CS209743B1

CS209743B1 - Enzyme immobilising process

Info

Publication number: CS209743B1
Application number: CS137780A
Authority: CS
Inventors: Jaroslava Turkova; Budimir Veruovic; Vladimir Kubanek
Original assignee: Jaroslava Turkova; Budimir Veruovic; Vladimir Kubanek
Priority date: 1980-02-28
Filing date: 1980-02-28
Publication date: 1981-12-31

Description

Vynález se týká způsobu imobilizace enzymů na míkroporézní polymery na bázi póly-6-kaprolaktamu, polykondenzátů melaminu s formaldehydem a močoviny s formaldehydem, obsahující amíno skupiny.The invention relates to a process for the immobilization of enzymes to poly-6-caprolactam-based microporous polymers, melamine-formaldehyde polycondensates and urea-formaldehyde containing amino groups.

Míkroporézní polymery o vysokém specifickém povrchu na bázi poly-6-kaprolaktamu nebo polykondenzátů močoviny nebo melaminu s formaldehydem se připravují v podstatě tak, ze se polymer rozpustí v tavenině vhodného rozpouštědla a po ztuhnutí směsi se rozpouštědlo vyextrahuje a polymer vy2 padává ve formě prášku porézně struktury. Polykondenzační sorbenty se připravují polykondenzací močoviny, resp. melaminu s formaldehydem za přítomnosti anorganické soli, která se zabuduje do gelu a po vytvrzení gelu se sůl vyextrahuje obvykle vodou. Tyto polymery se mohou používat přímo k reakci s glutaraldehydem a nebo se obsah aminoskupín může zvýšit mírnou kyselou hydrolýzou. Průběh kyselé hydrolýzy poly-6-kapro laktamu lze znázornit reakčním schématem:Microporous high surface area polymers based on poly-6-caprolactam or urea or melamine polycondensates with formaldehyde are prepared essentially by dissolving the polymer in a melt of a suitable solvent and extracting the solvent when the mixture solidifies and the polymer falls out as a porous structure powder. . Polycondensation sorbents are prepared by polycondensation of urea, respectively. melamine with formaldehyde in the presence of an inorganic salt which is incorporated into the gel and, after curing of the gel, the salt is usually extracted with water. These polymers can be used directly to react with glutaraldehyde or the amino content can be increased by mild acid hydrolysis. The course of acid hydrolysis of poly-6-capro lactam can be illustrated by the following reaction scheme:

NH-(CH₂)₅“CO-NH-(CH₂)₅-CO-NH-(CH₂)₅-CO kontrolovaná hydrolýza HNH- (CH ₂ ) ₅ "CO-NH- (CH ₂ ) ₅ -CO-NH- (CH ₂ ) ₅ -CO controlled hydrolysis H

NH-(CH₂)₅-CO-NH-(CH₂)₅-C=O NH®- (CH₂)₅“CO—NH- (CH ₂ ) ₅ -CO-NH- (CH ₂ ) ₅ -C = O NH®- (CH ₂ ) ₅ "CO"

Volné aminoskupiny porézního polymeru reagují s nadbytkem glutaraldehydu. Je však nutno dokonale vymýt nezreagovaný glutaraldehyd. V dalším stupni se provádí vlastní vazba bílkoviny /H2N-R/ na volné aldehydícké o® skupiny vázané na polymerní strukturu. Tato reakce probíhá v širokém rozmezí pH, tj. od 5 až 9 a předpokládá se vznik Schiffovy báze podle reakčního schématu:The free amino groups of the porous polymer react with an excess of glutaraldehyde. However, unreacted glutaraldehyde must be thoroughly washed off. In the next step, the protein (H2N-R) itself is bound to the free aldehyde α groups bound to the polymer structure. This reaction proceeds over a wide pH range, i.e. from 5 to 9, and the Schiff base is assumed to be formed according to the reaction scheme:

