CS206988B1 - Průmyslový kmen houby Aspergillus niger van Tieghem CCM - P - 663 - Google Patents

Abstract

Vynález se týká průmyslového kmene (metanty) houby druhu (species) Aspergillus niger van Tieghem. Průmyslové produkční kmeny mají to společné, že je u nich zvlášť výrazné vyvinuta schop nost produkce určitého metabolitu, v případě citrónového kvašení produkce kyseliny citróno vé. Projevují se však mezi nimi dosti významné rozdíly nejen v intenzitě biochemických pro cesů, ale i v jiných vlastnostech, např. v tvorbě cizích kyselin, rychlosti klíčení koni- dií, růstu hyf a mycelia. Rozdíly mohou být vůči kontaminacím, inhibitorům melas, přísady hexakyanoželeznatanu draselného, stppových prvků, tak i způsobu přípravy melasového substrá tu. Dva různé kmeny houby Aspergillus niger mohou na jedné melase produkovat stejná, na druhé melase rozličná množství kyseliny citrónové. Projevuje se zde vliv různého složení melas, přičemž hrají význačnou roli v melase přítomné stimulátory a inhibitory růstu a tvorby kyseliny citrónové. Průmyslové produkční kmeny jsou sice hodnoceny především z hle diska intenzity produkce kyseliny citrónové, jejich hodnoty však může být zvýšena popř. snížena dalšími vlastnostmi. Současný nejlepší provozně použitelný kmen chráněný podle čs. autorského osvědčení č. 180276 tvoří na vhodných melasách zpracovávaných běžným způsobem maximálně 75 % kyseliny citrónové, ale na méně vhodných melasách pouze 60 až 70 %. Kromě toho není schopen efektivně prokvasit vrstvu substrátu vyšší než 9 cm nebo substrát s kon centrací cukru vyšší než 15 %·

Description

(54) Průmyslový kmen houby Aspergillus niger van Tieghem CCM - P - 663

Vynález se týká průmyslového kmene (metanty) houby druhu (species) Aspergillus niger van Tieghem.

Průmyslové produkční kmeny mají to společné, že je u nich zvlášť výrazné vyvinuta schopnost produkce určitého metabolitu, v případě citrónového kvašení produkce kyseliny citrónové. Projevují se však mezi nimi dosti významné rozdíly nejen v intenzitě biochemických procesů, ale i v jiných vlastnostech, např. v tvorbě cizích kyselin, rychlosti klíčení konidií, růstu hyf a mycelia. Rozdíly mohou být vůči kontaminacím, inhibitorům melas, přísady hexakyanoželeznatanu draselného, stppových prvků, tak i způsobu přípravy melasového substrátu. Dva různé kmeny houby Aspergillus niger mohou na jedné melase produkovat stejná, na druhé melase rozličná množství kyseliny citrónové. Projevuje se zde vliv různého složení melas, přičemž hrají význačnou roli v melase přítomné stimulátory a inhibitory růstu a tvorby kyseliny citrónové. Průmyslové produkční kmeny jsou sice hodnoceny především z hlediska intenzity produkce kyseliny citrónové, jejich hodnoty však může být zvýšena popř. snížena dalšími vlastnostmi. Současný nejlepší provozně použitelný kmen chráněný podle čs. autorského osvědčení č. 180276 tvoří na vhodných melasách zpracovávaných běžným způsobem maximálně 75 % kyseliny citrónové, ale na méně vhodných melasách pouze 60 až 70 %. Kromě toho není schopen efektivně prokvasit vrstvu substrátu vyšší než 9 cm nebo substrát s koncentrací cukru vyšší než 15 %·

