CS210088B1 - způsob přípravy lidského sérového albuminu ze séra,plasmy,nebo surovín,obsahuj1c1ch hemog lobin - Google Patents

Abstract

Způsob přípravy lidského sérového albuminu ze séra,plasmy,nebo surovin, obsabujich hemog lob in.Účetem vynálezu je umožněni jednoduché přípravy čistého lidského sérového albuminu z dárcovské plasmy nebo i z náhradních surovin, obsahujících hemoglobin při zachováni možnosti výroby gama g lobulinu.Toho je dosaženo tim,že balastni biIkoviny,přítomné v roztoku surového albuminu jsou denaturovány kombinovaným působením zvýšené tep loty,chloroformu a kyseliny kaprylovéjdenaturované balasty jsou převedeny do sraženiny, která se z, roztoku čistého albuminu odstraní.

Description

Vynález se týká způsobu přípravy lidského sérového albuminu ze séra,plasmy,nebo surovín,obsahuj1c1ch hemoglobin.

V posledních létech je možno v literatuře pozorovat stoupající snahu nahradit doposud užívaný způsob přípravy sérových albuminů pomoci frakcionace ethanolem jinými, levnějšimi způsoby.Tak byl popsán způsob přípravy čistých sérových a Ibuminů,za ložený na sráženi balastnich bílkovin kombinovaným denaturačnlm působením tepla a chloroformu při teplotě 50 °C /Li bi ch H.,čs.pat. 1 29 936/.Pozděj i byla popsána další denaturačnl metoda,využívající pouze zvýšené teploty bez chloroformu, a to 68 °C;při této vysoké teplotě je už nezbytně nutné chránit albumin před denaturacl kaprylátem /Schneider,Lefévre H.,Fiedler H.,Hc Carty L.J.: Blut, 30,121,1975/.

Předmětem zmíněného čs.patentu 129 936 je způsob přípravy čistých sérových albuminů z normálních i hemolyzovanýeh sér a plasem,vyznačuj 1c1 se t1m,že se balastnl bílkoviny a barviva,obsažená v roztoku surového sérového albuminu,převedou do sraženiny kombinovaným denaturačnlm působením zvýšené teploty a chloroformu a způsob,vyznačuj ici se t1m,že se 5 až 8 % roztok surového albuminu zahřeje spolu s 10 objemovými % chloroformu při pH 4,95 až 5,05 za stálého mícháni na teplotu 50 °C,načež se utvořená sraženina odstraní, supernatant se sfiltruje a po úpravě pH na hodnotu 6,5 až 7,0 lyofilizuje.

Podle tohoto patentu je možno vyrábět jak různé zvířecí,tak i lidský albumin.

Ukázalo se však,že vzhledem k různým specifickým fyzikálně chemickým vlastnostem jednotlivých druhů albuminu je výhodné přizpůsobit reakční podmínky,jako je teplota během denaturace,pH a pod.každému druhu albuminu zvlášť.

Při výrobě lidského albuminu z náhradních surovin,obsahujících hemoglobin / na př. z retroplacentárniho séra nebo z erythromas/ podle zmíněného patentu se objevila potíž, která bránila ve Ikoprovoznlmu využiti.Tyto suroviny obsahuji že lezo,vázané na sérovou bílkovinu transferin.Navázáním železa se vlastnosti transferinu změní natolik,že tato sérová bílkovina během přípravy lidského sérového albuminu podle čs.pat. 129 936 nepřechází už do sraženiny balastů,ale zůstává v roztoku spolu s albuminem a snižuje tak čistotu preparátu pod přípustnou mez.Dále bylo zjištěno,že kyselina kaprylová v kombinaci s chloroformem silně podporuje přechod denaturovaných balastnich bílkovin do sraženiny,je-li přítomna v koncentraci kolem 0,5 hmot.%;bez chloroformu byl účinek kyseliny kaprylová zcela nedostačující k tomu,aby za dané teploty 50 °C bylo odsaženo potřebné minimální čistoty albuminu 96 %.Kyselina kaprylová. v kombinaci s chloroformem dovolila tak snížit potřebnou denaturačnl teplotu o dalšich 5 °C,tedy přibližně na pouhých 45 °C.Kyselina kaprylová tedy v tomto případě nehraje roli tepelného stabilizátoru - to vzhledem k nizké denaturačni teplotě neni zapotřebí - ale roli faktoru,podporujiciho v kombinaci s chloroformem přechod balastů do sraženiny; k tomu je nutno použit přibližně 1 Ox vyšší koncentrace kyseliny kapry lově,než by bylo třeba k tepelné stabilizaci albuminu.