NH₂ + CHO-(CH₂)₃-CHONH ₂ + CHO- (CH ₂ ) ₃ -CHO

N=CH (CH₂)₃-CHO + NH₂-RN = CH (CH ₂ ) ₃ -CHO + NH ₂ -R

N=CH (CH₂)₃-CH=N-RN = CH (CH ₂ ) ₃ -CH = NR

Vazba Schiffovy báze se však vyznačuje poměrnou labilitou, coz je v rozporu se stabilitou vazby takto imobilízovaných bílkovin. Goldstein a Manecke /Applied Biochemistry and Bioengineering, Vol. 1, Immobilized Enzymes Priciples, L. B. Wingard, Jr.,However, Schiff base binding is characterized by a relative lability, which is in conflict with the stability of binding of such immobilized proteins. Goldstein and Manecke / Applied Biochemistry and Bioengineering, Vol. Immobilized Enzymes Priciples, L. B. Wingard, Jr.,

E. Katschalski-Katzir a L. Goldstein, Eds,, Academie Press, New York 1976, st. 70 až 71/ uvádějí povahu reakce glutaraldehydu s bílkovinami a syntetickými polymery za dosud neobjasněnou. Knowles a Richards /J. Mol, Biol. 37 /1968/ 231/ prokázali, že roztoky glutaraldehydu obsahují kondenzační produkty. Monsan, Puzo a Mazargull /Biochemie 57 /1975/ 1281/ předpokládají, že glutaraldehyd nereaguje s bílkovinou ve své volné formě, ale jako nenasycený polymer, který dává s aminoskupinami iminové vazby, které jsou stabilizovány konjugací. Glutaraldehydu bylo použito pro imobilizaci celé řady enzymů na různé nosiče /1. Chibata, Ed., Immobilized Enzymes, Kodansha Ltd., Tokyo a Halsted Press, New York, 1978/. Pro vazbu enzymů na nylonové trubičky použili tuto metodu Sundaram a Hornby /FEBS Lett. 10 /1970/ 325/.E. Katschalski-Katzir and L. Goldstein, Eds, Academic Press, New York 1976, st. 70-71] disclose the nature of the reaction of glutaraldehyde with proteins and synthetic polymers as yet unexplained. Knowles and Richards / J. Mol., Biol. 37 (1968) showed that glutaraldehyde solutions contain condensation products. Monsan, Puzo and Mazargull (Biochemistry 57 (1975) 1281) suggest that glutaraldehyde does not react with the protein in its free form, but as an unsaturated polymer that gives imine bonds with amino groups that are stabilized by conjugation. Glutaraldehyde was used to immobilize a variety of enzymes to various carriers / L. Chibata, Ed., Immobilized Enzymes, Kodansha Ltd., Tokyo and Halsted Press, New York, 1978]. Sundaram and Hornby / FEBS Lett used this method to bind enzymes to nylon tubes. 10 (1970) (325).

Dosavadní nedostatky imobilizace enzymů na mikroporézní polymery o vysokém specifickém povrchu na bázi poly-6-kaprolaktamu, polykondenzátů melaminu s formaldehydem a močoviny s formaldehydem odstraňuje předkládaný vynález. Podstata vynálezu spočívá v tom, že se volné amínoskupiny uvedených polymerních látek nechají nejdříve zreagovat s nadbytkem glutaraldehydu a po odstranění nadbytku glutaraldehydu se na volnou aldehydickou skupinu vázanou na makromolekulami strukturu naváže kovalentně enzym. Obzvláště dobrých výsledků se dosáhne, jestliže se reakce provádí na mikroporézní polymerní látce o specifickém povrchu od 0,1 m^/g do 300 m^/g a dále, jestliže se míkroporézní polymemí látky před reakcí pro zvýšení obsahu aminoskupin podrobí hydrolýze.The present drawbacks of the immobilization of enzymes to microporous polymers of high specific surface area based on poly-6-caprolactam, polycondensates of melamine with formaldehyde and urea with formaldehyde are overcome by the present invention. SUMMARY OF THE INVENTION The free amino groups of said polymeric substances are first reacted with an excess of glutaraldehyde and, after removal of the excess glutaraldehyde, the enzyme is covalently bound to the free aldehyde group bound to the macromolecules. Particularly good results are obtained when the reaction is carried out on a microporous polymeric material having a specific surface area of from 0.1 m 2 / g to 300 m 2 / g and further when the microporous polymer material is subjected to hydrolysis prior to the amine content increase reaction.

