CS209489B2

CS209489B2 - Method of preparation of the cis-/p-/2-3-/4-aminobutylamino-propyl/carbamoyl/vinyl/glycosides

Info

Publication number: CS209489B2
Application number: CS771472A
Authority: CS
Inventors: Joseph J Hlavka
Original assignee: American Cyanamid Co
Priority date: 1976-03-08
Filing date: 1977-03-04
Publication date: 1981-12-31
Also published as: BE852179A; ZA77747B; US4018972A

Description

Vynález se týká způsobu přípravy nových antibakteriálně účinných cis-|p-{2-[ (3-(/4-aiminobutyl/amino)-propyl) karbamoyl ] vinyl}(glykosidů, označovaných jako; látky cis-BM123 a CÍS-BM123 χ₂, které jsou blíže charakterizovány dále. Účinky těchto nových antibakteriálních prostředků na specifické mikroorganismy a jejich chemické a fyzikální vlastnosti jsou odlišné od účinků a vlastností až dosud známých popsaných antibakteriálních prostředků.

Noivé antibakteriální prostředky připravené podle vynálezu jsou organickými bázemi a jsou tedy schopny tvořit adiční soli s kyselinami za použití různých organických a anorganických solitvorných reakčních činidel. Adiční soli s kyselinami, vznikající smícháním antibakteriálně účinné voíné báze s až třemi ekvivalenty kyseliny, účelně v neutrálním rozpouštědle, lze tedy připravit za použití kyselin, jako kyseliny sírové, fosforečné, chlorovodíkové, bromovodíkové, amidosulfonové, citrónové, maleinové, fumarové, vinné, octové, benzoové, glukonbvé, askorbové a podobných kyselin. Adiční soli antimikrobiálních činidel podle vynálezu s kyselinami jsou obvykle krystalické pevné látky poměrně rozpustné ve vodě, methanolu a ethanolu ale poměrně nerozpusté v nepolárních roz2 pouštědlech, jako v diethyletheru, benzenu, toluenu a podobně. Pro účely vynálezu jsou antibakteriální volné báze ekvivalentní svým netoxickým adičním solím s kyselinami. V následujícím textu se pod označením cis-BM123y-látka rozumí směs cis-BM123ft-látky a cis-BM123y₂-látky v jakémkoli poměru a pod označením trans-123y-látka se rozumí směs trans-BM1237_rlátky a trans-BM123y₂-látky v jakémkoli poměru.

Nové, antibakteriální prostředky označené jako cis-BM123-y₁-látka a cis-BM123/₂-látka lze připravit fotocheímickou transformací jejich odpovídajících trans-isomerů. Fotolytická konverze trans-BM123/-látky, trans-BM123/_rlátky a trans-BM123y₂-látky na odpovídající cis-BM123/-látku, cis-BM123/i-látku a cis-BM123/₂-látku se přednostně provádí tak, že se výchozí trans-isbmer rozpustí nebo disperguje ve vodě a¹ pak se roztok dzařuje světlem. Koncentrace výchozíhbl ťrans-isbmeru ve vodě není kritická.

Světloi, použité při fotolytickém postupu podle předloženého vynálezu, nemá š výhodou vlnovou délku nižší než asi 250 nm' a přednostně má vlnovou délku v rozmezí od 250 db 400 nim. Ozařování světlem takoivé vlnové délky se účelně dosahuje tím, že se reiakce provádí v nádobě vyrobené z takovéto materiálu jako je křemen, který odfiltruje v podstatě všechno světlo procházející nádobou, která má vlnovou délku pod 250 nm. Jako zdroje světla se účelně používá vysokotlaké rtuťové lampy oi příkonu asi 450 W.

Teploita, při které se fotolýza provádí, nemá rozhodující význam pro dosažení dobrých výtěžků proiduktu, ale účelně se pracuje při teplotě v rozmezí 5 až 50 °C, například při asi 25 až 30 °C. Doba potřebná pro podstatnou konverzi trans-isomeru na odpovídající cis-isomer přirozeně závisí na intensitě světla a teplotě a nejlépe se proto! stanovuje v každém jednotlivém případě pokusem. Obvykle však postačuje doba v rozmezí od asi 20 minut do asi 2 hodin.

Po- skioinčení ozařování se může produkt získat standardními postupy. Tak se například reakční směs může lyofilizovat nebo odpařit dlo sucha a zbytek se může rozpustit v minimálním množství rozpouštědla, jako, ethanolu nebo methanolu. Výsledný roztok se může zředit diethyletherem nebo acetonem a vzniklý vysrážený produkt se může izolovat filtrací. Další čištění se může provádět standardními metodami, jako krystalizací nebo’ chromatografií.

Předmětem vynálezu je způsob přípravy cis-1 p-{2- [ (3-(/4-aminobutyl/amino)propyl) karbamoyl ] vinyl) | glykosidů, označených· jako cís-BM123/t a cis-BM123/₂-sloučenina, obecného^ vzorce I

R-^y-CH=CH-C-NH-(CH_z)^NH (CH^N^ (П kde

R představuje v případě BM123n-sloučeniny zbytek vzorce a v případě

zbytekvzorce

BM123y2-sloučeniny

vyznačený tím že se vodný roztok odpovídajícího trans-išomeru ozařuje- světlem·, o vlnlové délce 250 až 400 nm tak dlouho dokud se výchozí trans-isotoer v podstatě nepřevede na odpovídající cis-isomer obecného vzorce I.

