postup podía příkladu 2, s tým rozdielom, že k vytesneniu naviazanej butyryl cholínesterázy sa použil / 0,1 M roztok trimetyl / p-aminofenyl / amónium chloridu v 5 mM fosfátovom pufri / pH 8, 150 ml /.

Vytěsněná frakcia obsahovala 12 mg bielkovín a 110 jednotiek aktivity.

Vynález možno uplatnií všade, kde je potřebné izolovaí alebo prečistií enzýmy cholín esterázóvého typu a to či už v priemyselnej praxi alebo vo výskume.

Claims (4)

1. PREDMET VYNÁLEZU

   Spóbob izoláoie enzýmov cholínesterázového typu využitím principu afinitnej chromato grafie vyznačený tým, že biologický roztok obsahujúoi enzým cholínesterázového typu s vý hodou acetylcholínosterázu alebo pseudocholínesterázu po úpravě pH na 7,5 až 9 a iónovej sily pod 0,01 M sa nechá v prvom stupni interagovaí s výhodou na koloně s gélom sieíovaného a metylovaného polyetylénimínu o napúóacom objeme 6 až 12 ml/g a po následnom premytí gélu rovnakým tlmivým roztokom sa v druhom stupni vytěsní zakotvený enzým elúciou s tlraivým roztokom o pH 8, o iónovej sile vyššej ako 0,1 M, alebo tlmivým roztokom o pH 6 alebo účinkom zriedeného roztoku cholínu, připadne inej alkylamoniovej soli.