CS214096B1 - Způsob přípravy imobilizovaných enzymů - Google Patents

Abstract

Vynález se týká imobilizovaných enzymů na mikroporézní polymery a způsobu jejich výroby. Podstata imobilizovaných enzymů podle vynálezu spočívá v tom, že polymerní nosič, vytvořený například na bázi polyetylenterefalátu, polykaprolaktamu, polyfenylenoxidu, má mikroporézní strukturu o o specifickém povrchu od 1 do 700 m /g. Podstata způsobu výroby imobilizovaných enzymů podle vynálezu spočívá v tom, že se na polymerní nosič buá nejprve sorbuje enzym, který se dále zesiluje, nebo se nejprve sorbuje eílovaci činidlo a vzniklý produkt se nechá reagovat s molekulami enzymů. Je však také možné sorbovat na polymerní nosič sílovací činidlo, na které se vážou enzymy, jež se znovu zesilují sílovacím činidlem. Imobilizaoe enzymů se může provádět při teplotě 1 až 40 °C a pH prostředí od 4 do 10 po dobu 0,1 až 48 hodin.

Description

Vynélez se týká způsobu přípravy imobilizovaných enzymů sestávajících z polymerního nosiče, ha který jsou navázány zesilované molekuly enzymů.

Mikroporézní polymery o vysokém aktivním povrchu, vhodné pro imobilizaci enzymů, se připravují tak, že se polymer rozpustí v roztaveném rozpouštědle a po ochlazení roztoku na kompaktní hmotu, která se podrobí k dalšímu mechanickému zpracování, a tavné rozpouštědlo so dokonale vyextrahuje z polymerní struktury extrakčním činidlem, které dobře rozpouští tavné rozpouštědlo a neatakuje polymer. Získá se polymer obvykle v práškové formě s mikroporézní strukturou.

Tímto postupem byl připraven polymerní sorbent na bázi polyetyléntereftalátu za použití 6-kaprolaktamu jako rozpouštědla a vody jako extrakčního činidla. Specifický povrch u připraveného sorbentů tvořeného polyetyléntereftalátem se pohybuje obvykle od 70 do o m /g, velikost částic činí 20 až 30 jum. Polyetyléntereftalát je bílá práškovitá hmota, s dobrou chemicko^ a fysikální stabilitou, o bodu tání 255 °C.

Mikroporézní sorbent na bázi poly-6-kaprolaktamu se dosud připravoval rozpuštěním póly kapr olaktamu v kaprolaktamu, při teplotě 200 °C, jako extrakční činidlo pro kaprolaktam o

se používá voda. Tento sorbent má specifický povrch kolem 15 m /g a střední průměr sférických částic ěiní 100 A s pravidelnou mikroporézní strukturou. Tyto sorbenty jsou chemicky a fyzikálně stálé a mají bod tání 210 °C.

Sorbent na bázi poly-2,6-dimetylfenyloxidu se připravuje za použiti kaprolaktamu jako rozpouštědla při teplotě 145 °C a extrakčního činidla vody. Tento sorbent má pravidelnou mikroporézní strukturu s úzkou distribucí pórů o specifickém povrchu 600 m /g.

Dosud známé způsoby mobilizace řady enzymů na různé nosiče jsou nákladné a připravené enzymy mají nitkou aktivitu vzhledem ke hmotnosti a krátký poločas aktivity.

Dosavadní nedostatky v mobilizaci enzymů na polymery odstraňuje tento vynález. Podstata vynálezu spoěívá v tom, že se enzym při teplotě od 1 do 40 °C a pH prostředí od 4 do 10 navazuje po dobu 0,1 až 48 hodin na polymerní nosič, s výhodou na bázi polyetyléntereftalátu, polykaprolaktamu a pblyfenylenoxidu, o specifickém povrchu od 1 do 700 m /g. Enzym se může nejdřive navázat na polymerní nosič, načež se zasíluje, nebo se na sorbent adsorbuje nejdřive sílovací činidlo, s výhodou glutaraldehyd, hexamethýlendiisokyanát, divinyleulfon, načež se vzniklý produkt nechá reagovat s molekulami enzymů, nebo se na polymerní nosič sorbuje nejdřive silovací činidlo, na vzniklou komposici so navážou enzymy a znovu se zesiluji silovacím činidlem.