Dalším výzkumem bylo zjištěno,že dokonalejších výsledků jak v dosažené čistotě albuminu,tak i v jeho výtěžku,včetně úplného odstraněni potíži při výrobě albuminu ze surovin,obsahujicich že lezo,vázané na transferin, lze docílit způsobem podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom',že se balastnl bílkoviny ve výchozím roztoku sérových biIkovin,obsahujicim 1 až 10 hmot.Jí albuminu denaturuji kombinovaným působením teploty 35 až 55 °C,chloroformu v množství 2 až 10 hmot.Jí a kyseliny kaprylové v množství 0,1 až 2 hmot. Jí,při pH 5,3 až 7,0,denautrované balasty se převedou do sraženiny při pH 4,5 až 5,5 a při teplotě nejvýše 45 °C,načež se sraženina balastů odstřeni.

Zejména je výhodné připravovat lidský áébumin tak,že se výchozí roztok sérových biIkovin,obsahujíci 4 až 5 hmot. % albuminu denaturuje při 45 °C za přítomnosti chloroformu v množství 5 hmot. Jí,kyseliny kaprylové v množství 0,4 hmot.Jí,při pH 5,8 až 6,O,denaturované balasty se převedou do sraženiny při pH 5,0 až 5,1 a při teplotě 40 °C,načež se sraženina balastů odstraní.

Za nežádoucí přítomnosti že leza,vázaného na transferin je výhodné připravovat lidský albumin tak,že se výchozí roztok sérových bílkovin zbaví i>ontů železa i že leza,vázaného na transferin působením látky,vázajici železo do komplexu nebo do nedisociovateIné sloučeniny,s výhodou působením dvojsodné soli kyseliny ethyléndiamintetraoetové v koncentraci 0,01 až 0,1 hmot. Jí.

Příprava lidského sérového albuminu podle tohoto vynálezu má řadu přednosti.

Především je způsob přípravy podle vynálezu mimořádně šetrný vůči albuminu /pracuje s teplotou okolo 45 °C na rozdíl od zmíněné Schneiderovy metody,praeujici s teplotou 68 °C/. Lidský a Ibumin,připravený podle čs.pat. 1 29 936,tedy dokonce při teplotě 50 °C,vykazoval při předběžných testech biologický poločas v lidském organizmu kolem 22 dni,tedy stejný jako normální nativní a Ibumin,zatimco souběžně testované tuzemské i- zahraniční komerční preparáty lidského albuminu,připravené etanolovou frakcionaci vykazovaly poločasy podstatně kratší,což svědčí o snížené nativitě těchto preparátů.Rychlé odbouráváni aplikovaného albuminu znamená značnou zátěž organismu pacienta a zvýšené nebezpečí nežádoucích reakci.Další přednosti připravy lidského albuminu podle vynálezu je vysoká výtěžnost a Ibuminu,která se při vlastním denaturačnim procesu bliži 100 výrobní ztráty tedy závisi jen na nezbytných pomocných operac1ch,jako je např. filtrace a pod.Velkou výhodou připravy albuminu podle vynálezu je mnohem levnější a jednodušší technologie ve srovnáni s dosud uživanou ethanolovou frakcionaci za chladu; neni zapotřebí žádných chlazených výrobních prostorů a spotřeba energii a pracovni doby je podstatně nižši.Velmi výhodná je i poměrná necitlivost na případné překročeni předepsaného výrobního postupu, např. nedodrženi předepsané teploty při denaturaci,doby zahříváni,pH a pod.Tak např.při zahříváni jen na 40 °C bylo pozorováno jen nepodstatné sníženi čistoty konečného preparátu a ani při zahříváni na 60 °C nebyfcy ještě naměřeny ztráty albuminu denaturaci.Také pH během denaturace se mohlo odchylovat od střední hodnoty 5,9 o několik desetin pH směrem nahoru i dolů bez podstatného ovlivněni výs ledku.Poměrně kritické je jen nastaveni pH potřebného pro dokonalé vysráženi balastů z roztoku,t.j.pH 5,0 až 5,1,kdy při nedodrženi pH o několik desetin směrem dolů klesá výtěžek a směrem nahoru klesá čistota albuminu.

Jednou z nějvětšich předností způsobu přípravy lidského albuminu podle vynálezu je však možnost zpracovávat na-čistý albumin i náhradní suroviny,obsahujici hemoglobin,např. retroplacentárnl sérum nebo erythromasy; veškerá barviva jsou z preparátu během purifikačniho procesu dokonale odstraněna.

