CS209743B1 - Způsob imobilizace enzymů - Google Patents
Způsob imobilizace enzymů Download PDFInfo
- Publication number
- CS209743B1 CS209743B1 CS137780A CS137780A CS209743B1 CS 209743 B1 CS209743 B1 CS 209743B1 CS 137780 A CS137780 A CS 137780A CS 137780 A CS137780 A CS 137780A CS 209743 B1 CS209743 B1 CS 209743B1
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- sample
- dry
- glutaraldehyde
- microporous
- reaction
- Prior art date
Links
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims description 16
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 8
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 23
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 18
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 13
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 6
- 229920000877 Melamine resin Polymers 0.000 claims description 5
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 5
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims description 5
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 5
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 claims description 3
- IVJISJACKSSFGE-UHFFFAOYSA-N formaldehyde;1,3,5-triazine-2,4,6-triamine Chemical compound O=C.NC1=NC(N)=NC(N)=N1 IVJISJACKSSFGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 3
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 claims description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 claims 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 18
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 18
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 18
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 18
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 13
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 6
- 229920002292 Nylon 6 Polymers 0.000 description 5
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- JBKVHLHDHHXQEQ-UHFFFAOYSA-N epsilon-caprolactam Chemical compound O=C1CCCCCN1 JBKVHLHDHHXQEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- HORQAOAYAYGIBM-UHFFFAOYSA-N 2,4-dinitrophenylhydrazine Chemical compound NNC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O HORQAOAYAYGIBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 4
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000006068 polycondensation reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 4
- YWAVLHZJMWEYTA-YDALLXLXSA-N ATEE Chemical compound O.CCOC(=O)[C@@H](NC(C)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 YWAVLHZJMWEYTA-YDALLXLXSA-N 0.000 description 3
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 3
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 3
- 230000000058 esterolytic effect Effects 0.000 description 3
- JDSHMPZPIAZGSV-UHFFFAOYSA-N melamine Chemical compound NC1=NC(N)=NC(N)=N1 JDSHMPZPIAZGSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000007836 Chlorogalum pomeridianum Nutrition 0.000 description 2
- 240000006670 Chlorogalum pomeridianum Species 0.000 description 2
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002262 Schiff base Substances 0.000 description 2
- 150000004753 Schiff bases Chemical class 0.000 description 2
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 150000003841 chloride salts Chemical class 0.000 description 2
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- NAQMVNRVTILPCV-UHFFFAOYSA-N hexane-1,6-diamine Chemical compound NCCCCCCN NAQMVNRVTILPCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M Methacrylate Chemical compound CC(=C)C([O-])=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920001807 Urea-formaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 108700040099 Xylose isomerases Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- -1 agorose Substances 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N benzamidine Chemical compound NC(=N)C1=CC=CC=C1 PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007859 condensation product Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 1
- PXFUDSMGEYRNNC-LURJTMIESA-N l-alanine-4-nitroanilide Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 PXFUDSMGEYRNNC-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 239000000155 melt Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000002861 polymer material Substances 0.000 description 1
- ODGAOXROABLFNM-UHFFFAOYSA-N polynoxylin Chemical compound O=C.NC(N)=O ODGAOXROABLFNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229960002901 sodium glycerophosphate Drugs 0.000 description 1
- REULQIKBNNDNDX-UHFFFAOYSA-M sodium;2,3-dihydroxypropyl hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OCC(O)COP(O)([O-])=O REULQIKBNNDNDX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000004381 surface treatment Methods 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
Landscapes
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Description
Vynález se týká způsobu imobilizace enzymů na míkroporézní polymery na bázi póly-6-kaprolaktamu, polykondenzátů melaminu s formaldehydem a močoviny s formaldehydem, obsahující amíno skupiny.