Při praktické realizaci se polymerni nosič o vhodné velikosti částic a vhodné velikosti vnitřních pórů (podle charakteru imobilizovaného enzymu), mající schopnost absorbovat bílkoviny, zbaví nečistot promytím ústojem o nízké molaritě a při pl£ optimálním pro stabilitu enzymu určeného k imobilizaci. Promytý polymerní sorbent se převrství roztokem síiovaclho činidla, např. glutaraldehydem, hexametylendiizokyanátem, divinylsulfonem v ústojném roztoku o pH optimálním pro stabilitu imobilizovaného enzymu a třepe se při vhodné teplotě (obvykle 20 - 40 ^eC) po dobu postačující k proniknuti sílovacího činidla do mikroporézní struktury polymerního sorbentů a jeho adsorbci na povrchu sorbentů, 0,5 - 1 hod.

Nosič s adsorbovaným silovacím činidlem se odsaje a převrstvi roztokem enzymu v ústro214 096 jí o pH optimálním pro jeho stabilitu. Takto připravená suspenze se třepe při vhodné teplo ti (podle stability imobilizovaného enzymu) po dostatečně dlouhou dobu, až proběhne silová cí reakce do požadovaného stupně. Po skončení reakce se sorbent s imobilizovaným enzymem promývá střídavě ústojem o vhodném pH a ústojem obsahujícím 1 II NaCl až do negativní reakce na síiovadlo a volný enzym v promyvu.

Pro enzymy, které se snadno sorbují na daný sorbent, lze použít opačného postupu, to jest promytý sorbent se nejdříve převrství roztokem enzymu, nechá určitou dobu sorbovat a pak se teprve dodá do suzpenze roztok glutaraldehydu k provedení zesítění nasorbovaných mo lekul enzymu. Daláí modifikace postupu spočívá v tom, že se sílovací činidlo aplikuje dvakrát, to jest nejprve se nasorbuje činidlo na polymerní nosič, potom se nechá reagovat s enzymy a nakonec se k systému přidá znovu sílovací činidlo a ponechá k reakci,.respektive k zesítění molekul enzymů. Získaný imobilizovaný enzym se po stanovení enzymové aktivity ihned použije nebo se vhodně stabilizuje a skladuje ve formě suspenze ve vhodném ústoji za snížené teploty.

Polymerní sorbenty mají vysoké sorbční vlastnosti pro větáinu bílkovin. Vztah mezi množstvím sorbovaného enzymu a pH prostředí je pro různé enzymy různý. Jednotlivé enzymy se rovněž liší v pevnosti sorbční vazby k témuž polymernímu sorbentu. Sílovací proces enzy mů glutaraldehydem na nosiči lze schematicky znázornit, respektive vysvětlit takto: áldehy dické skupiny glutaraldehydu reagují především s aminoskupinami na povrchu bílkovin za tvorby Schiffovy báze podle reakčního schématu:

Reakce probíhá v širokém rozmezí pH, to jest od 5 do 9. Zvýšená stabilita vzniklých vazeb mezi jednotlivými bílkovinami je podstatně větší než stabilita jednoduché vazby Schiffovy báze. 0 objasnění tohoto rozdílu se snažila řada autorů (F. M. Richarda a J. R. Knowles, J. Mol. Biol.37 (1968) 231; P. Monsan et al., Biochemie 57 (1975) 1281;

P. M. Hardy et. al., J. Chem. Soc. Perkin (1976) 958; S. Branner-Jorgensen, Ensyme Engineering 4 (1978, 393).

Při porovnání navržených teorií byl učiněn závěr, že vazba mezi molekulemi enzymů jo typu Schiffovy báze, která je však stabilizována několikanásobnou vazbou {početných lysinových zbytků na povrchu bílkovin, které stabilizuji iminové vazby proti hydrolýze. Dalším stabilizačním efektem může být tvorba cyklických hydrátů, jako například:

Bílkovina-HN

NH-Bílkovina

Výsledná vzájemná vazba bílkovin se vyznačuje tudíž vysokou stabilitou

214 096

Jednoduchý způsob přípravy vázaných enzymů za použiti poměrně laciného a dostupného polymerního nosiče i dostupných ddlších složek je velkou předností vynálezu proti dosud po psaným imobilizovaným enzymům. Přitom enzymy imobilizované na mikroporézní polymer podle vynálezu mají vysokou aktivitu, zvýšenou stabilitu a možnost opakovaného používání· Při po užití v kolonových nebo jiných typech enzymových reaktorů dávají možnost kontinuální katalýzy. Imobilizované enzymové deriváty mají dobrou mechanickou pevnost a nejsou napadány ml kroorganismy. Svojí jednoduchou a lacinou přípravou i.dobrými vlastnostmi dávají možnost

I ekonomicky výhodných aplikací.

Způsob přípravy imobilizováných enzymů na polymerních sorbentech podle vynálezu je blíže popsán v následujících příkladech.