Enzymy imobilizované na mikroporézním polymeru podle vynálezu mají vysokou aktivitu, zvýšenou stabilitu a možnost opakovaného používání a pří používání v kolonách nebo jiných typech enzymových reaktorů možnost kontinuální katalýzy. Další výhodou oproti dosud používaným nosičům,jako jsou agorosa, sklo, polyakrylamídové nebo metakrylátové gely má způsob použití mikroporézních polymerů podle vynálezu výhodu v tom, že se jedná o poměrně laciné a v dostatečném množství dostupné materiály. Umožňují se tak ekonomicky výhodné aplikace. Imobilizované enzymové deriváty mají dobrou mechanickou pevnost a nejsou napadány mikroorganismy. Značně zvýšená aktivita enzymů vázaných na mikroporézní polykaprolaktara /dále APA/ byla prokázána na tomto typu o mikroporézní struktuře a na typu polykaprolaktamu připraveného aniontove v suspenzi /dále PAD/ bez mikroporézní úpravy, ale o stejném obsahu aminoskupin. Vzorek APA vázal téměř o jeden řád papainu více než vzorek PAD.The enzymes immobilized on the microporous polymer according to the invention have a high activity, increased stability and the possibility of re-use and the possibility of continuous catalysis when used in columns or other types of enzyme reactors. A further advantage over previously used carriers such as agorose, glass, polyacrylamide or methacrylate gels has the advantage that the microporous polymers of the present invention are relatively inexpensive and available in sufficient quantities. This enables economically advantageous applications. Immobilized enzyme derivatives have good mechanical strength and are not attacked by microorganisms. A markedly increased activity of microporous polycaprolactara-bound enzymes (APA) has been demonstrated in this type of microporous structure and in the type of polycaprolactam prepared in suspension (hereinafter PAD) without microporous treatment but with the same amino group content. The APA sample bound almost one order of papain more than the PAD sample.

Polymery mikroporézní struktury aplikované podle předkládaného vynálezu mohou být ve formě prášku, fólie, granulí nebo trubek. Prášková forma u polykaprolaktamu se vyznačuje pravidelnými sférickými tvary o průměrné velikosti 0,25 mm. Částice mají pravidelné míkropóry v celé hmotě. U ostatních forem polykaprolaktamových sorbentů se provádí mikroporézní úprava na povrchu, například u granulí, fólií a trubek.The polymers of the microporous structure applied according to the present invention may be in the form of powder, foil, granules or tubes. The polycaprolactam powder form is characterized by regular spherical shapes with an average size of 0.25 mm. The particles have regular micropores throughout the mass. Other forms of polycaprolactam sorbents undergo a microporous surface treatment, for example granules, films and tubes.

V dalším je vynález a jeho účinky blíže objasněn na příkladech, které však rozsah vynálezu nikterak neomezují.In the following, the invention and its effects are explained in more detail by way of examples, but not by way of limitation.

Příklad 1 g 9uchého mikroporézního APA - obsah aminoskupin 0,033 mmol/g, velikost povrchuExample 1 g 9-dry microporous APA - amino content 0.033 mmol / g, surface area

3.2 m²/g, průměrná velikost části 0,25 mm - bylo suspendováno v 50 ml 3N HC1 a inkubováno 1 hod. při 37 °C. Po ukončení hydrolýzy byl vzorek promýván vodou do negativní reakce na chloridy. Množství aminoskupin hydrolýzou stouplo na 0,066 mmol/g při zachování dobrých mechanických vlastností. Práškový preparát byl dále suspendován v 50 ml 5% vodného roztoku glutaraldehydu a míchán za laboratorní teploty 16 hodin.3.2 m ² / g, average particle size 0.25 mm - was suspended in 50 ml 3N HCl and incubated for 1 hour at 37 ° C. After complete hydrolysis, the sample was washed with water until the reaction was negative for chlorides. The amount of amino groups by hydrolysis increased to 0.066 mmol / g while maintaining good mechanical properties. The powder preparation was further suspended in 50 ml of a 5% aqueous glutaraldehyde solution and stirred at room temperature for 16 hours.