Naproti tomu např.zmíněná denaturaínl metoda Schneiderova nemůže vycházet ze surovin, obsahujících hemog lobin,protože krevní barviva přecházejí při jejim použiti do albuminu.

Při trvalém nedostatku výchozí suroviny - lidské krve - dá se předpok ládat,že výroba albuminu z barevných náhradních surovin bude mít i v budoucnu vzestupnou tendenci nejen u nás,ale i v zahraníč1.Při výrobě albuminu podle vynálezu zůstává zachována možnost výroby i oalšleh důležitých krevních derivátů,např.gama globulinu.

Oenaturace balastnich bílkovin podle vynálezu se provádí např. v uzavřeném nerezovém kotli s michdlem a dvojitými stěnami,mezi které je možno napouštět teplou nebo studenou vodu k vyhříváni nebo chlazeni směsi.Vytvořená sraženina balastů se oddělí od roztoku čistého albuminu filtraci nebo centrifugaci.

PŘÍKLAD 1.

Výchozí roztok surového albuminu je možno připravit libovolnou technologi1,pomoci které se rozdělí původní sérum nebo plasma na frakci surových globulinů a frakci surového albuminu.Úíelem tohoto předběžného děleni je zachováni gama globulinové frakce pro dalši zpracováni na ěistý gama globulin.Je výhodné,obsahuje-li výchozí roztok surového albuminu 4 až 8J£ aIbuminu.Postup,popsaný v tomto příkladě,je vhodný pro přípravu čistého albuminu z roztoku surového a Ibuminu,neobsáhuj1c1 ho ethanol,např.z roztoku surového albuminu,který byl získán vysolením albuminové frakce mezi 50 až 75 % nasycením séra nebo plasmy síranem amonným a dialyzou.Předem se připraví směs chloroformu a kyseliny kaprylové,obsahuj1c1 8 hmot.% kyseliny kaprylové.Roztok surového albuminu se převede do uzavřeného nerezového kot le,opatřeného michadlem a dvojitými stěnami . Spust 1 se michadlo a přidá se 5 hmot./í směsi chloroformu a kyseliny kaprylové; dále se přidá 0,01 hmot.% dvojsodné soli kyseliny ethy léndiamintetraoctové /byla-li výchozí surovinou normální lidská plasma/,nebo až 0,04 hmot. % dvojsodné soli kyseliny ethy léndiamintetraoctové/by la-l i výchozí surovinou náhradní barevná surovina,obsahujici že lezo,vázané na transferin/.Pokud bylo že lezo,vázané na transferin dokonale odstraněno již v předchozím frakcionačnlm stupni,nepřidává se dvojsodné sůl kyseliny ethy léndiaminotetraoctová vůbec.Po 10 minutovém mícháni při teplotě místnosti se pomoci 1N-HC l,př1pádně 1N-NaOH upraví pH směsi na hodnotu 6,0.Do pláště kotle se potom vpouští teplá voda,až je dosaženo teploty směsi 45 °C; tato teplota se udržuje po dobu 3 minut.Pak se do pláště kotle vpouští studená voda,až je směs ochlazena na 40 °C. Při této teplotě se upraví pH směsi na hodnotu 5,0 až 5,1 pomoci 1N-HCl;úprava pH nemá· trvat déle než 5 minut.Po úpravě p!f se směs ochladl na teplotu nejvýše 25 °C a vytvořená sraženina balastů se odstraní fitracl nebo centrifugaci.Potom se pH směsi upraví na hodnotu 7,0 a kyselina ethy léndiamintetraoctová se váže do komplexu přídavkem ekvivalentního množství vápenaté soli,nebo se odstraní jiným známým způsobem.Neni-li možno provést úpravu pH na hodnotu 5,0 až 5,1 při 40 °C spolehlivě do 5 minut,směs se před úpravou pH nejprve ochladl na teplotu nejvýše 25 °C,potom se upravi pH a směs se opět zahřeje na teplotu 40 °C na dobu 2 až 5 minut.

příklad 2.

Následující postup je vhodný pro výchozí roztok surového albuminu,který obsahuje 4 až 5 hmot.% ethanolu,např.pro roztok frakce IV+V,získané ethanolovou frakcionaci za ί, chladu.Postup je stejný,jako v přikladu 1 a tim rozdíle»,že se k roztoku surového albuminu přidají pouze 3 hmot.2 chloroformu při zachováni 0,4 hmot.Z kyseliny kaprylové v denaturováné směsi.Postup za přítomnosti alkoholu je méně výhodný,protože je třeba přísněji dodržovat podmínky denaturace /teplotu,dobu zahříváni/.

