CS209743B1 - Způsob imobilizace enzymů - Google Patents

Description

Vynález se týká způsobu imobilizace enzymů na míkroporézní polymery na bázi póly-6-kaprolaktamu, polykondenzátů melaminu s formaldehydem a močoviny s formaldehydem, obsahující amíno skupiny.

Míkroporézní polymery o vysokém specifickém povrchu na bázi poly-6-kaprolaktamu nebo polykondenzátů močoviny nebo melaminu s formaldehydem se připravují v podstatě tak, ze se polymer rozpustí v tavenině vhodného rozpouštědla a po ztuhnutí směsi se rozpouštědlo vyextrahuje a polymer vy2 padává ve formě prášku porézně struktury. Polykondenzační sorbenty se připravují polykondenzací močoviny, resp. melaminu s formaldehydem za přítomnosti anorganické soli, která se zabuduje do gelu a po vytvrzení gelu se sůl vyextrahuje obvykle vodou. Tyto polymery se mohou používat přímo k reakci s glutaraldehydem a nebo se obsah aminoskupín může zvýšit mírnou kyselou hydrolýzou. Průběh kyselé hydrolýzy poly-6-kapro laktamu lze znázornit reakčním schématem:

NH-(CH₂)₅“CO-NH-(CH₂)₅-CO-NH-(CH₂)₅-CO kontrolovaná hydrolýza H

NH-(CH₂)₅-CO-NH-(CH₂)₅-C=O NH®- (CH₂)₅“CO—

Volné aminoskupiny porézního polymeru reagují s nadbytkem glutaraldehydu. Je však nutno dokonale vymýt nezreagovaný glutaraldehyd. V dalším stupni se provádí vlastní vazba bílkoviny /H2N-R/ na volné aldehydícké o® skupiny vázané na polymerní strukturu. Tato reakce probíhá v širokém rozmezí pH, tj. od 5 až 9 a předpokládá se vznik Schiffovy báze podle reakčního schématu:

NH₂ + CHO-(CH₂)₃-CHO

N=CH (CH₂)₃-CHO + NH₂-R

N=CH (CH₂)₃-CH=N-R

Vazba Schiffovy báze se však vyznačuje poměrnou labilitou, coz je v rozporu se stabilitou vazby takto imobilízovaných bílkovin. Goldstein a Manecke /Applied Biochemistry and Bioengineering, Vol. 1, Immobilized Enzymes Priciples, L. B. Wingard, Jr.,

E. Katschalski-Katzir a L. Goldstein, Eds,, Academie Press, New York 1976, st. 70 až 71/ uvádějí povahu reakce glutaraldehydu s bílkovinami a syntetickými polymery za dosud neobjasněnou. Knowles a Richards /J. Mol, Biol. 37 /1968/ 231/ prokázali, že roztoky glutaraldehydu obsahují kondenzační produkty. Monsan, Puzo a Mazargull /Biochemie 57 /1975/ 1281/ předpokládají, že glutaraldehyd nereaguje s bílkovinou ve své volné formě, ale jako nenasycený polymer, který dává s aminoskupinami iminové vazby, které jsou stabilizovány konjugací. Glutaraldehydu bylo použito pro imobilizaci celé řady enzymů na různé nosiče /1. Chibata, Ed., Immobilized Enzymes, Kodansha Ltd., Tokyo a Halsted Press, New York, 1978/. Pro vazbu enzymů na nylonové trubičky použili tuto metodu Sundaram a Hornby /FEBS Lett. 10 /1970/ 325/.

Dosavadní nedostatky imobilizace enzymů na mikroporézní polymery o vysokém specifickém povrchu na bázi poly-6-kaprolaktamu, polykondenzátů melaminu s formaldehydem a močoviny s formaldehydem odstraňuje předkládaný vynález. Podstata vynálezu spočívá v tom, že se volné amínoskupiny uvedených polymerních látek nechají nejdříve zreagovat s nadbytkem glutaraldehydu a po odstranění nadbytku glutaraldehydu se na volnou aldehydickou skupinu vázanou na makromolekulami strukturu naváže kovalentně enzym. Obzvláště dobrých výsledků se dosáhne, jestliže se reakce provádí na mikroporézní polymerní látce o specifickém povrchu od 0,1 m^/g do 300 m^/g a dále, jestliže se míkroporézní polymemí látky před reakcí pro zvýšení obsahu aminoskupin podrobí hydrolýze.