Antibiotika označená · jako· BM12361, trans-BM123y_x a trons-BM123y₂vznikají kultivací za kontrolovaných podmínek nového· kmene· neurčeného·· druhu NocaTdia. Tento nový kmen produkující antibiotika byl izolován ze vzorku zahradní půdy odebraného v Oceole ve státě Iowa, USA a je chován ve sbírce kultur Lederle Laboratories Division, Američan Cyanamid Company, Pearl River, N. Y. jako· kultura číslo· BM123. 2ivooaschopná kultura nového mikroorganismu byla uložena· ve sbírce Culture Collection Laboratory, Northern Utilization Research ond Development Division, United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois a byla zařazena do stálé sbírky. Je volně dostupná pro veřejnost pod číslem NRRL 5646. Pod označením BM^/Mátka se rozumí směs v BM123&-látky a BM123S2-látky v libovolném poměru.

Obecný popis mikroorganismu Nocarum sp. NRRL 5б4б zatažený na pozorovaných rozpoznávacích znacích je tento. Byly pozorovány vlastnosti organismu v kultuře· a fyziologické a morfologické vlastnosti organismu podle metod, které popsal · Shirling a G^d^tlieb, Internát. Journ. of Syst. Bacteriol. 16, 213—240 (1966). Chemické složení kultury bylo určováno postupy, které popsali Lechevalier et al., Advan. Appl. Microbiol. 14, 47—72 (1971). Podtržený popis barvy a číslo barevného· ^odstínu je použit v souladu s prací Jacobson et al, Color Harmony Manuol, 3rd ed. (1948), Cointainer Corp. of America, Chicago, Illinois. Podrobnosti popisu jsou uvedeny v dalSích tabulkách II ož VI.

Intenzita růstu

Střední na agaru s kvasničným extraktem, agaru s dextrózou a asparaginem, Benedictově a Bennetově agaru, agaru s bromborem o dextrózou a Weinstreinově agaru, slabá na Hidkeyově o Tresnerově agaru, agaru s rajským protlakem, agaru s ovesnou moukou a „pablum”—agaru (?) o nepatrný růst na agaru s anorganickými solemi a Škrobem, s Kusterovými ovesnými vločkomi, Czapekovým roztokem o na agaru s rýží.

Vzdušné mycelium

Pokud je přítomno, je vzdušné mycelium bělavé, vzniká jen na agaru s kvasničným extraktem, agaru s dextrózou o asparaginem, na Benettově a Benedictově agaru o na agaru s· bramborem o dextrózou.

Rozpustné pigmenty

Nevznikají žádné rozpustné pigmenty.

Reverzní barva

Bezbarvé až nažloutlé odstíny.

Různé fyziologické reakce

Neztekucuje želatinu, dusičnany redukuje na dusitany · za 7 dní, na agaru s peptonem a železem netvoří melanoidové pigmenty, na mléce s lakmusem nedochází k * peptonizaci ani ke tvorbě sraženiny, tolerance vůči chloridu sodnémiu na agaru s kvasničným extraktem je větší nebo· rovná 4 °/o, ale menší nebo rovná 7 · °/o, optimální teplota růstu 32 °C. Využití zdroje uhlíku podle Pridhamovy o Gottliebovy metody [J. Bacteriol. 56. 107—114 (1948)] · je následující: dobré vyoužití glycerinu, salicinu, d-trehalózy o dextrózy, střední využití i-inositu a Spatné využití ož vůbec žádné využití · d-fruktózy, maltózy, adonitu, 1-arabinózy, laktózy, d-mannitu, d-melibiózy, d-raffinózy, 1-rhomnózy, sacharózy o d-xylózy.

Chemické složení

Organismus náleží k organismům s · buněčnou stěnou typu IV, tj. obsahuje meso-2,6-diaminopimelovou kyselinu o má celobuněčné spektrum cukrů typu A, tj. obsahuje arabinózu a galaktózu. Methylovoné celobuňěčné extrakty vykazují při chromatografii spektrum mastných kyselin podobné spektru, které poskytuje organismus No-cardia asteroides ATCC 3308.

Mikromorfologie

Vzdušné mycelium roste z substrátového mycelio ve formě mírně rozvětvených středně dlouhých ohebných · prvků, které obvykle končí v · prodloužených jednoduchých spirálách. Ohebné prvky jsou nepravidelně uspořádány do krátkých eliptických neboi válcovitých úseků (spory?), které se snadno· rozčleňují. Koncové spirálovité části jsou méně nápadně uspořádány do segmentů. Velikost segmentů je obvykle 0,8 až · 1,7 μπ x 0,3 až 0,5 μΐη, v průběhu 0,4 μΐη· x 1,2 pm.

Diagnóza

Morfologické znaky kultury č. BM123 je obtížné sledovat a interpretovat v důsledku chabého! vývinu vzdušného mycelio · na většině médií. V důsledku toho^ je nutno věnovat značnou poizornost při určení rodové příbuznosti organismu chemické analýze. No základě systému navrženého· Lechevalierem a· dalšími obsahuje kultura BM123 v celé hmotě buněk kyselinu rneso diaminiopimelovou a na základě analýzy cukrů je zřejmé, že je přítomna arabinóza a galaktóza. Kultura náleží proto к organismům s typem buněčné stěny IV. Porovnáním diagramu plynové chromatografie kultury č. BM123 s diagramem kultury Nocardia asteroides ATCC 3308 se zjistí jejich nápadná příbuznost. Jiné vlastnosti kultury č. BMÍ23, které jsou v souladu s chováním Nocardia je zloirikovitý vzdušný ná růst na některých médiích a úplná nepřítomnosti vzdušného nárůstů na většině médií. Vzhledem, к tomu, že není к dispozici vhodné kritérium pro charakterizaci Nocardia na úrovni druhu, nebyl činěn pokus provést toto stanovení. Kultura BM123 bude tedy považována až do té doby, než bude diagnóza dosažitelná, za neurčený druh Nocardia.