Preparáty,připravené podle uvedenýctj postupů měly elektroforetickou čistotu kolem 97 % /při denaturačni teplotě 45 °C/ nebo téměř 100 Z/pří denaturačni teplotě 55 až 60 °C/ a nevykazovaly žádné známky denaturace nebo jiného poškozeni albuminu.V předběžných testech bylo dokonce zjištěno,že preparáty lidského a Ibuminu,při pravené při 50 °C podle původního čs.pat. 129 936/tedy za nepřítomnosti tepelných Stabilizátorů albuminu/ vykazuji biologický poločas v lidském organizmu 22 dni,tedy jako nepoškozený,nativni lidský a Ibumin.Naproti tomu všechny srovnávané komerční preparáty lidského a Ibumlnu,tuzemské i zahraní čni,vyrobené ethanolovou frakcionaci za ch ledu,vykazovaly biologické poločasy podstatně kratší/nejvýše 16 dni/.Výtěžek albuminu,připraveného podle yynátezu,se při vlastni denaturačni proceduře blížil 100 Z,takže výrobní ztráty závisí jen na nezbytných dalších operacích, svař.při filtraci a pod.

Možnost uplatněni vynálezu spočívá v jeho zavedeni při výrobě lidského sérového a Ibuminu.Vyná lez představuje účinný purifikační stupeň,která sám o sobě zajišťuje vysokou e lektroforetickou čistotu a nízkou barevnost konečného rpoduktu.Odpadá tedy náročná frakcionace ethanolem za chladu a kromě toho je možno vycházet z náhradních surovin, obsahujících vysoká množství krevních barviv.V předoperaoi se provede jen hrubé rozděleni výchozí suroviny na surový gama globulin a surový albumin; v konečné fázi je možno použit dalších známých postupů,vedoucích až k infusnimu roztoku aIbuainu.Výroba lidského albuminu s využitím vynálezu je podstatně jednodušš1,levnějši a méně náročná na spotřebu energii a pracovní doby ve srovnáni s výrobou albuminu ethanolovou frakcionaci za chladu.Neni zapotřebí žádných chlazených výrobních prostorů a technologické zařízeni je jednoduché.

Pokud bude v dalších podrobných testech potvrzen dlouhý biologický poločas preoarátu, vyrobeného podle vynálezu / srovnatelný s poločasem nativního albuminu/,byl by získán preparát nových kvalitativních vlastnosti ve srovnáni s dosud uživenými komerčlicii albuminy, připravenými ethanolovou frakcionaci.

Claims (3)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   1. Způsob přípravy lidského sérového albuminu ze séra,plasmy,nebo surovin, obsahujících hemog lobin,vyznačuj 1c1 se t1m,že se balastni bílkoviny ve výchozím roztoku sérových bílkovin,obsahujícím 1 až 10 hmot.% albuminu denaturujl kombinovaným působením teploty 35 až 55 °C,chloroformu v množství 2 až 10 hmot.% a kyseliny kaprylové v množství 0,1 až 2 hmot.X,při pH 5,3 až 7,0,denaturované balasty se převedou do sraženiny při pH 4,5 až 5,5 a při teplotě nejvýše 45 °C,načež se sraženina balastů odstraní.
2. 2. Způsob podle bodu 1,vyznačuj 1c1 se t1m,že se výchozí roztok sérových b1 Ikovin,obsahuj 1c1 4 až 5 hmot.% albuminu denaturuje při 45 °c za přítomnosti chloroformu v množství 5 hmot.%,kyše liny kaprylové v množství 0,4 hmot.%,při pH 5,8 až 6,0, denaturované balasty se převedou do sraženiny při pH 5,0 až 5,1 a při teplotč 40 °C, načež se sraženina balastů odstraní.
3. 3. Způsob podle bodu 1 a 2 za nežádoucí přítomnosti že leza,vázaného na transferin vyznačující se tím,že se výchozí roztok sérových bílkovin zbavi iontů železa i železa, vázaného na transferin působením látky,vázaj1c1 železo do komplexu nebo do nedisociovatelné sloučeniny,s výhodou působením dvojsodné soli kyseliny ethyléndiamintetraoctové v koncentraci 0,01 až 0,1 hmot.%.