Po skončení reakce byl nezreagovaný glutaraldehyd vymyt vodou do negativní reakce eluátu s nasyceným roztokem 2,4-dinitrofenylhydrazinu /v 2N HC1/. Pomocí vazby alanin-p-nitroani1 idu bylo stanoveno 14,6 /imol aldehydických skupin na 1 g suchého gelu. Vazba papainu: 2 g vlhkého APA po reakci s glutaraldehydem bylo suspendováno v 50 ml 1% roztoku papainu /o proteolytické aktivitě 1,07 jedn. A280nm/™in, mg /stanovené pomocí roztoku denaturovaného hemoglobinu při 8 při 37 °C v 0,5 M fosfátovém pufru pH 8,0 a mícháno na inkubátoru za laboratorní teploty 16 hodin. Po ukončení vazby byl zmobilizovaný papaín promýván střídavě 0,1 M borátovým pufrem pH 9, obsahujícím 0,002 M EDTA /ety1endiaminotetraoctová kyselina, resp. dvojnásobná sůl/ a 0,005 M merkaptoetanol a 0,1 M acetátovým pufrem pH 4, obsahujícím 0,02 M EDTA a 0,005 M merkaptoetanol tak dlouho, až v eluátu nebyla detekovatelná proteolytická aktivita papainu. Nakonec byl imobilizovaný preparát promyt fosfátovým pufrem obsahujícím cystein /120 g KH2PO4 + 46 g ΝβοΗΡΟ^,ΙΣ Η^θ ⁺ 4,95 g chelatonu do 1 000 ml - pH cca 6; do 100 ml pufru bylo vždy těsně před použitím přidáno 50 mg cysteinu/. V promytém preparátu byla stanovena proteolytícká aktivita, která byla pro kontrolu dostatečného vymytí kovalentně nevázaného papainu opakovaná po opakovaném promývání. Proteolytická aktivita promytého preparátu byla stanovena 2,5 jedn. A28O nm ^na min. a gram suchého vzorku. Množství navázaného papainu stanoveného na základě aminokyselinové analýzy kyselého hydrolyzátu imobilizovaného preparátu bylo 9,9 mg papainu/g suchého vzorku APA. Na základě těchto hodnot byla relativní proteolytícká aktivita, udávající poměr aktivity imobilizovaného enzymu k aktivitě stejného množství enzymu v roztoku, vypočtená 24 % /aktivita rozpustného papainu 1,07 jedn. A28O nm/min.mg/.After completion of the reaction, the unreacted glutaraldehyde was washed with water until the eluate had a negative reaction with a saturated solution of 2,4-dinitrophenylhydrazine (in 2N HCl). 14.6 µmol of aldehyde groups per 1 g of dry gel were determined by binding of alanine-p-nitroanilide. Papain binding: 2 g of wet APA after reaction with glutaraldehyde was suspended in 50 ml of 1% papain solution / with proteolytic activity of 1.07 units A280nm (TM), mg / as determined with a solution of denatured hemoglobin at 8 at 37 ° C at 0, 5 M phosphate buffer pH 8.0 and stirred on an incubator at room temperature for 16 hours. After binding, the mobilized papain was washed alternately with 0.1 M borate buffer pH 9 containing 0.002 M EDTA / ethylenediaminotetraacetic acid, respectively. double salt (a) 0.005 M mercaptoethanol and 0.1 M acetate buffer pH 4 containing 0.02 M EDTA and 0.005 M mercaptoethanol until the proteolytic activity of papain was detectable in the eluate. Finally, the immobilized preparation was washed with phosphate buffer containing cysteine / 120 g KH2PO4 + 46 g ΝβοΗΡΟ ^, ΙΣ Η ^ θ ⁺ 4.95 g chelatone to 1000 ml - pH about 6; 50 mg of cysteine was added to 100 ml of buffer immediately before use. Proteolytic activity was determined in the washed preparation, which was repeated after repeated washing to check for sufficient washing of the covalently unbound papain. The proteolytic activity of the washed preparation was determined to be 2.5 U A 280 nm ^per min. and gram of dry sample. The amount of bound papain determined by amino acid analysis of the acid hydrolyzate of the immobilized preparation was 9.9 mg papain / g dry APA sample. Based on these values, the relative proteolytic activity, indicating the ratio of the activity of the immobilized enzyme to the activity of the same amount of enzyme in solution, was calculated to be 24% (soluble papain activity 1.07 units A280 nm / min.mg).