Charakteristické vlastnosti kultury kmene Nocardia sp. NRRL 5646 Inkubace: 14 dní Teplota: 32 °C

Médium' Intenzita růstu Vzdušné mycelium Rozpustné· Reverzní barva Poznámky

o £

8

Φ	Φ	φ Φ	Φ
Φ	O	o o	O
Φ	O	£» £»	>>
.8	a	a s	a
'Φ	'Φ	\0J OJ	'Φ
03	03	Я 3	03
>ω	>C/3	>cco >co 'Φ	>03
03	03	=5 5 f—	03
3	Ό	3 3 >ф	3
Sl	Ň	Ň N >	N
>	>	> > w	>

'Ф Я Я >с/з >с/з G G 3 3 N N > >

G

Φ >&4 4СЛ 'cd

X2

T3

T5 Φ >&4 4-* w '3

Φ >í-< 4— w

Я Ό

Φ >Í4 4-f cn 'cd XJ cH f—H 'řx g

⁰⁰a φ я £'Я β ³cd £ ® to 3 co x>

ci 'g'g s 3 ^£ 3 cd CD Q>£ &

co φ 4-» р4 4-» и φ я ю ’8 íg >

í/3 cd bů

C3 ř-< cd ад cd > oG ř-i Ф s

Eh cú > oG

Ф

Ф £

s

Ф o ω ti a φ я ’S0 оз

1-4 a ⁰³ φ o ад 03 з> s§ N 3 Ό t5 # Ф X 03 -- „ □ <3 Ό CQ

Sř .03 ••g я Φ ÍQ ř? ОТ Ф o ω

P G ад G _ > 3 °G O Í4 Ф X to

G < ctí

Д4 o '8 Ctí

Й

Ctí

Č/3 ¹ f-4 Ctí I СЮ

Й

Ф « 4-»

N O

É4 £

cti ·< 2 á * a a “* s ω

t-(

G ~ ад ад φ

G

N 8° G X >O □ >

C/3 ctí

N Ό ř-í 4-»

X ctí φ

o ÍH ЛЯ

3 й '£> G 8 3 g G g

Я O я ω φ В

A c?

C/3 cd £

cd Λ >N

Ph ω í-4 cd

G ад ад я я

Tabulka III

MikrOmorfologie kmene Nocardia sp. NRRL5646

Médium Vzdušné mycelium a/nebo struktury typu spor agar s Vzdušné mycelium roste ze kvasničným substrátového mycelia ve forextraktem mě mírně rozvětvených středně dlouhých ohebných prvků, které obvykle koinčí v prodloužených jednoduchých spirálách. Ohebné prvky jsou nepravidelně uspořádány do krátkých úseků (spory?], které se snadno rozčleňují. Koncové spirálové části jsou méně nápadně uspořádány do segmentů. Velikost segmentů je obvykle 0,8 až 1,7 μτθι x 0,3 až 0,5 μΐη, v průměru 0,4 μτη X 1,2 μΐη.

Tabulka IV

Různé fyziologické reakce kmene Nocardia sp. NRRL 5646

Médium Inkubační Intenzita růstu Fyziologická reakce doba

želatina	7 dní
želatina	14 dní
bujón s organickými	7 dní
dusičnany
bujón s organickými	14' dní
dusičnany
agar s peptonem a železem	24—48 hodin
mléko s lakmusem.	7 dní
kvasničný extrakt se (4,7,10 a	7 dní
13 %) chloridu sodného
Tabulka V

Využití zdroje uhlíku kmenem, Nocardia sp. NRRL 5646

nízká	nedochází ke ztekucování
dobrá	nedochází ke ztekucování
dobrá	dusičnany se redukují na dusitany
dobrá	dusičnany se redukují na dusitany
dobrá'	neredukují se melaninové pigmenty
dobrá	nedochází к peptonizaci nebo tvorbě sraženiny
střední	tolerance vůči chloridu sodnému 5 4 % ale 57 %

*) 3 dobré využití střední využití slabé využití žádné využití

Inkubace: 10 dnů	Teplota: 32 °C
Zdroj uhlíku	využití *]
adonit'	0
1-arabinóza	0
glycerin	3
d-fruktóza	1
i-inosit	2
laktóza	0
d-mannlt	0
salicin	2
d-melibióza	0
d-raffinóza	0
rhamnóza	0
maltóza	1
sacharóza	0
d-trehalóza	3
d-xylóza	0
dextróza	3
negativní kontrolní pokus	0

Tabulka VI

Chemické složení kmene Nocardia sp. NRRL 5646

Typ buněčné stěny Hlavní složky

Typ IV meso-DAP, arabinóza, galaktóza

Produkce BM123/3 a trans-BM123 není omezena na tento konkrétní organismus nebo n,a organismy, které plně odpovídají shora uvedeným charakteristikám růstu a vzhledů pod mikroskopem. Uvedené charakteristické vlastnosti jsou uvedeny pouze pro ilustraci. Ve skutečnosti se může použít mutant získaných z tohoto organismů různými prostředky, jako vystavením rentgenovémů záření, UV-záření, dusíkatému yperitů, aktinofágům apod. Životaschopná kultura takové typické mutanty je uložena v Culture Collection Laboratory,

Northern Utilization Research and Develópment Division, United States Department of Apriculture, Peoria, Illinois, a byla zařazena do stálé sbírky pod číslem NRRL 8050. Ačkoli vlastnosti kultury tohoto· organismlu, fyziologické a morfologické vlastnosti kmene NRRL 8050 jsou v podstatě stejné, jako u kmene NRRL 5646, produkuje při aerobním kvašení kmen NRRL 8050 zvýšené množství látky BM123. Kmen NRRL 8050 se liší od mateřského kmene NRRL 5646 rovněž těmito vlastnostmi:

a) redukce dusičnanů na dusitany je pomalejší,

b) na Bennettově agaru a na agaru s kvasničným extraktem poskytuje myceliální pigment světle hnědého narůžovělého odstínu (rosewood tan).