Míkroporézní polymery o vysokém specifickém povrchu na bázi poly-6-kaprolaktamu nebo polykondenzátů močoviny nebo melaminu s formaldehydem se připravují v podstatě tak, ze se polymer rozpustí v tavenině vhodného rozpouštědla a po ztuhnutí směsi se rozpouštědlo vyextrahuje a polymer vy2 padává ve formě prášku porézně struktury. Polykondenzační sorbenty se připravují polykondenzací močoviny, resp. melaminu s formaldehydem za přítomnosti anorganické soli, která se zabuduje do gelu a po vytvrzení gelu se sůl vyextrahuje obvykle vodou. Tyto polymery se mohou používat přímo k reakci s glutaraldehydem a nebo se obsah aminoskupín může zvýšit mírnou kyselou hydrolýzou. Průběh kyselé hydrolýzy poly-6-kapro laktamu lze znázornit reakčním schématem:
NH-(CH2)5“CO-NH-(CH2)5-CO-NH-(CH2)5-CO kontrolovaná hydrolýza H
NH-(CH2)5-CO-NH-(CH2)5-C=O NH®- (CH2)5“CO—
Volné aminoskupiny porézního polymeru reagují s nadbytkem glutaraldehydu. Je však nutno dokonale vymýt nezreagovaný glutaraldehyd. V dalším stupni se provádí vlastní vazba bílkoviny /H2N-R/ na volné aldehydícké o® skupiny vázané na polymerní strukturu. Tato reakce probíhá v širokém rozmezí pH, tj. od 5 až 9 a předpokládá se vznik Schiffovy báze podle reakčního schématu:
NH2 + CHO-(CH2)3-CHO
N=CH (CH2)3-CHO + NH2-R
N=CH (CH2)3-CH=N-R
Vazba Schiffovy báze se však vyznačuje poměrnou labilitou, coz je v rozporu se stabilitou vazby takto imobilízovaných bílkovin. Goldstein a Manecke /Applied Biochemistry and Bioengineering, Vol. 1, Immobilized Enzymes Priciples, L. B. Wingard, Jr.,
E. Katschalski-Katzir a L. Goldstein, Eds,, Academie Press, New York 1976, st. 70 až 71/ uvádějí povahu reakce glutaraldehydu s bílkovinami a syntetickými polymery za dosud neobjasněnou. Knowles a Richards /J. Mol, Biol. 37 /1968/ 231/ prokázali, že roztoky glutaraldehydu obsahují kondenzační produkty. Monsan, Puzo a Mazargull /Biochemie 57 /1975/ 1281/ předpokládají, že glutaraldehyd nereaguje s bílkovinou ve své volné formě, ale jako nenasycený polymer, který dává s aminoskupinami iminové vazby, které jsou stabilizovány konjugací. Glutaraldehydu bylo použito pro imobilizaci celé řady enzymů na různé nosiče /1. Chibata, Ed., Immobilized Enzymes, Kodansha Ltd., Tokyo a Halsted Press, New York, 1978/. Pro vazbu enzymů na nylonové trubičky použili tuto metodu Sundaram a Hornby /FEBS Lett. 10 /1970/ 325/.
Dosavadní nedostatky imobilizace enzymů na mikroporézní polymery o vysokém specifickém povrchu na bázi poly-6-kaprolaktamu, polykondenzátů melaminu s formaldehydem a močoviny s formaldehydem odstraňuje předkládaný vynález. Podstata vynálezu spočívá v tom, že se volné amínoskupiny uvedených polymerních látek nechají nejdříve zreagovat s nadbytkem glutaraldehydu a po odstranění nadbytku glutaraldehydu se na volnou aldehydickou skupinu vázanou na makromolekulami strukturu naváže kovalentně enzym. Obzvláště dobrých výsledků se dosáhne, jestliže se reakce provádí na mikroporézní polymerní látce o specifickém povrchu od 0,1 m^/g do 300 m^/g a dále, jestliže se míkroporézní polymemí látky před reakcí pro zvýšení obsahu aminoskupin podrobí hydrolýze.