Příklad 2Example 2

100 g suchého vzorku APA 16 /obsah aminoskupin 0,069 mmol/g, velikost povrchu100 g APA 16 dry sample / 0.069 mmol / g amino content, surface area

3.3 m^/g, průměrná velikost částic 0,25 mm/ bylo necháno přes noc k sorpci vody. Váha odsátého vzorku po sorpci byla 170 g. 100 g tohoto vzorku bylo suspendováno v 300 ml3.3 m @ 2 / g, average particle size 0.25 mm) was allowed to adsorb water overnight. The weight of the aspirated sample after sorption was 170 g. 100 g of this sample was suspended in 300 ml

N HC1 a inkubováno 1 hod. při 37 °C. Po promytí vzorku na negativní reakci na chloridy byl odsátý vzorek suspendován ve 250 mililitrech 5%ního vodného roztoku glutaraldehydu a třepáno přes noc za laboratorní .teploty. Po promytí vzorku vodou do negativní reakce s 2,4-dinitrofenylhydrazinem byl odsátý vzorek suspendován ve 300 ml 1%ního roztoku papainu /0 proteolytické aktivitě 1,07 jedn. A280 _nm/^ra^^n,ing/ ^{v M} fosfátovém pufru pH 7,0. Další zpracování bylo obdobné jako v příkladu 1. Proteolytická aktivita byla stanovena 2,04 jedn.N HCl and incubated for 1 hour at 37 ° C. After washing the sample for a negative reaction to the chlorides, the aspirated sample was suspended in 250 ml of a 5% aqueous glutaraldehyde solution and shaken overnight at room temperature. After washing the sample with water to a negative reaction with 2,4-dinitrophenylhydrazine, the aspirated sample was suspended in 300 ml of a 1% papain / 0 proteolytic activity solution of 1.07 units A280 _n m / ^m ^, ^{in M} phosphate buffer pH 7 , 0. Further processing was similar to Example 1. Proteolytic activity was determined to be 2.04 units.

A_23q _nin/mín, g suchého derivátu. Množství navázaného papainu stanoveného na základě aminokyselinové analýzy kyselého hydrolyzátu zmobilizovaného preparátu 10,7 mg papainu/1 g suchého vzorku sorbentu. Relativní proteolytická aktivita =? 18 Z.A_23q _nin / min, g of dry derivative. The amount of bound papain determined by amino acid analysis of the acid hydrolyzate of the mobilized preparation was 10.7 mg papain / 1 g dry sorbent sample. Relative proteolytic activity =? 18 Z.

Příklad 3 g suchého vzorku polykaprolaktamu připraveného aniontově v suspenzi /PAD/ - obsah aminoskupin 0,065 mmol/g, průměrná velikost částic 0,25 mm - bylo přímo suspendováno ve 100 ml 5£ního vodného roztoku glutaraldehydu a mícháno za laboratorní teploty 16 hodin. Po promytí vodou do negativní reakce eluátu s 2,5-dínitrofenylbydrazinem byl preparát suspendován ve 100 ml líního roztoku papainu v 0,5 M fosfátovém pufru o pH 7. Další zpracování bylo jako v příkladěExample 3 g of a dry sample of polycaprolactam prepared anionically in suspension (PAD) - an amino content of 0.065 mmol / g, average particle size of 0.25 mm - was directly suspended in 100 ml of a 5% aqueous glutaraldehyde solution and stirred at room temperature for 16 hours. After washing with water until the eluate had a negative reaction with 2,5-di-nitrophenylbydrazine, the preparation was suspended in 100 ml of a lazy papain solution in 0.5 M phosphate buffer at pH 7. Further processing was as in the example.

1. Proteolytická aktivita byla 2,2 jedn.1. Proteolytic activity was 2.2 units.

A28O nm/miH» 8 suchého materiálu. Množství navázaného papainu bylo 3,9 mg/g suchého vzorku a relativní proteolytická aktivita = = 53 Z.A280 nm / miH »8 dry material. The amount of bound papain was 3.9 mg / g dry sample and the relative proteolytic activity = 53 Z.