206 988

208 088

Uvedené nedostatky tohoto kmene odstraňuje vynález, jímž je nový průmyslový kmen houby druhu (speoies) Aspergillus niger van Tieghem, interně označovaný jako kmen L2, získaný mutací parentálního kmene L houby Aspergillus niger. Nový kmen je uložen v Čs. sbírce mikroorganismů University J.B.Purkyně v Brně, Třída obránců míru č. 10 pod označením CCM-F-663 Vynález, toje kmen 12 předčí parentální kmen L ve vyěěi výtěžnosti o 3 až β % kyseliny citrónové, a zvláětě tím, že lze jeho spory snadněji získat ze aporulační agarové půdy připravené podle autorského osvědčení č. 196162, spory klíčí rychleji a souvislá blanka mycelia se vytvoří o 3 až 5 hodin dříve a je méně citlivý vůči inhibitorům melas, které působí smáčení a potápění mladého mycelia při startu kvasného cyklu. Vůči současnému provoznímu kmenu LI se vyznačuje vyššími výtěžky kyseliny citrónové o 8 až 15 %, schopností efektivně zkvasit melasový substrát s obsahem 15 % cukru o výěce vrstvy substrátu 9 až 15 om, popř. koncentraci cukru až do 18 %. Předpokladem dosažení uvedených výsledků s vynálezem, tj. kme nem L2 je jeho kombinace s melasovým substrátem zbaveným inhibitorů klíčení spor a růstu hyf, například substrátem připraveným podle Doc.Dr.ing. Leopolda a kol., který umožňuje jeho růst a intenzivní biochemickou činnost nebo postupem publikovaným Doo.Dr.ing. Leopoldem a kol. v časopise Nahrung 8 str. 37, 166 (1956). Kmen L2 patří totiž do skupiny kmenů, které jaou citlivé vůči některým v melasách přítomným inhibitorům klíčení spor a růstu hyf. Na nevhodném melaaovéra substrátu spory špatně klíčí, vytvořený myoel se smáčí a potopí se. Mycel intenzivně produkující kyselinu citrónovou se tvoří jen tehdy, když jsou tyto inhibitory z melasy odstraněny, což lze např. dooílit způsobem přípravy substrátu podle Doo.Dr.ing. Leopolda a kol. Kmen L2 během citrónového kvašení tvoří cizí kyseliny (kyselina šťavelová, kyselina glukonové) jen ve etopových množstvích.

V následujících pokusech jsou demonstrovány výhody kmene L2, který se vyznačuje vysokými výtěžky u zkoušených melas, zatímco s kmenem L1 jsou získané výtěžky kyseliny citrónové značně nižěí (tabulka I). Substráty z uvedených melas pro oba kmeny byly připraveny způsobem podle PV Doo.Dr.ing. Leopolda a kol. o názvu Způsob přípravy melasového substrátu pro citrónové kvašení. Pokud byl substrát z uvedených melas připraven běžným způsobem, byly s kmenem L1 dosaženy výtěžky o 3 až 10 % nižší a s kmenem L2 byl takto připravený substrát prakticky nezkvasitelný.

Tabulka I: Výtěžky kyseliny citrónové v procentech na nasazený cukr s kmeny L1 a L2 houby Aspergillus niger na různých melasách. Výška substrátu 9 cm, koncentrace cukru 15 doba kvašení 9 dní.

Melasa Kmeny houby Aspergillus niger

	L1	L2
I	77,4	90,4
II	75,3	88,7
III	72,2	83,9
IV	74,0	86,5

Další výhodp vynálezu, tj. kmene L2 je schopnost prokvasit melasový substrát s obsahem 15 % cukru ve větší výšce než obvyklých 9 cm, tj. na výšce do 15 om (tabulka II).

206 988

Tabulka Zl: Výtěžky kyseliny citrónové v % na nasazený cukr při různých výškách melasového substrátu za použití kmene L2«

Melasa	Výška vrstvy substrátu v cm
9	12	15
I	90,4	87,4	83,0
II	88,7	86,1	82,9
III	83,9	81,0	79,0
IV	86,5	84,0	81,5
Kvasná doba (dny)	9	10	11

K již uvedeným výhodám kmene L2 se řadí ještě jeho schopnost zkvasit melasový substrát o koncentraci cukru až 18 % (tabulka lil).