Enzymy imobilizované na mikroporézním polymeru podle vynálezu mají vysokou aktivitu, zvýšenou stabilitu a možnost opakovaného používání a pří používání v kolonách nebo jiných typech enzymových reaktorů možnost kontinuální katalýzy. Další výhodou oproti dosud používaným nosičům,jako jsou agorosa, sklo, polyakrylamídové nebo metakrylátové gely má způsob použití mikroporézních polymerů podle vynálezu výhodu v tom, že se jedná o poměrně laciné a v dostatečném množství dostupné materiály. Umožňují se tak ekonomicky výhodné aplikace. Imobilizované enzymové deriváty mají dobrou mechanickou pevnost a nejsou napadány mikroorganismy. Značně zvýšená aktivita enzymů vázaných na mikroporézní polykaprolaktara /dále APA/ byla prokázána na tomto typu o mikroporézní struktuře a na typu polykaprolaktamu připraveného aniontove v suspenzi /dále PAD/ bez mikroporézní úpravy, ale o stejném obsahu aminoskupin. Vzorek APA vázal téměř o jeden řád papainu více než vzorek PAD.
Polymery mikroporézní struktury aplikované podle předkládaného vynálezu mohou být ve formě prášku, fólie, granulí nebo trubek. Prášková forma u polykaprolaktamu se vyznačuje pravidelnými sférickými tvary o průměrné velikosti 0,25 mm. Částice mají pravidelné míkropóry v celé hmotě. U ostatních forem polykaprolaktamových sorbentů se provádí mikroporézní úprava na povrchu, například u granulí, fólií a trubek.
V dalším je vynález a jeho účinky blíže objasněn na příkladech, které však rozsah vynálezu nikterak neomezují.
Příklad 1 g 9uchého mikroporézního APA - obsah aminoskupin 0,033 mmol/g, velikost povrchu
3.2 m2/g, průměrná velikost části 0,25 mm - bylo suspendováno v 50 ml 3N HC1 a inkubováno 1 hod. při 37 °C. Po ukončení hydrolýzy byl vzorek promýván vodou do negativní reakce na chloridy. Množství aminoskupin hydrolýzou stouplo na 0,066 mmol/g při zachování dobrých mechanických vlastností. Práškový preparát byl dále suspendován v 50 ml 5% vodného roztoku glutaraldehydu a míchán za laboratorní teploty 16 hodin.
Po skončení reakce byl nezreagovaný glutaraldehyd vymyt vodou do negativní reakce eluátu s nasyceným roztokem 2,4-dinitrofenylhydrazinu /v 2N HC1/. Pomocí vazby alanin-p-nitroani1 idu bylo stanoveno 14,6 /imol aldehydických skupin na 1 g suchého gelu. Vazba papainu: 2 g vlhkého APA po reakci s glutaraldehydem bylo suspendováno v 50 ml 1% roztoku papainu /o proteolytické aktivitě 1,07 jedn. A280nm/™in, mg /stanovené pomocí roztoku denaturovaného hemoglobinu při 8 při 37 °C v 0,5 M fosfátovém pufru pH 8,0 a mícháno na inkubátoru za laboratorní teploty 16 hodin. Po ukončení vazby byl zmobilizovaný papaín promýván střídavě 0,1 M borátovým pufrem pH 9, obsahujícím 0,002 M EDTA /ety1endiaminotetraoctová kyselina, resp. dvojnásobná sůl/ a 0,005 M merkaptoetanol a 0,1 M acetátovým pufrem pH 4, obsahujícím 0,02 M EDTA a 0,005 M merkaptoetanol tak dlouho, až v eluátu nebyla detekovatelná proteolytická aktivita papainu. Nakonec byl imobilizovaný preparát promyt fosfátovým pufrem obsahujícím cystein /120 g KH2PO4 + 46 g ΝβοΗΡΟ^,ΙΣ Η^θ + 4,95 g chelatonu do 1 000 ml - pH cca 6; do 100 ml pufru bylo vždy těsně před použitím přidáno 50 mg cysteinu/. V promytém preparátu byla stanovena proteolytícká aktivita, která byla pro kontrolu dostatečného vymytí kovalentně nevázaného papainu opakovaná po opakovaném promývání. Proteolytická aktivita promytého preparátu byla stanovena 2,5 jedn. A28O nm na min. a gram suchého vzorku. Množství navázaného papainu stanoveného na základě aminokyselinové analýzy kyselého hydrolyzátu imobilizovaného preparátu bylo 9,9 mg papainu/g suchého vzorku APA. Na základě těchto hodnot byla relativní proteolytícká aktivita, udávající poměr aktivity imobilizovaného enzymu k aktivitě stejného množství enzymu v roztoku, vypočtená 24 % /aktivita rozpustného papainu 1,07 jedn. A28O nm/min.mg/.