Příklad 4 g suchého vzorku PAD bylo modifikováno glutaraldehydem stejně jako v příkladě 3.Example 4 g of dry PAD sample was modified with glutaraldehyde as in Example 3.

Potom byl vzorek suspendován ve 100 ml líního roztoku glukoisomerasy /0 aktivitě enzymu 4,6 jedn., což znamená ^amoly glukosy isomerizované na fruktozu za minutu, při 60 °C a pH 7,0/ v 0,05 M - glycerofo 5fátu sodném pH 7. Vazba probíhala 16 hodin za laboratorní teploty. Po ukončení vazby byl nezreagovaný enzym vymyt vazebným pufrem /do negativní aktivity eluátu/. Aktivita zmobilizované glukosoízomerazy byla 12,3 jedn./g suchého materiálu. Množství navázaného enzymu stanovené na základě aminokyselinové analýzy kyselého hydrolyzátu zmobilizovaného enzymu bylo 4,8 ml/g suchého preparátu. Relativní aktivita byla 56 %.Then, the sample was suspended in 100 ml of lazy glucoisomerase solution / 0 enzyme activity of 4.6 U, which means glucose amoles isomerized to fructose per minute, at 60 ° C and pH 7.0 / in 0.05 M sodium glycerophosphate. pH 7. The binding was carried out for 16 hours at room temperature. After binding, the unreacted enzyme was eluted with binding buffer (until negative eluate activity). The activity of the mobilized glucose isomerase was 12.3 U / g dry material. The amount of bound enzyme determined by amino acid analysis of the acid hydrolyzate of the mobilized enzyme was 4.8 ml / g dry preparation. The relative activity was 56%.

Příklad 5 g odsátého vzorku APA po reakci s glutaraldehydem podle postupu popsaného v příkladě 1 bylo suspendováno ve 20 ml 2/šnzho roztoku chymotrypsinu /0 proteolytické aktivitě stanovené pomocí roztoku denaturovaného hemoglobinu /pH 8/ 0,34 jedn. A23o _nm/min.mg a esterolytické aktivitě stanovené pomocí N-acetyl-L-tyrosin etylesteru /ATEE/ 132 ,u^molů na min. a mg. ^Turková J. a kol. Biochim. Biophys. Acta 322, /1973/ 1? v 0,05 M fosfátovém pufru pH 7,5. Vazba byla prováděna za stálého míchání na inkubátoru při 4 °C 5 hod. Po ukončení vazby byl preparát promýván 1 M NaCl, až v eluátu nebyla detekovatelná proteolytická aktivita a eluát nevykazoval absorbanci při 3 280 na. Na základe aminokyselinové analýzy kyselého hydrolyzátu zmobilizovaného chymotrypsínu bylo stanoveno 12 mg bílkoviny navázané na 1 g suchého vzorku APA. Proteolytická aktivita stanovená pomocí roztoku hemoglobinu pH byla 1,8 jedn. A28O nm/^m^-^n,S suchého vzorku /relativní proteolytický aktivita - 44 Z/ a esterolytická aktivita stanovená pomocí ATEE byla 1 140 jíímo ly/min. g suchého vzorku /relativní esterolytická aktivita = = 72 Z/.Example 5 g of aspirated APA sample after reaction with glutaraldehyde according to the procedure described in Example 1 was suspended in 20 ml of a 2 / chymotrypsin solution / 0 proteolytic activity determined using a denatured hemoglobin solution / pH 8 / 0.34 Unit A23o _{nm /} min.mg and esterolytic activity determined by N-acetyl-L-tyrosine ethyl ester / ATEE / 132 for ^MO LU per min. and mg. Turková J. et al. Biochim. Biophys. Acta 322, (1973)? in 0.05 M phosphate buffer pH 7.5. Binding was performed with stirring on an incubator at 4 ° C for 5 hours. After binding, the preparation was washed with 1 M NaCl until proteolytic activity was not detectable in the eluate and the eluate showed an absorbance at 3280 na. Based on amino acid analysis of the acid hydrolyzate of mobilized chymotrypsin, 12 mg of protein bound to 1 g of dry APA sample was determined. The proteolytic activity determined by the hemoglobin pH solution was 1.8 units of A 280 nm / ^m 2 - ^n, S of dry sample (relative proteolytic activity - 44 Z) and the esterolytic activity determined by ATEE was 1,140 µm / min. g dry sample (relative esterolytic activity = 72 Z).

