CS214546B1 - sposob izolácie enzýmov cholínesterázového typu - Google Patents

Description

Vynález sa týká sposobu izolácie enzýmov cholínesterázového typu, a to acetylcholínes-terázy /acetylcholín hydroláza, EC 3. 1. 1. 7/ a pseudocholínesterážy /acylcholín acylhydroláza, EC 3. 1. 1. 8/. Při izolácii a purifikácii enzýmov cholínesterázového typu sa obyčejné vychádza z homogenátu ckaniva / acetylcholínesteráza, pseudocholínnesteráza/ alebo krvnej plazmy za použitia etanolovej frakcionácie / pseudocholínesteráza /, Surgenor D.M., Ellias D.i.J.Amer.chem.soo.76 6049, 1954, připadne áalšej chroraatografie na géli z fosforečnanu vápenatého,resp.ionomeniči / Malstrom B.G., Levin S.,Boman H.GtiActa Chem.Scand.,10, 1077, 1956/ ,’připadne áalšej géůpvej filtrácie / Das P.K.,Liddell J.jBiochem.J.,116,875, 1970/. Rých -lou metodou purifilácie acetylcholínesterázy z hovadzích erytrocytov afinitnou gélovouchromatografiou na Sepharoze s naviazaným d-tubukarinom a elúciou s chloridom sodným po-pisujú Jung J. a Belleau B.j Mol.Pharmacol.,8, 589, 1972. Trimetyl/m-aminofenyl/ amóniumchlorid, hydrochlorid ako afimMmý ligand viazaný na Bio-Gel A popisujú Berman J.D. aYoung M. jProc.Nat.Aoad.Sci US 68, 395, 1971. Nevýhodou uvedených postupov je ich zdíha -vosí, připadne nákladná příprava afinitných ligandov a v áalšom nie jednoduché viazaniena nosič.

Podstata vynálezu spočívá v tom, že biologický roztok obsahujúci enzým cholínesterá-zového typu s výhodou acetylcholínesterázu alebo pseudocholíncesterázu po úpravě pH na7,5 až 9 a iónovej sily pod 0,01 M sa nechá v prvom stupni interagovaí s výhodou na koloněs gélom sieíovaného a metylovaného polyetylénimínu o napúčavora objeme 6 až .12 ml/g a ponáslednom premytí gélu rovnakým tlmivýra roztokom sa v druhom stupni vytěsní zakotvený en-zým elúciou tlmivým roztokom o pH 8 a iónovej sile vyššej ako 0,1 M, alebo tlmivým roz-tokom o pH alebo účinkom zriedeného roztoku cholínu, připadne inej alkylamóniovej soli.

Postup možno aplikovaí tak vsádkovým spósobom, alebo výhodnejšie je pracovaí tak,žepolyetylénimínový modifikovaný ligand je naplněný v koloně, cez ktorú sa prelieva biolo-gický roztok obsahujúci cholínesterázové enzýmy. Kapacita nosiča dosahuje niekoíko tisícjednotiek enzýmu na gram suchého nosiča. Po zakotvení enzýmu sa gél na koloně premýva 60násobným objemom tlmivého roztoku o pH 8 aby sa vytěsnili nežiaduce sprievqdné látky. Povymytí sprievodných látok sa viazaný čistý enzým uvolní z nosiča na koloně elúciou s tl-mivým roztokom o pH 8 a iónovej sily vyššej ako 0,1 M alebo tlmivým roztokom o pH 6, ale-bo zriedeným roztokom cholínu, připadne inej alkylamóniovej soli. Uvedeným postupom sadosiahne takmer 50 násobná purifikácia enzýmu.

Metylováný sieíovaný polyetylénimín představuje afinitný' ligand obsahujúci opakujú-ce sa strukturálně jednotky cholínu, čo je základora vyaokej účinnosti izolácie a puri -fikácie cholínových enzýmov. Výhodou nového postupu je, že práprava afinitného liganda je jednoduchá a nevyžadu-je drahé chemikálie, umožňuje pracovaí vsádzkovým alebo kolonovým spósobom, afinitný li-gand je stály a možno ho používaí mnohonásobné, umožňuje dosahovaí jednoduchým postupommnohonásobná purifikáciu izolovaných enzýmov. Přikladl K 10 g vodného roztoku polyetylénimínu obsahujúceho 5 g suchej hmotnosti polyetyló-nimípu sa přidal 1 ml 25 %-ného roztoku hydroxidu sodného a 0,5 g 2-chlórmetyloxiránu.