Nové antibakteriálně účinné látky podle vynálezu jsou obecně pevné krystalické látky s poměrně nízkou rozpustností v nepolárních rozpouštědlech, jako v diethyletheru a n-hexanu, ale se značnou rozpustností v rozpouštědlech, jakoi je voda a nižší alkanoly. Antibiotika trans-BM123/₁ a trans-NM123y₂ jsou strukturními isomery a lze je znázornit následujícími strukturárními vzorci:

trans-BM123y₁

trans-BM123y2

Užitečnost cis-isomerů derivátů trans-BM123 je· demonstrována na jejich schopnosti potlačovat systemické lethální infekce u myší. Tyto· nové látky vykazují in vivo vysoký antibakteriální účinek u myší proti ' Escherichia coli US 311 při podání jedné subkutánní dávky skupinám· myší o hmloitnolsti asi 20 g (Carworth Farms· · CF— —1). Infikace se provádí intraperitoneálně lethální dávkou těchto bakterií půlhodinové TSP· krevní kultury zředěné· tryptikázovým bujónem se sójou TSP na koncentraci 10³. Aktivita cis-B123y-átky proti

Escherichia coli US 311 in vivo · u myší je uvedena v tabulce VII.

209469

1S

Orální dávka mg/kg tělesné Poměr počtu živých myší k hmotnosti celkovému počtu zkoušených myší 7 dní po* infekci

Tabulka VII

Sloučenina cis-BM123y

Kontrolní pokus [bez podání látky)

Postup fermentace upravený pro produkci především látky BM123 a trans-BM123y

Kultivace Nocardia sp. NRRL 8050 se může provádět na velkém počtu kapalných kultivačních médií. Média užitečná pro produkci antibiotik obsahují asimilovatelný zdroj uhlíku, jako škrob, cukr, melasu,, glycerin atd. asimilovatelný zdroj dusíku, jak-o je bílkovina, hydrolyzovaná, bílkovina, polypeptidy, aminokyseliny, kukuřičný extrakt, atd., anorganické anionty a kationty, jako je draslík, hořčík vápník,, amonium, sulfát, uhličitan, fosforečnan, chlorid, atd. Stopové prvky, jako bór, molybden, měď atd. se dodávají ve formě nečistot spolu s ostatními složkami média. Provzdušňovárn v nádržích a lahvích se provádí tak, že se do kvasného prostředí nebo· na jeho povrch vhání sterilní vzduch. Míchání v , nádržích se provádí pomocí mechanického rotačního míchadla. Podle potřeby se může přidávat protipěnový prostředek jako Hcdag fR] FD 82.

Příprava inokula pro BM123J a trans-BM123

Primární inokulum Nocardia sp. NRRL 8050 v třepací baňce se .připraví inokulací 100 ml sterilního kapalného média v, 500 ml baňkách pomocí steru nebo· promývacího louhu obsahujícího spory, získaného ze šikmého, -agaru kultury. Obvykle se používá tohoto média:

bakto-trypton 5g kvasničný extrakt 5g extrakt z hovězího masa 3g glukóza10g voda do 1000 , ml

Baňky se inkubují při teplotě 25 až 29 °C, přednostně 28 °C a intenzívně se promíchávají 30 až 48 hodin na rotační třepačce. Pak se inokula převedou do· sterilních tub pro uchovávání kultur se šroubovým' uzávěrem a skladují ,se při teplotě ' pod —18 stupňů Celsia. Této, zásoby vegetativního inokula se používá místo, steru ze šikmého· agaru pro inokulací dalších , třepacích baněk určených pro přípravu tohoto inokula prvního· stupně.

Takto, získaného inokula prvního, stupně se použíyá pro, inokulací 12 litrů dávek stejného média ve 20 litrových skleněných fermentačních nádobách.

24/5

11/5

0,51/5

18 z 20 myší zahynulo do 3 dnů po infekci

Médium s inokulem^: se provzdušňuje sterilním vzduchem.· a v růstu se, pokračuje 30 až 48 hodin.

litrů dávek inokula druhého stupně se používá pro očkování nádržových fermentacních nádob obsahujících 300 litrů následujícího sterilního kapalného, média.

masový extrakt 15g síran, amonný 3g střední fosforečnan draselný 3g uhličitmi vápenatý 1g síran hořečnatý (heptahydrát)1,5 g glukóza 10g voda do 1000ml

Glukóza se sterilizuje odděleně. Uvedeným způsobem se získá třetí ' a konečné stadium inokula. Kultivace se provádí tak, že se, půdou v nádobě prohání sterilní vzduch rychlostí 0,4 až 0,8 litrů na litr půdy za , minutu a fermentační směs se míchá rotačním míchadlem 'pracujícím při 150 -až 300 ot./min. Teplota se udržuje na , 25 až 29 °C, obvykle na 28 °C. Kultivace se , provádí po· dobu 48 až , 72 hodin a pak se -inokula použije pro , očkování nádržové fermentační nádoby o obsahu 3000 litrů.

f ‘ermentace , v nádržích pro výrobu látky BM123$ a látky trans-BM123y.

Jako· živné , půdy se pro výrobu В Ml 23$-

-látky a, trans-BM123y-l&tky přednostně, používá následujícího média
masový extrakt	30 g
síran amonný	6g
střední fosforečnan draselný	6g
uhličitan vápenatý	2g
síran hořečnatý heptahydrát	3g
glukóza	20 g
voda do	1000 ml
Glukóza se sterilizuje odděleně.

Každá nádrž se· inokuluje 5 až 10 % inokula třetího stupně získaného shora uvedeným způsobem. Fermentační směs se, udržuje při teplotě 25 až 28 °C, obvykle 26 stupňů Celsia. Směs se provzdušňuje sterilním vzduchem rychlostí 0,3 až 0,5 litrů sterilního, vzduchu na litr Směsi za minutu, a míchá se rotačním míchadlem, pracujícím při 70 až 100 ot./min. Fermentace se provádí po dobu 85 až 90 hodin a pak se výsledný produkt zpracuje.