Enzymy imobilizované na mikroporézním polymeru podle vynálezu mají vysokou aktivitu, zvýšenou stabilitu a možnost opakovaného používání a pří používání v kolonách nebo jiných typech enzymových reaktorů možnost kontinuální katalýzy. Další výhodou oproti dosud používaným nosičům,jako jsou agorosa, sklo, polyakrylamídové nebo metakrylátové gely má způsob použití mikroporézních polymerů podle vynálezu výhodu v tom, že se jedná o poměrně laciné a v dostatečném množství dostupné materiály. Umožňují se tak ekonomicky výhodné aplikace. Imobilizované enzymové deriváty mají dobrou mechanickou pevnost a nejsou napadány mikroorganismy. Značně zvýšená aktivita enzymů vázaných na mikroporézní polykaprolaktara /dále APA/ byla prokázána na tomto typu o mikroporézní struktuře a na typu polykaprolaktamu připraveného aniontove v suspenzi /dále PAD/ bez mikroporézní úpravy, ale o stejném obsahu aminoskupin. Vzorek APA vázal téměř o jeden řád papainu více než vzorek PAD.

Polymery mikroporézní struktury aplikované podle předkládaného vynálezu mohou být ve formě prášku, fólie, granulí nebo trubek. Prášková forma u polykaprolaktamu se vyznačuje pravidelnými sférickými tvary o průměrné velikosti 0,25 mm. Částice mají pravidelné míkropóry v celé hmotě. U ostatních forem polykaprolaktamových sorbentů se provádí mikroporézní úprava na povrchu, například u granulí, fólií a trubek.

V dalším je vynález a jeho účinky blíže objasněn na příkladech, které však rozsah vynálezu nikterak neomezují.

Příklad 1 g 9uchého mikroporézního APA - obsah aminoskupin 0,033 mmol/g, velikost povrchu

3.2 m²/g, průměrná velikost části 0,25 mm - bylo suspendováno v 50 ml 3N HC1 a inkubováno 1 hod. při 37 °C. Po ukončení hydrolýzy byl vzorek promýván vodou do negativní reakce na chloridy. Množství aminoskupin hydrolýzou stouplo na 0,066 mmol/g při zachování dobrých mechanických vlastností. Práškový preparát byl dále suspendován v 50 ml 5% vodného roztoku glutaraldehydu a míchán za laboratorní teploty 16 hodin.

Po skončení reakce byl nezreagovaný glutaraldehyd vymyt vodou do negativní reakce eluátu s nasyceným roztokem 2,4-dinitrofenylhydrazinu /v 2N HC1/. Pomocí vazby alanin-p-nitroani1 idu bylo stanoveno 14,6 /imol aldehydických skupin na 1 g suchého gelu. Vazba papainu: 2 g vlhkého APA po reakci s glutaraldehydem bylo suspendováno v 50 ml 1% roztoku papainu /o proteolytické aktivitě 1,07 jedn. A280nm/™in, mg /stanovené pomocí roztoku denaturovaného hemoglobinu při 8 při 37 °C v 0,5 M fosfátovém pufru pH 8,0 a mícháno na inkubátoru za laboratorní teploty 16 hodin. Po ukončení vazby byl zmobilizovaný papaín promýván střídavě 0,1 M borátovým pufrem pH 9, obsahujícím 0,002 M EDTA /ety1endiaminotetraoctová kyselina, resp. dvojnásobná sůl/ a 0,005 M merkaptoetanol a 0,1 M acetátovým pufrem pH 4, obsahujícím 0,02 M EDTA a 0,005 M merkaptoetanol tak dlouho, až v eluátu nebyla detekovatelná proteolytická aktivita papainu. Nakonec byl imobilizovaný preparát promyt fosfátovým pufrem obsahujícím cystein /120 g KH2PO4 + 46 g ΝβοΗΡΟ^,ΙΣ Η^θ ⁺ 4,95 g chelatonu do 1 000 ml - pH cca 6; do 100 ml pufru bylo vždy těsně před použitím přidáno 50 mg cysteinu/. V promytém preparátu byla stanovena proteolytícká aktivita, která byla pro kontrolu dostatečného vymytí kovalentně nevázaného papainu opakovaná po opakovaném promývání. Proteolytická aktivita promytého preparátu byla stanovena 2,5 jedn. A28O nm ^na min. a gram suchého vzorku. Množství navázaného papainu stanoveného na základě aminokyselinové analýzy kyselého hydrolyzátu imobilizovaného preparátu bylo 9,9 mg papainu/g suchého vzorku APA. Na základě těchto hodnot byla relativní proteolytícká aktivita, udávající poměr aktivity imobilizovaného enzymu k aktivitě stejného množství enzymu v roztoku, vypočtená 24 % /aktivita rozpustného papainu 1,07 jedn. A28O nm/min.mg/.