Příklad 2
100 g suchého vzorku APA 16 /obsah aminoskupin 0,069 mmol/g, velikost povrchu
3.3 m^/g, průměrná velikost částic 0,25 mm/ bylo necháno přes noc k sorpci vody. Váha odsátého vzorku po sorpci byla 170 g. 100 g tohoto vzorku bylo suspendováno v 300 ml
N HC1 a inkubováno 1 hod. při 37 °C. Po promytí vzorku na negativní reakci na chloridy byl odsátý vzorek suspendován ve 250 mililitrech 5%ního vodného roztoku glutaraldehydu a třepáno přes noc za laboratorní .teploty. Po promytí vzorku vodou do negativní reakce s 2,4-dinitrofenylhydrazinem byl odsátý vzorek suspendován ve 300 ml 1%ního roztoku papainu /0 proteolytické aktivitě 1,07 jedn. A280 nm/ra^n,ing/ v M fosfátovém pufru pH 7,0. Další zpracování bylo obdobné jako v příkladu 1. Proteolytická aktivita byla stanovena 2,04 jedn.
A_23q nin/mín, g suchého derivátu. Množství navázaného papainu stanoveného na základě aminokyselinové analýzy kyselého hydrolyzátu zmobilizovaného preparátu 10,7 mg papainu/1 g suchého vzorku sorbentu. Relativní proteolytická aktivita =? 18 Z.
Příklad 3 g suchého vzorku polykaprolaktamu připraveného aniontově v suspenzi /PAD/ - obsah aminoskupin 0,065 mmol/g, průměrná velikost částic 0,25 mm - bylo přímo suspendováno ve 100 ml 5£ního vodného roztoku glutaraldehydu a mícháno za laboratorní teploty 16 hodin. Po promytí vodou do negativní reakce eluátu s 2,5-dínitrofenylbydrazinem byl preparát suspendován ve 100 ml líního roztoku papainu v 0,5 M fosfátovém pufru o pH 7. Další zpracování bylo jako v příkladě
1. Proteolytická aktivita byla 2,2 jedn.
A28O nm/miH» 8 suchého materiálu. Množství navázaného papainu bylo 3,9 mg/g suchého vzorku a relativní proteolytická aktivita = = 53 Z.
Příklad 4 g suchého vzorku PAD bylo modifikováno glutaraldehydem stejně jako v příkladě 3.
Potom byl vzorek suspendován ve 100 ml líního roztoku glukoisomerasy /0 aktivitě enzymu 4,6 jedn., což znamená ^amoly glukosy isomerizované na fruktozu za minutu, při 60 °C a pH 7,0/ v 0,05 M - glycerofo 5fátu sodném pH 7. Vazba probíhala 16 hodin za laboratorní teploty. Po ukončení vazby byl nezreagovaný enzym vymyt vazebným pufrem /do negativní aktivity eluátu/. Aktivita zmobilizované glukosoízomerazy byla 12,3 jedn./g suchého materiálu. Množství navázaného enzymu stanovené na základě aminokyselinové analýzy kyselého hydrolyzátu zmobilizovaného enzymu bylo 4,8 ml/g suchého preparátu. Relativní aktivita byla 56 %.
Příklad 5 g odsátého vzorku APA po reakci s glutaraldehydem podle postupu popsaného v příkladě 1 bylo suspendováno ve 20 ml 2/šnzho roztoku chymotrypsinu /0 proteolytické aktivitě stanovené pomocí roztoku denaturovaného hemoglobinu /pH 8/ 0,34 jedn. A23o nm/min.mg a esterolytické aktivitě stanovené pomocí N-acetyl-L-tyrosin etylesteru /ATEE/ 132 ,umolů na min. a mg. ^Turková J. a kol. Biochim. Biophys. Acta 322, /1973/ 1? v 0,05 M fosfátovém pufru pH 7,5. Vazba byla prováděna za stálého míchání na inkubátoru při 4 °C 5 hod. Po ukončení vazby byl preparát promýván 1 M NaCl, až v eluátu nebyla detekovatelná proteolytická aktivita a eluát nevykazoval absorbanci při 3 280 na. Na základe aminokyselinové analýzy kyselého hydrolyzátu zmobilizovaného chymotrypsínu bylo stanoveno 12 mg bílkoviny navázané na 1 g suchého vzorku APA. Proteolytická aktivita stanovená pomocí roztoku hemoglobinu pH byla 1,8 jedn. A28O nm/m^-n,S suchého vzorku /relativní proteolytický aktivita - 44 Z/ a esterolytická aktivita stanovená pomocí ATEE byla 1 140 jíímo ly/min. g suchého vzorku /relativní esterolytická aktivita = = 72 Z/.