Příklad 6 polykondenzacz 6-kaprolaktamu katalýzovanou 5 mol Z 1,6-hexametylendiaminem /PAD-7/ obsah aminoskupin 0,582 mmol/g, velikost povrchu 2,3 m^/g, průměrná velikost částic ' 0,28 mm - byl suspendován v 10 ml 2,5 Z nm glutaraldehydu /25 Z komerční glutaraldehydový roztok byl zředěn v poměru 9:1 s 0,1 M fosfátovým pufrem pH 7/. Směs byla nechána v reakci 1 hodinu za sníženého tlaku za účelem rychlej šzho odstranění vzduchu z pórů vzorku a za občasného míchání při laboratorní teplotě. Po vymytí veškerého nezreagovaného glutaraldehydu byl gel suspendován v 20 ml 2 Z roztoku trypsinu /0 aktivitě 1,22amol na min. a mg stanoveno pomocí N-benzoyl-DL.arginin-p-nitroani lidu /ΒΑΡΑ/ metodou pddle Erlangera a kol. /Arch. Biochem Biohhys. 95 / 1 96 1 / 271/J^ v 0,1 M fosfátovém pufru pH 7 obsahujícím 20 mg benzamidinu /vazba v přítomnosti inhibitoru/. Vazba probí hala za stálého míchání při laboratorní teplo tě 4 hodiny. Po ukončení vazby byl nezreagovaný trypsin vymyt střídavě pufrem 0,1 M Tris-HCl, pH 8, obsahujícím 0,02 M CaC^ a 2 M NaCl a 0,1 M octanem sodným obsahujícím 2 M NaCl a 0,02 M CaCl2> pH 4. Nakonec byl vzorek promyt 0,1 M Tris-HCl pufrem obsahujícím pouze 0,02 M CaC^· Aktivita zmobilizovaného trypsinu stanovená pomocí ΒΑΡΑ byla 3,8 |Umol/min.g suchého vzorku, množství navázané bílkoviny stanovené na základě aminokyselinové analýzy kyselého hydrolyzátu zmobilizovaného enzymu byla 4,1 mg trypsin,u/1 g suchého vzorku, relativní aktivita byla 76 Z. Příklad 7Example 6 polycondensation of 6-caprolactam catalysed with 5 moles of 1,6-hexamethylenediamine (PAD-7) amino group content 0.582 mmol / g, surface area 2.3 m 2 / g, average particle size '0.28 mm "was suspended in 10 ml of 2.5 Z nm glutaraldehyde (25 Z commercial glutaraldehyde solution was diluted 9: 1 with 0.1 M phosphate buffer pH 7). The mixture was allowed to react for 1 hour under reduced pressure to rapidly remove air from the sample pores and stirring occasionally at room temperature. After washing out any unreacted glutaraldehyde, the gel was suspended in 20 ml of 2 from trypsin / 0 activity 1.22 amoles per min. and mg determined by N-benzoyl-DL.arginine-p-nitroanediol (ΒΑΡΑ) by the method of pddle Erlanger et al. /Sheet. Biochem Biohhys. 95 (96%) (271) in 0.1 M phosphate buffer pH 7 containing 20 mg benzamidine (binding in the presence of inhibitor). The binding runs through the hall with stirring at room temperature for 4 hours. After binding, the unreacted trypsin was washed alternately with 0.1 M Tris-HCl buffer, pH 8 containing 0.02 M CaCl 2 and 2 M NaCl and 0.1 M sodium acetate containing 2 M NaCl and 0.02 M CaCl 2> pH 4. Finally, the sample was washed with 0.1 M Tris-HCl buffer containing only 0.02 M CaCl 2 · The activity of the mobilized trypsin determined by ΒΑΡΑ was 3.8 µmol / min.g of dry sample, the amount of protein bound determined by amino acid analysis The acid hydrolyzate of the mobilized enzyme was 4.1 mg trypsin, u / 1 g dry sample, the relative activity was 76 Z. Example 7