Následující specifické příklady slouží k bližšímu objasnění vynálezu. Příklady mají pouze ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádném^ směru neomezují.

Produkt „Hodag FD—82” používaný jako pomocná ' ' látka je podle udání výrobce silikonové protipěnové činidlo. Výrobek „Agar pablum” rovněž používaný v příkladech je vysokokapacitní katexová a anexová pryskyřice, popřípadě napuštěná v papíru.

P ř í-k la d-l

Příprava inokula pro produkci BM123S a trans-BM123

Podle následujícího: receptu se připraví typické médium pro kultivaci inokula prvního a druhého stupně lakto-trypton 5g kvasničný extrakt 5g „extrakt z hovězího: masa5g glukóza 10g voda do: 1000 ml

Dvě 5gg ml baňky, z nichž každá obsahuje 1gg· ml shora uvedeného sterilního: prostředí :.se inokulují vždy g ' ml zmrazeného· vegetativního inokula Nocardia sp. NRRL 8ggg. Baňky se umístí na rotační třepačku a ::intenzívně se - míchají 48 hodin; při 28 °C. Výsledné - in-okul um. v , baňce se převede do 23 . litrové skleněné fermentační nádoby obsahující . - 12 litrů shora uvedeného· sterilního- média. - Směs se provzdušňuje- sterilním vzduchem- a růst- se provádí po· dobu asi 48 hodin . a- pak se obsahu nádoby použije pro. inokulaci 454. litrové fermentační nádrže obsahující 30g litrí následujícího sterilního- -.kapalného média masový extrakt15 g síran- - amonný3 g střední - fosforečnan draselný3 g uhličitan vápenatý1. g síran hořečnatý (heptahydrát)1,5 g glukóza11· g voda- do 1000 ml

D01 média pro - přípravu inokula třetíhostupně - se vhání - - sterilní vzduch rychlostí 0,4 - litru vzduchu na litr směsi za minutu. Míchání se provádí rotačním míchadlem pracujícím při 240 - ot/rnin. Směs se udržuje při 28 °C a - pak se jí použije po přídavku Hodag (R) FD 82 pro- inokulaci 3000 litrů živné- půdy.

Příklad 2

Fermentace za použití Nocardia- sp. NRRL 8050 a média - favorizujícího produkci BM123 a trans-BM123y

Fermentační médium se připraví podle následujícího receptu

masový extrakt	30 g
síran amonný	6g
střední fosforečnan draselný	6g
uhličitan vápenatý	2g
síran hořečnatý heptahydrát	3g
glukóza	20 g
voda do	1000 ml
Glukóza se sterilizuje odděleně.

Fermentační médium- se sterilizuje při 120 stupních Celsia párou o tlaku 138 KPa po dobu 60 minut. Hodnota pH média po· sterilizaci je 6,9. 3000 litrů sterilního' média - ve 4000 litrové fermentační nádrži se inokuluje 300 litry inokula popsaného v příkladě 1 a fermentace se provádí za - použití protipěndvého činidla Hodag (R) FD 82. Vzduch se dodává rychlostí 0,35 litru sterilního vzduchu na litr směsi za minutu. Směs se míchá rotačním míchadlem pracujícím při 70 až 72 ot./min. Po 67 hodinách fermentace se fermentační směs- zpracuje.

Příklad 3

Izolace BM123/---átky a trans-BM123/-látky

Hodnota pH 3000 litrů fermentační směsi získané způsobem popsaným· v příkladě- 2 o· pH 4,3 se nastaví na pH 7,0 pomocí hydroxidu sodného a pak se směs - přefiltruje za použití 5% křemeliny, jako pomocného filtračního prostředku. Filtrační -koláč se promyje - asi 100 litry vody a pak se zlikviduje. Směs filtrátu a promývacího louhu - - se čerpá zdola nahoru třemi paralelními nerezovými kolonami o- rozměrech 210 x 1220 milimetrů, z nichž každá obsahuje 15 litrů ionexu CM Sephadex (R) C—25 v sodíkové formě (zesilovaný dextran-epichlorhydrinový katex v gelové formě, výrobek firmy Pharmacia Fine Chemicals lne.]. - Sloupce kafexu se po -adsorbci promyjí celkem asi 390 litry vody a pak se e lnu jí - 200 litry li%' vodného roztoku - chloridu sodného a pak 560 litry 5% vodného roztoku chloridu sodného. Eluát tvořený 5% vodným roztokem chloridu sodného- se vyčeří filtrací - přes křemelinu a vyčeřený filtrát - se nechá projít skleněnou kolonou o rozměrech 229 - x x 1524 mm obsahující 25- litrů granulovaného produktu Darco (R) G—60 (o, zrnění 20 až - 40- mesh), což je granulované - aktivní uhlí vyráběné firmou Atlas Chemical Industries- lne. Sloupec se promyje 12 - litry vody a pak - se- vyvíjí 120 litrů 15% vodného methanolu a pak 340 - litry 50% - vodného methanolu a nakonec 120 litry 50% vodného' acetonu. Eluát tvořený - 15% vodným methanolem se za vakua zkoncentruje na asi 7 litrů vodné fáze a pH vodné fáze- se ze

4,5 nastaví na 6,0 pomocí ionexu Amberlite (R) IR—45 v hydroxylové formě (slabězásaditá anexová pryskyřice polystyren-polyaminoyého typu). - Pryskyřice se - odfiltruje a filtrát se- zkoncentruje - za vakua na asi 1 litr a pak se- lyofiilzuje, čímž se- získá g 'látky s-estávající především z látky

BM123 spolu e malým množsáeím látky trvns-BM^ (pPseážně trcins--BM123/2-lttkk).