Příklad 6 polykondenzacz 6-kaprolaktamu katalýzovanou 5 mol Z 1,6-hexametylendiaminem /PAD-7/ obsah aminoskupin 0,582 mmol/g, velikost povrchu 2,3 m^/g, průměrná velikost částic ' 0,28 mm - byl suspendován v 10 ml 2,5 Z nm glutaraldehydu /25 Z komerční glutaraldehydový roztok byl zředěn v poměru 9:1 s 0,1 M fosfátovým pufrem pH 7/. Směs byla nechána v reakci 1 hodinu za sníženého tlaku za účelem rychlej šzho odstranění vzduchu z pórů vzorku a za občasného míchání při laboratorní teplotě. Po vymytí veškerého nezreagovaného glutaraldehydu byl gel suspendován v 20 ml 2 Z roztoku trypsinu /0 aktivitě 1,22amol na min. a mg stanoveno pomocí N-benzoyl-DL.arginin-p-nitroani lidu /ΒΑΡΑ/ metodou pddle Erlangera a kol. /Arch. Biochem Biohhys. 95 / 1 96 1 / 271/J^ v 0,1 M fosfátovém pufru pH 7 obsahujícím 20 mg benzamidinu /vazba v přítomnosti inhibitoru/. Vazba probí hala za stálého míchání při laboratorní teplo tě 4 hodiny. Po ukončení vazby byl nezreagovaný trypsin vymyt střídavě pufrem 0,1 M Tris-HCl, pH 8, obsahujícím 0,02 M CaC^ a 2 M NaCl a 0,1 M octanem sodným obsahujícím 2 M NaCl a 0,02 M CaCl2> pH 4. Nakonec byl vzorek promyt 0,1 M Tris-HCl pufrem obsahujícím pouze 0,02 M CaC^· Aktivita zmobilizovaného trypsinu stanovená pomocí ΒΑΡΑ byla 3,8 |Umol/min.g suchého vzorku, množství navázané bílkoviny stanovené na základě aminokyselinové analýzy kyselého hydrolyzátu zmobilizovaného enzymu byla 4,1 mg trypsin,u/1 g suchého vzorku, relativní aktivita byla 76 Z. Příklad 7
Do 10 g suchého polykondenzátu melaminu s formaldehydem /obsah aminoskupin 0,179 mmol/g, velikost povrchu 175 m^/g, průměrná velikost částic 0,35 mm/ bylo přímo suspendováno ve 100 ml 5£ního vodného roztoku glutaraldehydu a mícháno za laboratorní teploty 16 hodin. Po promytí vodou do negativní reakce eluátu s 2,4-dinitrofenylhydrazinem byl vzorek suspendován ve 100 ml 1%nzho roztoku papainu v 0,5 M fosfátovém pufru o pH 7. Další zpracování bylo stejné jako v příkladě 1. Proteolytická aktivita byla 2,02 jedn. A^gQ nr^/mzn.g suchého materiálu. Množstvz navázaného papainu 8,0 mg/g suchého sorbentu a relativní proteolytická aktivita = 53 Z.