Příklad 2

100 g suchého vzorku APA 16 /obsah aminoskupin 0,069 mmol/g, velikost povrchu

3.3 m^/g, průměrná velikost částic 0,25 mm/ bylo necháno přes noc k sorpci vody. Váha odsátého vzorku po sorpci byla 170 g. 100 g tohoto vzorku bylo suspendováno v 300 ml

N HC1 a inkubováno 1 hod. při 37 °C. Po promytí vzorku na negativní reakci na chloridy byl odsátý vzorek suspendován ve 250 mililitrech 5%ního vodného roztoku glutaraldehydu a třepáno přes noc za laboratorní .teploty. Po promytí vzorku vodou do negativní reakce s 2,4-dinitrofenylhydrazinem byl odsátý vzorek suspendován ve 300 ml 1%ního roztoku papainu /0 proteolytické aktivitě 1,07 jedn. A280 _nm/^ra^^n,ing/ ^{v M} fosfátovém pufru pH 7,0. Další zpracování bylo obdobné jako v příkladu 1. Proteolytická aktivita byla stanovena 2,04 jedn.

A_23q _nin/mín, g suchého derivátu. Množství navázaného papainu stanoveného na základě aminokyselinové analýzy kyselého hydrolyzátu zmobilizovaného preparátu 10,7 mg papainu/1 g suchého vzorku sorbentu. Relativní proteolytická aktivita =? 18 Z.

Příklad 3 g suchého vzorku polykaprolaktamu připraveného aniontově v suspenzi /PAD/ - obsah aminoskupin 0,065 mmol/g, průměrná velikost částic 0,25 mm - bylo přímo suspendováno ve 100 ml 5£ního vodného roztoku glutaraldehydu a mícháno za laboratorní teploty 16 hodin. Po promytí vodou do negativní reakce eluátu s 2,5-dínitrofenylbydrazinem byl preparát suspendován ve 100 ml líního roztoku papainu v 0,5 M fosfátovém pufru o pH 7. Další zpracování bylo jako v příkladě

1. Proteolytická aktivita byla 2,2 jedn.

A28O nm/miH» 8 suchého materiálu. Množství navázaného papainu bylo 3,9 mg/g suchého vzorku a relativní proteolytická aktivita = = 53 Z.

Příklad 4 g suchého vzorku PAD bylo modifikováno glutaraldehydem stejně jako v příkladě 3.

Potom byl vzorek suspendován ve 100 ml líního roztoku glukoisomerasy /0 aktivitě enzymu 4,6 jedn., což znamená ^amoly glukosy isomerizované na fruktozu za minutu, při 60 °C a pH 7,0/ v 0,05 M - glycerofo 5fátu sodném pH 7. Vazba probíhala 16 hodin za laboratorní teploty. Po ukončení vazby byl nezreagovaný enzym vymyt vazebným pufrem /do negativní aktivity eluátu/. Aktivita zmobilizované glukosoízomerazy byla 12,3 jedn./g suchého materiálu. Množství navázaného enzymu stanovené na základě aminokyselinové analýzy kyselého hydrolyzátu zmobilizovaného enzymu bylo 4,8 ml/g suchého preparátu. Relativní aktivita byla 56 %.

Příklad 5 g odsátého vzorku APA po reakci s glutaraldehydem podle postupu popsaného v příkladě 1 bylo suspendováno ve 20 ml 2/šnzho roztoku chymotrypsinu /0 proteolytické aktivitě stanovené pomocí roztoku denaturovaného hemoglobinu /pH 8/ 0,34 jedn. A23o _nm/min.mg a esterolytické aktivitě stanovené pomocí N-acetyl-L-tyrosin etylesteru /ATEE/ 132 ,u^molů na min. a mg. ^Turková J. a kol. Biochim. Biophys. Acta 322, /1973/ 1? v 0,05 M fosfátovém pufru pH 7,5. Vazba byla prováděna za stálého míchání na inkubátoru při 4 °C 5 hod. Po ukončení vazby byl preparát promýván 1 M NaCl, až v eluátu nebyla detekovatelná proteolytická aktivita a eluát nevykazoval absorbanci při 3 280 na. Na základe aminokyselinové analýzy kyselého hydrolyzátu zmobilizovaného chymotrypsínu bylo stanoveno 12 mg bílkoviny navázané na 1 g suchého vzorku APA. Proteolytická aktivita stanovená pomocí roztoku hemoglobinu pH byla 1,8 jedn. A28O nm/^m^-^n,S suchého vzorku /relativní proteolytický aktivita - 44 Z/ a esterolytická aktivita stanovená pomocí ATEE byla 1 140 jíímo ly/min. g suchého vzorku /relativní esterolytická aktivita = = 72 Z/.