Po dokonalom premiešaní rěakčnej zmesi za vzniku emulzie dochádza k reakcii za súčasné-ho zahrievania zmesi. Vonkajším chladením sa udržiavala teplota reakčnej zmesi pri teplo-tě 40 až 50 °C. Po skončení sieíovania / 1 h/ sa zosieíováný polyetylenimín mixoval vovodnom roztoku v mixéri na potřebnú veíkosí častíc /0,1 až 0,3 mm/. Takto připravenýsieíovaný polyetylénimín mal napúčací objem 6 ml/g, stupeň sieíovania 0,046 otylénimí-nových jednotiek pripadajúcich na jednu priečnu hydín 'ypropánovú vazbu a obsah aralnoskupin 1,65 mol/g, středná dlžku vonkajších reíazcov 17,4 A, čo odpovedá 4 etyléni-mínovým jednotkám. Takto připravený sieíovaný polyetylénimín sa suspendoval v 25 ml vo-dy a miešal.ňa elektromagnetickéj miešaěke s 5 g metyljodidu pri izbovej teplete po do-\u 16 hodin. Nadbytočný metyljodid sa odpařil na vákuovej odparke. Získaný sieíovaný

Claims (4)

1. metylovaný polyetylénimín s obsahem amino skupin 0,01 mmol/g sa premyl 500 ml vody a použilpo predchádzajúco, premyti 30 ml 0,1 % roztokom albuminu hovadzieho séra a 50 ml fosfátové-ho pufru /5 mM, pH 8/. Na takto připravený stípec/15 x 1,5 cm/ sa mahieslo 5 ml konskejplazmy, zriedenej 5 mM fosfátového pfru /5 ml, pH 8/ s aktivitou 200 jednotiek. Stípec sana to premyl okolo 300 ml horouvedeného fosfátového pufru /do negativnéj reakcie na pro-teiny v eluáte/. Naviazaná butyrylcholínesteráza sa vytěsnila '150 ml 5 mM fosfátového puf-ru / pH 7,6/ obsahujúceho 0,1 M chlorid sodný.Uvedená vytěsněná frakcia obsahovala 12,5 mgbielkovín a 148 jednotiek butyrylcholínesterázovej aktivity^ co představuje 72 % celkovejaktivity a 48,5 násobné precistenie. Příklad
2. 2 Postup podía příkladu 1, s tým rozdielom, že sa pracovalo vsádkovým sposobom, t.j.niena koloně a gél zosieíovaného metylovaného polyetýléniminu /5 g/ o napúčacom objeme 12 ml/gsa adjústoval 30 ml 0,1 % roztoku albuminu v 50 mM borátovom pufri / ph 9 /. Takto adjusto-vaný gél sa zmiešal s 5 rol íudskej plazmy, zriedenej do 10 ml horeuvedeným borátovým pufrom/celkový obsah bielkovín 442 mg a celková aktivita 165 jednotiek butyrylcholínesterázovejaktivity. Naviazaná butyrylcholínesterázová aktivita sa vytěsnila 0,2 M roztokom cholínu v5 iriM borátovom pufri / pH 9, 150 ml/. Vytěsněná frakcia obsahovala 16,8 mg bielkovín a 105jednotiek aktivity, čo představuje 16,8 násobné precistenie. Příklad
3. 3 Ako zdroj acetylcholínesterázy sa použil extrakt z hovadzích erytrocytov, připravený zTritonu-X-100 postupom podía Ciliv G. a Ožand P.T.: Biochem.Biophys. Acta, 248, 136, 1972a po odcentrifugovaní / 10 fliOO g, 30 min./sa uvedený extrakt / 5 ml / adjustoval na pH 8,5mM fosfátovým pufrom / 5 ml / a naniesel na stípec / 20x1,5 cm/ sieíovaného metylovanéhopolyetylénimínu. Po premyti stípca 300 ml fosfátového pufru / ph 8 / sa naviazaná acetyl -cholínesteráza uvolnila 150 ml 50 mM fosfátového pufru / pH 6 /. Výíažok 18,7 mg bielkovín a celková aktivita enzýmu 193 jednotiek. Příklad
4. 4 Postup podía příkladu 2, s tým rozdielom, že k vytesneniu naviazanej butyryl cholínes-terázy sa použil / 0,1 M roztok trimetyl / p-aminofenyl / amónium chloridu v 5 mM fosfáto-vom pufri / pH 8, 150 ml /. Vytěsněná frakcia obsahovala 12 mg bielkovín a 110 jednotiek aktivity. Vynález možno uplatnií všade, kde je potřebné izolovaí alebo prečistií enzýmy cholín -esterázóvého typu a to či už v priemyselnej praxi alebo vo výskume. PREDMET VYNÁLEZU Spóteob izolácie enzýmov cholínesterázového typu využitím principu afinitnej chromato -grafie vyznačený tým, že biologický roztok obsahujúci enzým cholínesterázového typu s vý -hodou acetylcholínosterázu alebo pseudocholínesterázu po úpravě pH na 7,5 až 9 a iónovejsily pod 0,01 M sa nechá v prvom stupni interagovaí s výhodou na koloně s gélom sieíované-ho a metylovaného polyetylénimínu o napúčacom objeme 6 až 12 ml/g a po následnom premytigélu rovnakým tlmivým roztokom sa v druhom stupni vytěsní zakotvený enzým elúciou s tlrai-vým roztokom o pH 8, o iónovej sile vyššej ako 0,1 M, alebo tlmivým roztokom o pH 6 aleboúčinkom zriedeného roztoku cholínu, připadne inej alkylamoniovej soli.