Příklad 1. , o

Práškovitý mikroporézní polyetyléntereftalát o specifickém povrchu 65 m /g se po dekantaoi vodou promyje 0,1 M fosfátovým ústojem pH 6,9. pak převrství 10% roztokem glutaraldehydu v uvedeném ústoji. Vzniklá suspenze se třepe nebo míchá při teplotě 37 °C po dobu 1 až 5 hodin. Nezreagovaný glutaraldehyd se odstraní promýváním sorbentu 0,1 M fosfátovým ústojem Nosič s adsorbovaným sílovadlem se převrství syřidlem, připraveným z telecích žaludků. Reakce pak probíhá při teplotě 4 °C po dobu 6 až 12 hodin. Po skončení reakce se imobilizo' vaně syřidlo zbavuje volného enzymu střídavým promýváním 0,05 M fosfátovým ústojem pH 5 a týmž ústojem obsahujícím 1 M NaCl až do negativní reakce na přítomnost promývaných látek. Takto připravené imobilizované syřidlo obsahovalo asi 25 mg bílkovin na 1 g suchého nosiče při 20 - 40% zachované enzymové aktivitě. Tímto preparátem lze srážet mléko oddělením primární a sekundární fáze sýření.

Imobilizováným syřidlem lze realizovat první fázi, to jest enzymové štěpení H-kaseinové frakce, při snížené teplotě (až do 25 °C). Následným zvýšením teploty mléka, ošetřeného imobilizovaným enzymem, na 35 °C dojde k vysrážení mléka. Tak například při ISminutovém průběhu primární fáze sýření při 25 °C dojde po zvýšení teploty mléka na 37 °C k jeho vysrážení během jedné minuty při použití jednoho gramu imobilizovaného enzymu na 50 ml mléka,

Příklad 2.

Polykaprolaktamový sorbent o specifickém povrchu 15 m /g byl promyt stejným způsobem a aktivován, jak bylo uvedeno v prvém příkladu. Tekuté klasické syřidlo po ředění 0,1 M fosfátovým ústojem pH 6,9 bylo smícháno s aktivovaným nosičem a třepáno při 10 °C po dobu 2 až 8 hod. Byl získán preparát s obdobnými vlastnostmi, jak bylo uvedeno v příkladu 1.

Přiklad 3.

Κ 1 g polyetyléntereftalátu o specifickém povrchu 70 m /g, upraveného postupem uvedeným v příkladu 1, bylo přidáno 10 ml roztoku invertasy ředěné 0,05 M fosfátovým ústojem pH 5. Fixace enzymu na sorbent probíhala při 4 °C po dobu 8 až 16 hod. Imebilizovaný enzym byl pak promyt stejným postupem jako v příkladu 1. Byly získány preparáty o aktivitě 30 až 60 kat/g suchého nosiče a mající 80 - 98 % zachované aktivity. Množství navázané bílkoviny kolísalo v rozmezí 5 až 15 mg/g nosiče podle čistoty použitého preparátu. Při kontinuální inversi sacharosy v nepřetržitém provozu byl poločas imobilizovaného enzymu nejméně 22 dní.

214 096 4

Příklad 4.

Na 1 g polyetyléntereftalátu o specifickém povrchu 70 m /g, který byl upraven postupem uvedeným v příkladu 1, byl nalit roztok ureasy v 0,1 M fosfátovém ustojí pH 6,0. Fixace enzymů na nosič probíhala při 4 °C po dobu 12 až 16 hod. Po skončeni reakce byl imobilizovaný enzym promýván střídavě 0,01 M fosfátovým ústojem pH 6,0 a týmž ústojem obsahujícím 1 M NaCl až do vymizení aktivity ureasy v promyvu a reakce na volný glutaraldehyd. Promytý zmobilizovaný enzym byl znovu ponechán k sítovací reakci s glutaraldehydem. Podle množství bílkoviny v roztoku při vazebné reakci se podařilo navázat 50 až 100 % bílkoviny. Množství navázané bílkoviny činilo až 96,6 mg/g nosiče při aktivitě 4345 kat/g nosiče. Purifikací enzymů by bylo možno aktivitu imobilizovaného enzymu ještě podstatně zvýšit.

