Vynález se týká způsobu přípravy koncentrovaných purifikovaných roztoků sérových gama globulinů.

Gama globulinové preparáty jsou v současnosti široce používány v laboratorní a klinické terapeutické praxi. Současná technologická praxe přípravy gama globulinových preparátů či už laboratorně diagnoatických anebo určeriých pro terapeutické účely se v převážné míře zakoncentrovává lyofilizací.

Metoda lyofilizace klade velké nároky na výrobní zařízení, je značně drahá a vyžaduje nepřetržitou servisní pozornost. Navíc je nutné konstantovat, že v přirozených podmínkách ekosféry naší planety se za fyziologických ba ani za patologických podmínek nevyskytuji tak nízké hodnoty vakua ve pojení s teplotami, které se používají běžně při lyofilizaci.

Technologický postup může taktéž část některých nlzkomolekulárních sloučenin s biochemicko-fyziologickou aktivitou v roztoku gama globulínu koncentračně obohacovat vzhledem k jejich koncentraci ve výchozí surovině, z které byl gama globulin izolován a jednak zpravidla do gama globulinového roztoku zanáší nízkomolekulární anorganické anebo organické sloučeniny použité jako precipitans.

Odstraňování vody v průběhu lyofilizace má za následek zvyšování koncentrace gama globulinů a všech v roztoku přítomných nlzkomolekulárních látek. Poměrně zvýšená teplota na konci lyofilizace je zdrojem aktivační energie dostačující na vytvoření nežádoucích interakcí těchto látek s molekulami gama globulinů.

Koncentrace bílkoviných roztoků pomocí lyofilizace se sice celosvětově hojně používá ale hledají se i jiné cesty zakoncentrovávání bílkovinnýh roztoků založené jednak na vakuovém oddestilování vody a prchavých součástí (Smith K. J.,, Watt J. G., Watson C. N., Mastenbroek G. G. A.: Vox Sang. 22, 120,1972) a jednak na oddělování vody a nízkomolekulárních látek pomocí membránových systémů. (Friendli H., Fournier E., Volk T., Kistler P.: Vox Sang. 33,93,1977).

Podstata zakoncentrování purifikovaných roztoků sérových gama globulinů spočívá podle předloženého vynálezu v tom, že bílkovinný materiál obsahující purifikovaný gama globulin se rozpouši v takovém množství destilované apyrogenní vody o teplotě 0 °C až +6 °C, aby koncentrace bílkovin se nacházela v rozmezí 8*2^8 hodnota pH mezi 5,0 až 8,0, odstranění nlzkomolekulárních sloučenin se z gama globulinového roztoku provede pomocí průtokové dialýzy anebo gelové filtrace proti 0,1 až 1,0% roztoku chloridu sodného v destilované apyrogenní vodě o teplotě 0 °C až +6 °C, gama globulinový roztok se sterilizuje zejména filtrací vyznačující se tím, že sterilizovaný roztok sérových gama globulinů se vnese do uzavřené sterilizované mrazově koncentrační kovové kolony, kterou zaplní až do 75 % objemu ve které se gama globulinový roztok stacionárně zmrazí například při -5 °C až -50 °C po dobu 2 až 24 hodin a opět stacionárně rozmrazí například při +5 °C až +20 °C po dobu 2 až 48 hodin a potom se z kolony odebere zahuštěný gama globulinový roztok e stanovené koncentraci, anebo se proces zmrazování a rozmrazování opakuje, potom se gama globulinový roztok dále zpracovává například sterilní filtrací.

Vynález je dále objasněn na příkladech provedení jimiž jeho rozsan není ani omezen ani vyčerpán.

Příklady provedení

Přikladl

Výchozí surovinou je frakce II izolovaná metodou podle Cohna a spol. (Cohn E. J.,

Strong L. E., Hughes W. L., Mulford D. J., Ashworth J. N., Melin M., Taylor H. L.: J. Amer.