Eluát teopsný 50% vodným msthvnolsm ss z hodnoty 4,65 zvlkvlizujs ionsxoeou pryskyřicí Amberlits IR—45 e hydroxylové formě nv hodnotu 6,0. PryskyPics ss odfiltruje v filtrát ss zv evkuv zkoncentrujs nv vsi 6,3 litru ' v tsnto· koncentrát ss lyofilizuje. Získá ss 213 g látky sřstáeající převážně z látky trans-BM123y. Eluát teoPsný 50% eodným vcetonsm ss z hodnoty 4,0 zvlkvlizuje pomocí ionsxoeé pryskyPics Ambsrilits (R) IR—45 e hkdroxyloeém. cyklu nv hodnotu 6,0. PryskyPics ss odfiltruje v filtrát ss zv evkuv zkoncentrujs nv vsi 1,5 litru. Koncentrát ss pvk lyofilizujs, čímž ss získá 56 g nsčisté . látky transBM123.

Příkled 4

Další čištění trvns-BM123y-látky

Suspsnzs CM Ssphadřxu (Rj C—25 e vmonném· cyklu (NH/) es 2% eodném roztoku chloridu vmonného ss nvlijs d^c·· skleněné kolony o· průměru 2,6 cm, vž je sloupsc pryskyPics e koloně vsi 62 cm· eysoký. Přebytek 2% eodného roztoku chloridu vmonného ss odpustí. Vzorek trans-BM123y-látky o· hmotnosti 5 g, áyгobřný způsobem popsvným e pPíklvdě 3 ss rozpustí · e vsi 10 · ml 21% eodného· chloridu vmonného· v roztok ss uv^ss nv sloupsc. Sloupsc ss sluujs eodným chloridem vmonným o· koncsntrvci jřdnak 2 v jsdnvk 4 % (eždy 6 litrů), pPičsmž ss použíeá koncřntračního grvdisntu. Každých 15 minut ss automaticky odebírají 75 ml frekcs. Antibiotikum /га^-ВМ^-Зу ss lokvlizujs e jřdnotliáých frvkcích kontrolou sluátu áktékajícího z kolony pomocí ultrafialového· sáětla a biovutografií pomocí naálhčřných papíroeých kotoučů nv eslkých vgvroeých dsskách inokulovaných kmenřm Klebsiellv pnsumonivs AD. VětVinv látky trans-BM^y ss lokvlizujs mszi frvkcsmi 71 vž 107 ečstně.

130 ml granuloeaného produktu Dvrco (R) G—60 o· zrnění 20 vž 40 mssh ss suspenduje· es eodě, suspsnzs ss pPsářds do skleněné kolony, nschá ss usvdit v pPsbytsk eody ss uschá odtéci. Ervkcs 84 vž 96 ečstně, zs shorv ueřdsné chromvtogrvfis nv CM Ssphvdexu, ss spojí, v nschvjí projít sloupcsm grvnuloevného· uhlí. Sloupsc s ábsor^btoevnou látkou ss promyje 600 ml eody v eyeíjsní ss proeádí 1 litrem 50% eodného vcstonu. Eluáty, z nichž obv obsáhují ^118-1^123/ ^1^1, ss zkoncentrují zv ·evkuv nv eodné fázs v koncentráty ss lyofilizují. Získá ss celkem 886 mg trvns-BM123y--átky es formě hydrochloridu. Mikгc^analySický ezorsk ss získá tvk, žs ss tvto látkv podrobí shorv uesdsnému čištění js-vtě jednou.

Antibiotikum trans-BM^y nemá určitý bod tání, vls postupný · rozklvd zvčmá e blízkosti 200 °C. Mikroanvlýzou. ezorku ekáilibroeáného 24 · hodin pPi 22,2 °C · e vtmosféPe o relvtiení elhkosti 23 % ss zjistí toto· složení: C 39,44 %, H: 6,10 %, N: 16,19 proč., Cl (iontoeý) 11,54 ·%, ztrHv sušením· 8,19 %. Ve eodě poskytuje · ^115-1^123^ -lttká e U. V. vbsorpčním spektru mvximum pPi 286 nm s · E i ·· = 250.

Polohv tohoto m'Vximv ss nemění s hodnotou pH. Trvns-BM123--átkv má , specifickou otáčieost [α]_β25° = +71° (C = 0,97 ee eodě) v ákkázujř cháráktřristické vbsorbce e infráCřrářné oblvsti spektrv pPi · následujících elnoeých délkách: 770, 830, 870, 930, 980, 1035, 1105, 1175, 1225, 1300, 1340, 1370, 1460, 1510, 1555, 1605, 1660, 1740, 2950 v 3350· cm¹.

P ^íkled 5

Izolvcs trans-BM123k1-látky

Suspenze CM Sephvdsxu · (R) C—25 e sodíkoeé formě (Na+) ee 2% eodném roztoku chloridu sodného ss Mlije do skleněné kolony o· průměru 2,6 cm, vž je sloupsc pryskyPics e koloně 70 cm eksoký. PPebytsk 2% eodnéhoí chloridu sodného· . ss odpustí. Vzorek tгáns-BM123/|-látky v mvlého množsteí trans-BM123y2-látky v jiných nečistot o hmotnosti 4,11 g, eyrobsný způsobem · popsvným e pPíkládě 3 se rozpustí e vsi 10 ml 2% eodného roztoku chloridu sodného v Mnese nv sloupsc. Sloupec se sluujs eodným· chloridem · sodným · o konjřdnák 2 v · jsdnvk 4 % (eždy 4 litry), pPičemž ss používI koncentračního* grádisntu. Každých 15 minut se autcmaticky cdebírájí 75 ml frvkcs. Antibiotikum trvns-BM123y se lckálizujř e jsdnotlieých frvkcích kontrolou řlutsu eySékajícího z kolony pomocí ultráfivlc·áéhc seětlv· v bioáutogrvfií pomocí nvelhčsných pvpíroeých kotoučů nv eslkých ágárcáých deskách inokuloevných kmenem Klebsislla pnsumonivs AD. Většinv látky trvns-BM123y ss lokvlizujs mezi fikcemi 64 vž 90 ečstně. Prení f^kcs (64 vž 80) obsáhují směs trvns-BM123/Í v Srvns-BM123/2-láSky, zvtímco pozdější frákcř (81 vž 90) obsvhují e podstátě čistou Srvns-BM123y_r-átku.