Příklad 6 polykondenzacz 6-kaprolaktamu katalýzovanou 5 mol Z 1,6-hexametylendiaminem /PAD-7/ obsah aminoskupin 0,582 mmol/g, velikost povrchu 2,3 m^/g, průměrná velikost částic ' 0,28 mm - byl suspendován v 10 ml 2,5 Z nm glutaraldehydu /25 Z komerční glutaraldehydový roztok byl zředěn v poměru 9:1 s 0,1 M fosfátovým pufrem pH 7/. Směs byla nechána v reakci 1 hodinu za sníženého tlaku za účelem rychlej šzho odstranění vzduchu z pórů vzorku a za občasného míchání při laboratorní teplotě. Po vymytí veškerého nezreagovaného glutaraldehydu byl gel suspendován v 20 ml 2 Z roztoku trypsinu /0 aktivitě 1,22amol na min. a mg stanoveno pomocí N-benzoyl-DL.arginin-p-nitroani lidu /ΒΑΡΑ/ metodou pddle Erlangera a kol. /Arch. Biochem Biohhys. 95 / 1 96 1 / 271/J^ v 0,1 M fosfátovém pufru pH 7 obsahujícím 20 mg benzamidinu /vazba v přítomnosti inhibitoru/. Vazba probí hala za stálého míchání při laboratorní teplo tě 4 hodiny. Po ukončení vazby byl nezreagovaný trypsin vymyt střídavě pufrem 0,1 M Tris-HCl, pH 8, obsahujícím 0,02 M CaC^ a 2 M NaCl a 0,1 M octanem sodným obsahujícím 2 M NaCl a 0,02 M CaCl2> pH 4. Nakonec byl vzorek promyt 0,1 M Tris-HCl pufrem obsahujícím pouze 0,02 M CaC^· Aktivita zmobilizovaného trypsinu stanovená pomocí ΒΑΡΑ byla 3,8 |Umol/min.g suchého vzorku, množství navázané bílkoviny stanovené na základě aminokyselinové analýzy kyselého hydrolyzátu zmobilizovaného enzymu byla 4,1 mg trypsin,u/1 g suchého vzorku, relativní aktivita byla 76 Z. Příklad 7

Do 10 g suchého polykondenzátu melaminu s formaldehydem /obsah aminoskupin 0,179 mmol/g, velikost povrchu 175 m^/g, průměrná velikost částic 0,35 mm/ bylo přímo suspendováno ve 100 ml 5£ního vodného roztoku glutaraldehydu a mícháno za laboratorní teploty 16 hodin. Po promytí vodou do negativní reakce eluátu s 2,4-dinitrofenylhydrazinem byl vzorek suspendován ve 100 ml 1%nzho roztoku papainu v 0,5 M fosfátovém pufru o pH 7. Další zpracování bylo stejné jako v příkladě 1. Proteolytická aktivita byla 2,02 jedn. A^gQ _nr^/mzn.g suchého materiálu. Množstvz navázaného papainu 8,0 mg/g suchého sorbentu a relativní proteolytická aktivita = 53 Z.

Příklad 8 g suchého polykondenzačního produktu močoviny s formaldehydem /obsah aminoskupzn 0,019 mmol/g, velikost povrchu 9,6 m^/g, průměrná velikost části 0,30 mm/ bylo přímo suspendováno ve 100 ml vodného roztoku glutaraldehydu a mícháno za laboratorní teploty 16 hodin. Po promytí vodou do negativní reakce eluátu s 2,4-dinitrofenylhydrazinem byl vzorek suspendován ve 100 ml líního roztoku papainu v 0,5 M fosfátovém pufru o pH 7. Další zpracování bylo jako v příkladě 1. Proteolytická aktivita byla 2,02 jedn. A280 nm/min.g suchého materiálu. Množstvz vázaného papainu bylo 2,9 mg/g suchého vzorku a relativní proteolytzcká aktivita = 53 Z.

g suchého polykaprolaktamu připraveného

Claims (3)

1. PŘEDMĚT

   1. Způsob imobilizace enzymů na míkroporézní polymery o vysokém specifickém povrchu na bázi poly-6-kapro1 aktamu, polykondenzátů melaminu s formaldehydem a močoviny s formaldehydem, vyznačující se tím, že se volné aminoskupiny uvedených polymerních látek nechají nejdříve zreagovat s nadbytkem glutaraldehydu a po odstranění nadbytku glutaraldehydu se na volnou aldehydickou skupinu vázanou na makromolekulami strukturu naváže kovalentně enzym.

   YNÁLEZU
2. 2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se reakce provádí na mikroporézní polymerní látce o specifickém povrchu od 0,1 m^/g do 300 m^/g.
3. 3. Způsob imobilizace enzymů podle bodů 1 a 2, vyznačující se tím, že mikroporézní polymerní látky se před reakcí pro zvýšení obsahu aminoekupin podrobí hydrolýze.