Tabulka III. Výtěžky kyseliny citrónové v % na nasazený cukr při různé koncentraci cukru melasového substrátu při výšce vrstvy 9 cm.

Melasa	Koncentrace cukru v %
15	18
I	90,4	80,2
II	88,7	77,6
III	83,9	78,0
IV	86,5	78,1
Kvasná doba (dny)	9	10

Výhody kmene L2, tj. schopnost zkvasit vyšší výšky substrátu popř. i vyšší koncentraci cukru než je obvyklé lze kombinovat. Pro nový produkční kmen L2 se osvědčilá sporulační půda podle Leopolda a Ulče podle autorského osvědčení č. 196162. Na této sporulační půdě roste produkční kmen při teplotě 33 až 36 °C a tvoří za 7 až 9 dní hustý koberec středně velkých konidiálních hlaviček, z nichž se dají konidie snadno získat.

Konidiofory jsou v průměru 5 mm dlouhé, konidiální jsou středně velké, střapaté, černé Konidie jsou kulové, hladké, většinou tmavodnědé, v průměru 3 až 4yum. Kulaté vesikle nesou řadu dalších ne vždy stejně dlouhých přimárních sterigmat 20 až 25/um dlouhých, na kterých jsou kratší sekundární sterigmata asi 7 až 9/um dlouhé. Sekundární sterigmata nesou na svých koncích řetězce konidií. Konidie lze konzervovat například ve sterilním písku nebo karborafinu.

Nový produkční kmen byl získán kombinovaným působením nitrosometylmočoviny a UV světla tak, že se na suspenzi spor parentálního kmene L houby Aspergillus niger působilo nejprve 1 hodinu 0,05 % roztokem nitrosometylmočoviny a potom UV světlem v dávce 20 000 ergů/ /mm^. Po působení mutagenních faktorů byly spory podrobeny tepelnému šoku při 50 °C po dobu 1 hodiny. Po jednotlivých stupních následovalo pasážování spojené se selekcemi.

206 008

Příklad 1

V tlakové nádobě vybavené míchadlem a přívodem tlakové páry ee připraví sa studená melasovy roztok s koncentrací cukru 40 %, «praví se pH roztoku kyselinou sírovou na 6,8 a přidá se předem vyzkoušené množství hexakyanoželeznatanu draselného. Po uzavření nádoby se roztok zahřeje přímou parou na teplotu 115 °C, která se udržuje po dobu 30 minut. Potom se roztok přečerpá do beztlakové nádoby, zředí vodou na 30 % cukru a vaří při atmosférickém tlaku dalších 15 minut. Melasový roztok se zředí biologicky nezávadnou voduu na koncentraci 15 % cukru a přidá se 0,09 g kyseliny fosforečné na litr roztoku. Konoentrace volného iontu hexakyanoželeznatanu draselného se má pohybovat kolem 10 mg na 100 ml substrátu.

Je-li třeba, lae koncentraci upravit například podle autorského osvědčení č. 188969· Melasový substrát se převede do kvasných misek a zkvasí kmenem L1 houby Aspergillus niger. Výška substrátu je 9 cm, doba kvašení 9 dnů. Výtěžek kyseliny citrónové počítáno na nasazený cukr je 87,8 %,

Příklad 2

Melasový substrát se připraví stejným způsobem jako u příkladu 1, naplní se do kvasných mlsek na výšku vrstvy substrátu 12 cm a zkvašuje se po dobu 10 dnů kmenem L2. Výtěžek kyseliny citrónové na nasazený cukr je 84,0 %.

Příklad 3

Melasový substrát se připraví stejně jako u příkladu 1, ale roztok se zředí na 18 % oukru. Kvasný proces se vede na výšce substrátu 9 cm po dobu 10 dnů. Výtěžek kyseliny citrónové na nasazený cukr je 80,0 %.

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   Průmyslový kmen houby Aspergillus niger van Tieghem CCM-F-663, produkující kyselinu citrónovou.