Vynález se týká způsobu přípravy koncentrovaných purifikovaných sérových albuminů.

Albuminovó preparáty jsou v současnosti Široce používány v laboratorní a klinické terapeutické praxi. Současná technoligická praxe přípravy albuminových preparátů či už laboratorních anebo určených pro terapeutické účely se v převážné míře orientuje na zakoncentrování pomocí lyofilizace.

Metoda lyofilizace klade velké nároky a náročné požadavky na výrobní zařízení, je značné drahé a vyžaduje nepřetržitou servisní pozornost. Navíc je potřeba konstatovat, že v přirozených podmínkách ekosféry naší planety se;za fyziologických ba ani za patologických podmínek nevyskytují tak nízké hodnoty vakua ve spojení s teplotami, které se běžně používají při lyofilizaci co může mít za důsledek změny v terciární anebo kvarterní struktuře u sloučenin bílkovinné povahy.

Technologický postup může taktéž část některých nízkomolekulárních sloučenin s biochemicko-fyziologickou aktivitou v roztoku albuminu koncentračně obohacovat vzhledem k jejich koncentraci ve výchozí surovině, z které byl albumin izolován a jednak zpravidla do albuminového roztoku zanáší nizkomolekulární anorganické něho organické sloučeniny použité jako precipitans.

Odstraňování vody mrazovou sublimací má za následek zvyšování koncentrace albuminu a všech v roztoku přítomných nízkomolekulárních látek a poměrně zvýšená teplota na konci mrazové sublimace je zdrojem aktivační energie dostačující na vytvoření nežádoucích interakcí těchto látek s molekulemi albuminu.

Zakoncentrování bílkovinných roztoků pomocí lyofilizace se sice celosvětově hojně používá, ale hledají se i jiné metody zakoncentrovávání bílkovinných roztoků založené jednak na vakuovém oddestilování vody a prchavých součástí (Smith K. J., Watt J. G.,

Watson C. N., Mastenbroek G. G. A.: Vox Sang. 22, 120, 1972) a jednak na oddělování vody a nízkomolekulárních látek pomocí membránových systémů (Friendli Η., Fournier Ε., Volk T., Kistler P.: Vox Sang. 33, 93, 1977).

Podstata přípravy koncentrovaných purifikovaných roztoků sérových albuminů spočivá podle předloženého vynálezu v tom, že bílkovinný materiál obsahující purifikovaný albumin se rozpouští v takovém množství destilované apyrogenní vody o teplotě 0 °C až +6 °C, aby se hodnota koncentrace bílkovin nacházela v rozmezí 8 + 2 % a hodnota pH mezi 4,0 až 7,0, odstranění nízkomolekulárních sloučenin se z albuminového roztoku provede zejména pomocí průtokové dialýzy anebo gelové filtrace proti destilované vodě o teplotě 0 °C až +6 °C, albuminový roztok se sterilizuje zejména filtrací, vyznačující se tím, že sterilizovaný roztok albuminu se vnese do uzavřené vystérilizováné mrazově koncentrační kolony, která ae zaplní do 75 % jejího objemu, ve které se albuminový roztok stacionárně zmrazí například při -5 °C až -50 °C po dobu 2 až 24 hodin a opět rozmrazí při +5 °G až +20 °C po dobu 2 až 48 hodin a potom se z kolony odebere zahuštěný roztok albuminu o stanovené koncentraci, anebo se proces zmrazování a rozmrazování opakuje, potom se albuminový roztok zpracuje ¹ například sterilní filtrací a pasteurizací.

Vynález je dále objasněn na příkladech provedení jimiž jeho rozsah není ani omezen ani vyčerpán.

Příklady provedení

Příklad ě. 1

Výchozí surovinou je pasta frakce V, izolovaná metodou podle Cohna a spol. (Cohn E. J.,

Strong L. Ε., Hughes W. L., Mulford D. J., Ashworth J. N., Melin Μ., Taylor H. L.:

J. Amer. Chem. Soc. 68, 459, 1946).

Bílkovinný materiál se rozpouští v takovém množství destilované apyrogenní vody o teplotě 0 °C až +6 °C, aby hodnota koncentrace bílkovin se nacházela v rozmezí 8 + 2 %. Rozpouštění se urychluje mícháním. Po rozpuštění se albuminový roztok vyčeří například filtrací.

V technologických poměrech jsou výše uvedené podmínky zpravidla zachovány tehdy když rozpustíme 1 kg albumínové pasty ve 2 000 ml destilované apyrogenní vodě o teplotě 0 °C až +6 °C. Hodnota pH takto vzniklého albuminového roztoku bývá zpravidla mezi pH 4,0 až 7,0 a koncentrace bílkovin bývá v rozmezí 8 + 2 %. Takto připravený roztok purifikovaného albuminu se vyšeřl filtrací a nízkomolekulární sloučeniny se z albuminového roztoku odstraní gelovou filtrací anebo dialyzou.

Albuminový roztok se po odstranění nlzkomolekulárních látek podrobí sterilizaci například filtrací a vysterilizovanou hadičkou se přesaje do vysterilizované koncentrační aparatury.

Za optimální rozměry technologických mrazově koncentračních kolon se považují takové kde průměr kruhové anebo úhlopříčka čtvercové nebo obdélníkové základní plochy kolony ku výšce kolony se pohybují v poměru 1:2 až 1:10.

Množství albuminového roztoku vsazeného do kolony nemá překročit 75 % objemu mrazově koncentrační kolony. Přístup chladu je orientován vertikálním směrem ze spodu k vrchu a až potom má být orientován směrem od vnějšku k vnitřku. Vrchní část kolony má zamrzat poslední a umožnit kapalině vytlačované v důsledku zvětšování objemu, aby mohla vystoupit nezamrzlým středem.