Do 10 g suchého polykondenzátu melaminu s formaldehydem /obsah aminoskupin 0,179 mmol/g, velikost povrchu 175 m^/g, průměrná velikost částic 0,35 mm/ bylo přímo suspendováno ve 100 ml 5£ního vodného roztoku glutaraldehydu a mícháno za laboratorní teploty 16 hodin. Po promytí vodou do negativní reakce eluátu s 2,4-dinitrofenylhydrazinem byl vzorek suspendován ve 100 ml 1%nzho roztoku papainu v 0,5 M fosfátovém pufru o pH 7. Další zpracování bylo stejné jako v příkladě 1. Proteolytická aktivita byla 2,02 jedn. A^gQ _nr^/mzn.g suchého materiálu. Množstvz navázaného papainu 8,0 mg/g suchého sorbentu a relativní proteolytická aktivita = 53 Z.To 10 g of dry formaldehyde melamine polycondensate (amino content 0.179 mmol / g, surface area 175 m m / g, average particle size 0.35 mm) was directly suspended in 100 ml of 5% aqueous glutaraldehyde solution and stirred at room temperature. hours. After washing with water until the eluate had a negative reaction with 2,4-dinitrophenylhydrazine, the sample was suspended in 100 ml of 1% papain solution in 0.5 M phosphate buffer pH 7. Further processing was the same as in Example 1. Proteolytic activity was 2.02 unit A ^ gQ _nr ^ / mzn.g of dry material. Papain bound 8.0 mg / g dry sorbent and relative proteolytic activity = 53 Z.

Příklad 8 g suchého polykondenzačního produktu močoviny s formaldehydem /obsah aminoskupzn 0,019 mmol/g, velikost povrchu 9,6 m^/g, průměrná velikost části 0,30 mm/ bylo přímo suspendováno ve 100 ml vodného roztoku glutaraldehydu a mícháno za laboratorní teploty 16 hodin. Po promytí vodou do negativní reakce eluátu s 2,4-dinitrofenylhydrazinem byl vzorek suspendován ve 100 ml líního roztoku papainu v 0,5 M fosfátovém pufru o pH 7. Další zpracování bylo jako v příkladě 1. Proteolytická aktivita byla 2,02 jedn. A280 nm/min.g suchého materiálu. Množstvz vázaného papainu bylo 2,9 mg/g suchého vzorku a relativní proteolytzcká aktivita = 53 Z.Example 8 g of dry polycondensation product of urea with formaldehyde (amino content 0.019 mmol / g, surface area 9.6 m velikost / g, average particle size 0.30 mm) was directly suspended in 100 ml of aqueous glutaraldehyde solution and stirred at room temperature 16 hours. After washing with water until the eluate had a negative reaction with 2,4-dinitrophenylhydrazine, the sample was suspended in 100 ml of a lazy papain solution in 0.5 M phosphate buffer pH 7. Further processing was as in Example 1. Proteolytic activity was 2.02 units A280 nm / min.g of dry material. The amount of bound papain was 2.9 mg / g dry sample and the relative proteolytic activity = 53 Z.

g suchého polykaprolaktamu připravenéhog of dry polycaprolactam prepared

Claims

SUBJECT

A method for the immobilization of enzymes to high specific surface area microporous polymers based on poly-6-caproyl actam, melamine-formaldehyde polycondensates and urea with formaldehyde, characterized in that the free amino groups of said polymeric substances are reacted first with excess glutaraldehyde and after removal excess glutaraldehyde is covalently bound to the free aldehyde group bound to the macromolecule structure.

YNÁLEZU

2. The process of claim 1, wherein the reaction is carried out on a microporous polymeric material having a specific surface area of from 0.1 m @ 2 / g to 300 m @ 2 / g.

3. The method according to claim 1, wherein the microporous polymeric substances are subjected to hydrolysis prior to the reaction to increase the amino group content.