Chem. Soc. 68, 459, 1946; Cohn E. J., Gurd F. N. R., Surgenor D. M., Barnes B. A., Brown R. K

21^41^

Derounaux G., Gillespie J. M., Kahnt, F. W., Lewer W. F., Liu C. H., Mittelman D., Mouton R, F., Schmid K , Uroma E.: J. Amer. Chem. Soc. 72, 465, 1950) a podle Oneleyho a spol. (Qncley J. L., Malin M., Rickert D. A., Cameron J. W., Gross P. M,: J. Amer. Chem. Soc,

71, 541 , 1949).

Bílkovinný materiál se rozpouští v takovém množství apyrogenní destilované vody o teplotě 0 °C až +6 °C, aby hodnota koncentrace bílkovin se nacházela v rozmezí 8*2%. Rozpouštění se urychluje mícháním. Po rozpuštění se gama globulinový roztok vyěeří například filtrací.

V technologických poměrech jsou výše uvedené podmínky zpravidla zachovány tehdy když rozpouštíme 1 kg gama globulinové pasty ve 2 000 ml destilované apyrogenní vodě o těplotě 0' ?C 'až +6 °C. Hodnota pH takto vzniklého gama globulinového roztoku bývá zpravidla mezi pH 5,0 až 8,0 a koncentrace bílkovin bývá v rozmezí 8 i 2 í6. Takto připravený roztok pufirikovaného gama globulinu se vyěeří například filtrací a nízkomolekulámí sloučeniny se z gama globulinového roztoku odstraní například gelovou filtrací nebo dialýzou proti 0,1 až 1,0% roztoku chloridu sodného v destilovaná apyrogenní vodě o teplotě 0 °C až +6 °C. Gama globulinový roztok se po odstranění nízkomolekulámích látek podrobí sterilizaci například filtraci a umístí se do vysterilizované koncentrační aparatury.

Za optimální rozměry technologických mrazově koncentračních kolon se považují takové kde průměr kruhové nebo úhlopříčka čtvercové nebo obdélníkové základní plochy kolony k. výěce kolony se pohybují v poměru 1:5 až 1:10.

Množství gama globulinového roztoku vsazeného do kolony nemá překročit 75 % objemu mrazově koncentrační kolony. Přístup chladu má být hlavně orientován vertikálním směrem ze spodu ku vrchu a až potom směrem horizontálním směrem od vnějšku k vnitřku. Vrchní část kolony má zamrzat poslední a umožnit kapalině vytlačované v důsledku zvětšování objemu, aby mohla vystoupit nezemřelým středem.

Zmrazování se provádí například při -50 °C až -5 °C po dobu 2 až 24 hodin a rozmrazováni při +5 °C až +20 °C po dobu 48 hodin až 2 hodin. Namrazování a rozmrazování má být pomalé a plynulé přičemž kapalina zejména po, rozmražení se nesmí pohybovat nebo mechanicky míchat. Dobu potřebnou na zmrazení a rozmražení je nutno pro každý konkrétní typ aparatury stanovit empiricky.

Pokud se nejedná o velmi objemné kolony lze zmrazení realizovat vložením kolony do mrazicího pultu a rozmrazování realizovat vyjmutím z mrazicího pultu a umístěním kolony do pokojová teploty. Velkoobjemové mrazově koncentrační kolony musí mít chladicí jakož i ohřívací potrubí stočeno hadovitě okolo kolony od spodu směrem k vrchu kolony.

Roztok gama globulinu se po rozmraženi vypouští po malých objemech, například po 100 ml až 500 ml, a vyhodnocuje se obsah bílkovin, například spektrofotometricky anebo refraktometričky a oddělí se ty frakce kde koncentrace poklesla pod hranici našeho zájmu, tj. například pod 50 g gama globulinu na litr. Zakoncentrovaný roztok gama globulinu se podrobí dalšímu zpracování například sterilní filtraci. V případě potřeby lze proces zakoncentrování opakovat.

Příklad 2

Výchozí surovinou může být bílkovinná pasta gama globulinu izolovaná i pomocí jiných precipitačních sloučenin.