100 ml gránuloáánéhc produktu Darco· (R) G—60 o* zrnění 20 vž 40 mesh· ss suspenduje ee eodě, · suspenze se pPseeds do· skleněné kolony, nechá se usvdit v pPsbytek eody ss nechá odtéci. F^kcs 81 vž 90 eče-tně, ze shora uesdsné chromvtogrvfie nv CM Sřphvdřxu, ss spojí, v nechvjí projít sloupcem· gránulcevπéhc uhlí. Sloupec s ábscrbcávncu látkou se promyje 500 ml · eody v eyeíjí 500 ml 10,% eodného methánolu v pvk 1 litrem· 50% eodného methvnolu. Hodnotv pH eluátu e 50% eodném msthvnolu, který obsahuje eětšinu ^^-BM^Syplátky se uprvei z 5,9 nv 6 pomocí ionsxoeé pryskyPicř AmlDerlits (R) IR— —45 e hydroxyloeém cyklu. PryskyPics· se odfiltruje a filtrát se za vakua zkoncentruje na vodnou fázi, která- se lyo-fillzuje. Získá se 294 mg bílé amorfní trans-BM123y₁-látky ve formě hydrochloridu.

Antibiotikum trans-BM1237i nemá ostrý bod tání, ale postupný rozklad začíná v blízkosti 200 &C. Mikroanalýzou vzorku . ekvilibrovaného- v atmosféře o určité vlhkosti se zjistí toto složení: C: 37,84 %, H: 5,73 %>, N; 15,56 %, Cl (iontový), 10,01 %, ztráta sušením 10,45 %. V methanolu poskytuje t-rans-BM1233ii-á1tka U.V. absorpční maximum, při 286 nm s .Ε ίΧ = 225.

Poloha maxima- .se nemění s hodnotou pH. Trans-BM123>y--átka má - specifickou otáčivost +55° (C = 0,803, ve vodě) a vykazuje charakteristiku absorbci v infračervené oblasti spektra. při následujících vlnových délkách: 770, 830, 870, 930, 980, 1045, 1080, 1110, 1125, 1175, 1225, 1305, 1345, 1380, 1465, 1515, 156Q, 1605, 1660, 1730, 2950 a 3350 cmr¹.

Příklad 6

Izolace trans-BM123y₂-látky gramový vzorek obsahující především trans-BM12.3y2- a BM1.23:p--átku připravený způsobem popsaným v příkladě 3, -se rozpustí v -asi 120 ml 2% vodného chloridu sodného a nanese na - sloupec obsahující 1600 ml CM Sephadexu -[Rj C—25 v sodíkové- formě- ve 2)% vodném chloridu sodném. Sloupec se eiuuje gradientem- mezi 20 litry 2% a 20· litry 4% vo-dného -chloridu sodného. -Prvních 12 litrů eluátu se jímá do velké láhve a pak zlikviduje. Pak se každých 40 minut automaticky zachytí frakce asi o objemu 800 ml. Antibiotikum- trans-BM123y se- lokalizuje sledováním frakcí eluátu v - ultrafialovém světle. Většina trans-BM123y--átky se- lokalizuje mezi frakcemi 7 až 18 včetně. Počáteční frakce (7 až 15] obsahují v- podstatě - čistou trans-BM123y₂-látku a pozdější frakce (16 až 18) obsahují směs- trans-BM123y.| a trans-BM123y₂-látky.

600 ml granulovaného produktu Darco (Rj G—60 O¹ zrnění 20 až 40 mesh- .se suspenduje- ve vodě, suspenze se převede do· skleněné kolony, nechá se usadit -a přebytek vody se nechá odtéci. Frakce 7 až 15 včetně, ze- shora uvedené chromatografie na CM Sephadexu se spojí, a nechají projít sloupcem granulovaného- uhlí. Sloupec -s absorbovanou látkou se - promyje 3 litry vody a vyvíjí se 3 litry 10% vodného methanolu a 6 litry 50% vodného methanolu. Hodnota pH 10% vodně-methanolického eluátu se- upraví z 5,8 na 6,0 pomocí ione- xové - pryskyřice Amberlíte (R) IR—45 v hydroxylové- formě. Pryskyřice - se odfiltruje a- filtrát se za vakua zkoncentruje na vodnou fázi, která se lyofilizuje. Získá se 595 mg bílé amorfní traiu--BM123y₂-látky ve formě hydrochloridu. Hodnota pH 50% vod né-methanolickéh-o eiuátu se nastaví z pH

4,6 na - pH 6,1 pomocí ionexové pryskyřice Amberlíte (R) IR—45 v hydroxylové formě. Pryskyřice se -odfiltruje- a - filtrát -se za - vakua zkoncentruje na. vodnou fázi, která se lyofilizuje. Získá se 3,645 g poněkud méně čisté bílé amorfní trans-BM123y2-látky ve formě hydrochloridu.