Příklad 8 g suchého polykondenzačního produktu močoviny s formaldehydem /obsah aminoskupzn 0,019 mmol/g, velikost povrchu 9,6 m^/g, průměrná velikost části 0,30 mm/ bylo přímo suspendováno ve 100 ml vodného roztoku glutaraldehydu a mícháno za laboratorní teploty 16 hodin. Po promytí vodou do negativní reakce eluátu s 2,4-dinitrofenylhydrazinem byl vzorek suspendován ve 100 ml líního roztoku papainu v 0,5 M fosfátovém pufru o pH 7. Další zpracování bylo jako v příkladě 1. Proteolytická aktivita byla 2,02 jedn. A280 nm/min.g suchého materiálu. Množstvz vázaného papainu bylo 2,9 mg/g suchého vzorku a relativní proteolytzcká aktivita = 53 Z.
g suchého polykaprolaktamu připraveného
Claims (3)
- PŘEDMĚT1. Způsob imobilizace enzymů na míkroporézní polymery o vysokém specifickém povrchu na bázi poly-6-kapro1 aktamu, polykondenzátů melaminu s formaldehydem a močoviny s formaldehydem, vyznačující se tím, že se volné aminoskupiny uvedených polymerních látek nechají nejdříve zreagovat s nadbytkem glutaraldehydu a po odstranění nadbytku glutaraldehydu se na volnou aldehydickou skupinu vázanou na makromolekulami strukturu naváže kovalentně enzym.YNÁLEZU
- 2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se reakce provádí na mikroporézní polymerní látce o specifickém povrchu od 0,1 m^/g do 300 m^/g.
- 3. Způsob imobilizace enzymů podle bodů 1 a 2, vyznačující se tím, že mikroporézní polymerní látky se před reakcí pro zvýšení obsahu aminoekupin podrobí hydrolýze.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS137780A CS209743B1 (cs) | 1980-02-28 | 1980-02-28 | Způsob imobilizace enzymů |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS137780A CS209743B1 (cs) | 1980-02-28 | 1980-02-28 | Způsob imobilizace enzymů |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS209743B1 true CS209743B1 (cs) | 1981-12-31 |
Family
ID=5347995
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS137780A CS209743B1 (cs) | 1980-02-28 | 1980-02-28 | Způsob imobilizace enzymů |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS209743B1 (cs) |
-
1980
- 1980-02-28 CS CS137780A patent/CS209743B1/cs unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4141857A (en) | Support matrices for immobilized enzymes | |
| US4229536A (en) | Process for preparing immobilized enzymes | |
| KR940005581B1 (ko) | 효소의 고정화방법 및 고정화 효소 | |
| US4258133A (en) | Enzyme-support complexes | |
| GB1586364A (en) | Porous inorganic materials | |
| Iyengar et al. | Urease bound to chitin with glutaraldehyde | |
| US4206259A (en) | Support matrices for immobilized enzymes | |
| US4193910A (en) | Preparation of support matrices for immobilized enzymes | |
| CS209424B2 (en) | Method of making the anorganic-organic base for immobilization of enzymes | |
| FI101400B (fi) | Menetelmä kantajaan sidottujen entsyymien valmistamiseksi | |
| CS209743B1 (cs) | Způsob imobilizace enzymů | |
| US4218363A (en) | Preparation of support matrices for immobilized enzymes | |
| JPS596885A (ja) | 不溶性生体触媒の製法 | |
| US4250080A (en) | Preparation of support matrices for immobilized enzymes | |
| CA1128917A (en) | Support matrices for immobilized enzymes | |
| JPS61181376A (ja) | 固定化された生物学的活性化合物の製造方法 | |
| Anita et al. | Urease immobilized on nylon: preparation and properties | |
| Kennedy et al. | The use of a poly (allyl carbonate) for the preparation of active, water-insoluble derivatives of enzymes | |
| CHIOU et al. | Immobilization of papain on an anion exchange resin by physical adsorption followed by cross linking with glutaraldehyde | |
| JPH0612992B2 (ja) | 固定化プロテア−ゼの製法 | |
| WO1989008705A1 (en) | Supports for proteins and amino acids | |
| Dua et al. | Carboxypeptidase a immobilization on activated styrene–maleic anhydride systems | |
| Lapicque et al. | Specific‐enzyme release of cellulose‐bound drugs, experimental and theoretical study | |
| da Silva et al. | Graft copolymers as supports for the immobilization of biological compounds | |
| RU686377C (ru) | Способ получени препарата иммобилизованной протеазы BACILLUS SUBTILIS |