Zmrazování se provádí například při -50 °C až -5 °C po dobu 2 až 24 hodin a rozmrazování při +5 °C až +20 °C po dobu 48 až 2 hodin. Namrazování a rozmrazování má být pomalé a,,plynulé přičemž kapalina zejména po rozmražení se nesmí pohybovat nebo mechanicky míchat. Dobu potřebnou na zmrazení a rozmražení je nutno pro každý konkrétní typ aparatury stanovit empiricky.

Pokud se nejedná o velmi objemné kolony lze zmrazení realizovat vložením kolony do mrazicího pultu a rozmrazování realizovat vyjmutím z mrazicího pultu a umístěním kolony do pokojové teploty. Velkoobjemůvé mrazově koncentrační kolony musí mít chladicí jakož i ohřívací potrubí stočeno hadovi tě okolo kolony od spodu směrem k vrchu kolony.

Roztok albuminu se po stacionárním rozmražení vypouští po malých objemech, například po 100 ml až 500 ml, a vyhodnocuje se na obsah bílkovin, například spektrofotometricky anebo refraktometricky a oddělí se ty frakce kde koncentace poklesla pod hranici našeho zájmu například po 70 g albuminu na litr.

Zekoncentrovaný roztok albuminu se podrobí dalšímu zpracování jako například sterilní filtraci a pasteurizaci. V případě potřeby lze proces zakoncentrovéní opakovat.

Přiklad č. 2

Výchozí surovinou může být bílkovinná pasta albuminu nebo roztok albuminu izolované i pomocí jiných precipitačnlch sloučenin.

Na precipitaci albuminu ze směsi plasmatických anebo sérových krevních bílkovin může být použit síran amonný (Schultze H., Schónenberger M., Matheka H. D.: Behringwerke Mitt. 26, 21, 1952; Dietzel E., Geiger H.: Behringwerke Mitt. 43, 129, 1964), metafosfát (Nitschman H. S., Rickli E., Kistler P.: Vox Sang. 5, 232, 1960), trichloroctové kyselina (Michael S. E.: Biochem. J. 82, 212, 1962), kaprylát (Hoch H., Chanutin A.: Arch. Biochem. Biophys 51, 271, 1954), aceton (Schwert G. W.: J. Amer. Chem. Soc. 79, 139, 1957), eter (Kekwick R. A., MacKay Μ. E., Nance M. ti., Record B. R.: Biochem. J. 60, 671, 1955), etanol (Taylor H. L., Bloom F. C., McCall Κ. B., Hyndmen L. A.: J. Amer. Chem. Soc. 78, 1 353, 1956), etanol spolu s Zn⁺⁺ a Ba⁺⁺ (Cohn E. J., Gurd F. N. R. Surgenor D. M., Barnes B. A., Brown R. K., Derounaux G., Gillespie J. M., Kahnt F. W., Lewer W. F., Liu C. H., Mittelman D., Mouton E. F., Schmid K., Uroma E.: J. Amer. Chem. Soc. 72, 465, 1950) a ionty Zn⁺⁺ Cohn E. J., Tullis J. L., Surgenor D. M , D:'Hont M.: Science 114, 479, 1951).

Bílkovinný materiál se rozpouští v takovém množství destilované apyrogenní vody O teplotě 0 °C až +6 °C, aby hodnota koncentrace bílkovin se nacházela v rozmezí 8 + 2 Rozpouštění se urychluje mícháním. Po rozpuštění se albuminový roztok vyčeří filtrací. Bílkovinný materiál se zpracovává v dalším postupu jako v příkladě č. 1.

V případě, že by spodní výtokový otvor na vypouštění zakonoentrovaného albuminu by nemohl být otevřen lze zakoncentrovaný albumin odsávat vrchem kolony. Odsávání se provádí pomoci tenké skleněné trubice, která se opatrně ponoří až na dno nádoby, na kterou je napojená například gumová hadice s možnosti připojení na vakuum.

Účinnost zakoncentrování lze demonstrovat na tomto případě. Při zakoncentrování 5 litrů albuminu o výchozí koncentraci 70 g na litr byl po prvním zmrazení a rozmražení získaný roztok, který po vypuštění po jednotlivých frakcích a 100 ml vykazoval tento koncentrační gradient.

Ve	frakci	č. 1	bylo	stanoveno	230	e	albuminu	na	litr.
Ve	frakci	č. 5	bylo	stanoveno	200	g	albuminu	na	litr.
Ve	frakci	č. 10	bylo	stanoveno	160	g	albuminu	na	litr.
Ve	frakci	č. 15	bylo	stanoveno	125	e	albuminu	na	litr.
Ve	frakci	č. 20	bylo	stanoveno	70	s	albuminu	na	litr.

Koncentrace ve frakcích 21 našeho zájmu.

až 50 byla pod 70 g albuminu na litr tj. pod hranici

Při zakoncentrování 5 litrů albuminu o výchozí koncentraci 70 g alubmínu na litr byl po dvojnásobném zmrazení a rozmražení získán roztok, který po vypuštění po jednotlivých frakcích a 100 ml vykazoval tento koncentrační gradient.

Ve	frakci	č. 1	bylo	stanoveno	300	e	albuminu	na	litr.
Ve	frakci	č. 5	bylo	stanoveno	260	g	albuminu	na	litr.
Ve	frakci	č. 10	bylo	stanoveno	170	g	albuminu	na	litr.
Ve	frakci	č. 15	bylo	stanoveno	80	g	albuminu	na	litr.
Ve	frakci	č. 20	bylo	stanoveno	20	e	albuminu	na	litr.

Koncentrace ve frakcích 21 je hranice našeho zájmu.

až 50 byla pod 20 g albuminu ha litr tj. mnohem níže než