Antibiotikum trans--BM123y₂ nemá ostrý bod tání, ale postupný rozklad -začíná- v blízkosti teploty 200 °C. Mikroanalýza vzorku ekvilibrovaného 24 hodin' při 22,2 °C v atmosféře o 60 % relativní vlhkosti poskytuje tyto výsledky: C: 36,14 ·%, H: 5,67 %, N: 15,1 %, Cl [iontový] 11,11 %, ztráta, sušeními 10,87 %. V methanolu poskytuje' trans-BM123y₂-látka LJ, V. absorpční maximum při 286 nm s- E i čm = 220.

Poloha tohoto maxima se nemění s pH; Trans-BM123y₂-látka má specifickou otáči- vost +60 (C = 0,51 ve vodě) a vykazuje' ' charakteristické absorpce v infračerveněoblasti spektra při -následujících vlnových délkách: 770, -830, 870, 950, 980, 1035, 1110, 1175, 1225, 1285, 1345, 1380, 1470, 1515, 1560, 1605, 1660, 1755, 2950 a ' 3350 cm1.

P ř í k 1 a d 7

Papírová rozdělovači chromatografie a chrpmatoigrafie v tenké vrstvě látek BM123/S-a trans-BM12'3y.

Antibiotika BM123 lze rozlišit papírovou chromatografií. K tomuto účelu se na. proužky papíru Whatman č. 1 nanesou skvrny vodného- nebo -methanolického roztoku látek a ekvilibrup se 1 až '2 hodiny v přítomnosti jak horní, tak dolní fáze. Proužky ' sevyvíjejí přes noc- spodní (-organickou) fází získanou smícháním 90 % fenol: пйтвф : kyselina octová : pyridin : voda (objemově 100 : 25 : 4 : 4 ': 75). Po- vyvíjení se proužky vyjmou z chromatografické - komory, 1 až 2 hodiny se- suší na vzduchu, promyjí se etherem, aby se odstranil zbylý fenol a bioautografují na velkých agarových deskách naočkovaných Klebsi-ella -pneumianiae kmenem- AD. - Reprezentativní hodnoty Rf jsou uvedeny ' v následující tabulce- VIII:

Tabulka VIII

Složka Rf tran-s-BM123y--átka 0,65

BM123Jtka 0,50, 0,70 β složka se -za použití tohoto systému chová jako směs 2 antibiotik. BM123j3-l^á6ca se skládá z hlavního antibiotika [Rf '— = 0,50) označeného- -BMlžSjf a z v menší míře zastoupeného- - antibiotika (Rf = ' 0,70) označeného* ΒΜ123&.

61^123^111610^3 lze rovněž - rozlišit chromatografn v tenké vrstvě. K tomuto¹ -ú209489 čelu se nanesou na předem- povlečné desky z celulózy F (R) (o tloušťce 0,10 mm), [celulóza ve formě tenkých vrstev, dodávaná firmou EM-Laboratories lne., Elmsford. New York (USA)] skvrny vodného roztoku látky, která má být chromatografována (asi 20 až 40 <ug na skvrnu). Desky se vyvíjejí přes noc rozpouštědlem·- získaným smícháním ^butanolu, vody, pyridinu a kyseliny octové (objemově 15 : 12 : : 10 : 1). Po vyvíjení se desky odstraní z chromatografické komory a nechají na vzduchu během asi 1 hodiny uschnout. Antibiotika se detegují za použití buď standardního ninhydridnového nebo Sakaguchiho reakčního činidla ve formě -spraye. Reprezentativní Rf hodnoty jsou uvedeny v tabulce IX:

Tabulka IX

Složka Rf

BM122r-látka 0,17, 0,23

BM123j-látka 0,08, 0,14

Jak BM123S, tak trans-BM123/--átka se za použití tohoto systému chová jako směs dvou složek. BM123’/Mátka se skládá z hlavní složky (Rf = 0,08) označená jako

BM123i/31-složka a z vedlejší složky (Rf = = 0,14) - označené jako BM123í/?2. Méně polární Složka trans-BM123y-látky (Rf = 0,23) je označována jako trans-BM123y1-látka a polárnější složka (Rf = 0,17) jako trans-BM^yrlátka.

Příklad 8

Příprava cis-BM123/~látky

Roztok 200 mg trans-BM123y-látky ve 200 ml vody se fotolyzuje světlem Hanovia v tříhrdlé baňce s kulatým: dnem opatřené vodním pláštěm po- dobu 1/2 hodiny. Během této doby se- maximum ultrafialové absorbce reakčního roztoku přesune z vlnové délky 290 ηψ na 275 πψ.

Tato fotolytická reakce se nejlépe sleduje tak, že se - odebírají v různou dobu - z- reakční směsi alikvótní vzorky a měří se jejich ultrafialová obsorbce. Reakce- je - skončena poté, co¹ se maximum· absorbce- přesune- z 290 ιημ ná 275 m,u. Produkt se z reakční směsi získá lyofilizací.

Shora- - uvedený postup se opakuje- s tím rozdílem, že- se roztok fotolyzuje 1,5- hodiny. ayofilizací se -získá 170 mg látky cis-BM^y.

Claims

Způsob přípravy cis- |pý2-[ (3-(/4-aminobutyl/amino)propy 1) karbamoy 1 ] vinyl] | gly kosidů, označených jako cis-BM12-3^₁ a cislBM:^:^í3^22l1cr^^U^€^ln^na, -obecného vzorce I kde

R . O

CIS II

CH=CH-C~NH(f)

R představuje v případě BMl-ZS/j-sloučeniny zbytek vzorce
2 O 9 4 8 9 a v případě ' BM123y2-sloučeniny zbytek vzorce vyznačený tím, že se vodný roztok odpovídajícího trans-isomeru ozařuje, světlem o vlnové délce 250 až 400 pm tak dlouho, do kud se výchozí ťrans-isomer v podstatě ' ne převede na odpovídající cis-isomer obec ného vzorce I.