Příklad 5 g dekantovaného polyetyléntereftalátu vodou (cca 15,5 g suchého polymeru bylo suspenzováno ve 27 ml 0,1% roztoku papainu o'proteolytické aktivitě 0,8 jedn. ^A280nm^y/|BÍn’^m® - stanoveno pomoci roztoku denaturovaného hemoglobinu pH 6 při 37 °C, v 0,1 M fosfátovém pufru pH 6,5 obsahujícím cystein (100 mg/100 ml) k ochraně volné skupiny papainu nutné pro aktivitu. Po jednohodinovém mícháni za teploty místnosti byly do suspenze přidány 3 ml 25% vhodného roztoku glutaraldehydu (výsledná koncentrace glutaraldehydu v suspenzi 2,5 %) a mícháno další 1 liod. Po ukončení vazby byl imobilizovaný papain promýván 0,1 M fosfátovým ústojem, používaným při vazbě s 0,5 % roztokem serumalbuminu v 0,1 M fosfátovém ústoji při 6,5, k urychleni vymytí proteasy. Účinnost promývání byla sledována na základě stanovování proteolytické aktivity v promývkách. Proteolytické aktivita promytého preparátu byla stanovena 6,8 J^e(ln*^A280nm^y/,nin‘® suchého vzorku. Množství navázaného papainu stanoveného na základě aminokyselinové analýzy kyselého hydrolyzátu imobilizovaného preparátu bylo 36,6 mg. papainu na g suchého vzorku sorsilenu. Na základě těchto hodnot byla relativní proteolytická aktivita imobilizovaného enzymu k aktivitě vázaného množství enzymu v roztoku vypočtena 23,2 % (aktivita rozpustného papainu byla 0,8 jedn.A_280nin/inin.g).

Příklad 6.

o g dekantovaného a odsátého polyfenylenoxidového sorbentu o specifickém povrchu 560 m /g bylo suspendováno ve 30 ml 5% vodného roztoku glutaraldehydu a mícháno za teploty místnosti 2 hod. Po odsáti byl polymer suspendován ve 27 ml 0,1% roztoku papainu a vazba byla dále prováděna stejně, jak bylo popsáno v příkladu 5. Proteolytická aktivita promytého preparátu byla stanovena 4,4 jedn.A₂₈Q _nn(/min.g suchého vzorku. Množství navázaného papainu, stanovené na základě aminokyselinové analýzy kyselého hydrolysátu imobilizovaného preparátu, bylo 26,4 mg/g. Relativní proteolytická aktivita činila 20,8 %.

Příklad 7.

g dekantovaného a odsátého polykaprolaktamového sorbentu o specifickém povrchu 16 m /g bylo suspendováno v 30 ml 0,1% roztoku chymotrypsinu v 0,04 M tris (hydroxymethyl) aminomethan-HCl pufru pH 8,0. Po 1 hod. míchání při teplotě 4 °C bylo přidáno 10 ml 0,1% roztoku hexamethylendiisothiokyonátu v acetonu a mícháno dalších 24 hod. Po ukončení vazby preparát promýván 1 M NaCl, až v eluátu nebyla detekovatelná proteolytická aktivita a eluát .nevykazoval absorbanci při 280 nm. Na základě aminokyselinové analýzy kyselého hydrolyzátu

214 096 imobilizovaného chymotrypsinu bylo stanoveno 15,6 mg bílkoviny, navázané na 1 g suchého vzorku. Proteolytická aktivita stanovená pomocí roztoku denaturovaného hemoglobinu pH 8 byla 1,4 jedn.AggQ^/min.g suchého preparátu, esterolytická aktivita, stanovená pomocí roztoku N-acetyl-l-tyrosinethylesteru, byla 1060yumolů/min.g suchého vzorku. Relativní proteolytická aktivita = 26,4 % (proteolytická aktivita volného chymotrypsinu = 0,34 jedn. Apigflme/min.mg), relativní esterolytická aktivita = 51,5 5 X, esterolytická aktivita volného chymotrypsinu stanovená pomoci N-acetal-l-tyrosin etylesteru = 132 yumolů/min. mg.

Claims (4)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   1. Způsob přípravy imobilizovaných enzymů sestávajících z polymemího nosiče, na který jsou navázány zesilované molekuly enzymů, vyznačující se tím, že se enzym při teploté od 1 do 40 *C a pH prostředí od 4 do 10 navazuje po dobu 0,1 až 48 hodin na polymerní nosič, s výhodou na bázi polyetyléntereftalátu, polykaprolaktamu a polyfenylonoxidu, o spécio fickém povrchu od 1 do 700 m /g.
2. 2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se na polymerní nosič nejdříve naváže enzym, načež se navázaný enzym zesiluje.
3. 3. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se na sorbent adsorbuje sítovaci činidlo, s výhodou glutaraldehyd, hexametylondiisokyanát, divinylsulfon, načež se vzniklý produkt nechá reagovat s molekulami enzymů.
4. 4. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se na polymerní nosič nejdříve sorbuje sítovací činidlo, na vzniklou komposici se navážou enzymy a znovu se zesiluji sílovacím činidlem.