Na precipitaci gama globulinu ze směsi plazmatických nebo sérových krevních bílkovin může být použit síran amonný a hydroxid hlinitý (Schultze Η. E., Matheka H. D.: Behringwerke Mitt. 28,9, 1954; Schulzte Η. E. Schonenberger M., Matheka H. D.: Behringwerke Mitt,

26, 21, 1952), rivanol (Hořejší J., Smetana R.: Acta Med. Scand. 155, 65, 1956), síran sodný (Amiraian K., Leikhim E.J.: J. Imunol. 87, 301, 1961), chlorid hlinitý (Lewin J.: Therapie 9, 523, 1954), DEAE celulóza (Sober H. A., Peterson E. A.: Fed. Proč. 17, 1 116, 1958; Peterson E. A., Sober H. A.: J. Amer. Chem. Soc. 78, 756, 1956; Fahey J. L., Herbett A. P.: J. Biol. Chem. 234, 2 645, 1959; Stanworth D. H.: Nátuře 188, 156, 1960), kyselina kaprylová (Steinbuch M., Audran R.: Rev. Franc. D'etud. Clin. Biol. 14, 1 054, 1969), ionty Zn⁺⁺ a Al⁺⁺⁺(Rejnek J., Škvařil F.: Coli. Czechoslov. Chem. Commun. 22, 1 489, 1957; Rejnek J., škvařil F.: Coli. Czechoslov. Chem. Commun 23, 773, 1958; Krauze R., Naimski K., Zakrewski K.: Acta Biochim. Pol. 8, 209, 1961) a polymetafosfét (Nitsehman H. S., Rickli R., Kistler P.: Vox Sang. 5, 232, 1960).

Bílkovinný materiál se rozpouští v takovém množství apyrogenní destilované vody o teplotě 0 °C až +6 °C, aby hodnota koncentrace bílkovin se nacházela v rozmezí 8 - 2 %. Rozpouštění se urychluje mícháním. Po rozpuštění se gama globulinový roztok vyěeří například filtrací.

Bílkovinný materiál anebo roztok se zpracovává v dalším postupu jako v příkladě č. 1.

V případě, že by spodní výtokový otvor na vypouštění zakoncentrovaného gama globulinu nemohl být otevřen lze zakonoentrovaný gama globulinový roztok odsávat vrchem kolony. Odsávání se provádí pomooí tenké skleněné trubice, která se opatrně ponoří až na dno nádoby, na kterou je napojená například gumová hadice s možností připojení na vakuum.

Účinnost zakoncentrování lze demonstrovat na tomto případě. Při zakoneentrování 3 litrů gama globulínu o výchozí koncentraci 50 g na litr byl po prvním zmrazení a rozmražení získaný roztok, který po vypuštění po jednotlivých frakcích a 50 ml vykazoval tento koncentrační gradient.

Ve frakci č. 1 bylo stanoveno 201 g IgG na litr

Ve frakci č. 5 bylo stanoveno 150 g IgG na litr

Ve frakci č. 10 bylo stanoveno 106 g IgG na litr

Ve frakci č. 20 bylo stanoveno 50 g IgG na litr

Ve frakci č. 15 bylo stanoveno 74 g IgG na litr

Ve frakci č. 20 bylo stanoveno 50 g IgG na litr

Koncentrace ve frakcích 21 až 60 byla pod 50 g na litr tj. pod hranici našeho zájmu.

Při zakoneentrování 3 litrů gama globulínu o výchozí koncentraci 50 g gama globulínu na litr byl po dvojnásobném zmrazení a rozmražení získám roztok, který po vypuštění po jednotlivých frakcích a 50 ml vykazoval tento koncentrační gradient.

Ve frakci ě. Ve frakci č. Ve frakci č. Ve frakci č. Ve frakci č.

bylo stanoveno 360 g IgG na litr 5 bylo stanoveno 196 g IgG na litr 10 bylo stanoveno 110 g IgG na litr 15 bylo stanoveno 55 g IgG na litr 20 bylo stanoveno 39 g IgG na litr.

Koncentrace ve frakcích 21 až 60 byla pod 39 g IgG na litr tj. mnohem níže než je hranice našeho zájmu.