CS205126B2

CS205126B2 - Process for preparing 3-/s/-1-phenylethylamino-propylaminobleomycin and non-toxic salt thereof

Info

Publication number: CS205126B2
Application number: CS430178A
Authority: CS
Inventors: Tomohisa Takita; Akio Fujii; Takeyo Fukuoka; Yasuhiko Muraoka; Osamu Yoshioka; Hamao Umezawa
Original assignee: Nippon Kayaku Kk
Priority date: 1977-10-14
Filing date: 1978-06-29
Publication date: 1981-04-30
Also published as: JPS5463089A

Description

Bleomyciny jsou karcinostatická antibiotika objevená Umezawou, jedním z autorů předloženého vynálezu, . a jeho spolupracovníky ' [Journal of Antibiotics, 19A, 200 (1966}]. Jsou to ve vodě rozpustné basické glykopeptidy produkované kmenem aktinomycet Streptomyces verticillus, které snadno tvoří cheláty s jedním atomem dvojmocné mědi. Při normální kultivaci je produkováno 16 složek bleomycinu, které byly všechny isolovány [viz například Umezawa a spolupracovníci, Journal of Antibiotics, 19A, 210 (1966)]. Ze známých bleomycinů se k léčení rakoviny v klinické praxi všeobecně po užívá směsi mědi prostých bleomycinů Ai, Až, As, B.2 a demethyl-A2 (pro tuto směs se v dalším popisu používá názvu „bleomycinový komplex”). Zmíněný bleomycinový komplex se osvědčil ' hlavně v terapii epidermálních karcinomů kůže, karcinomů hlavy a krku, rakoviny krčku děložního, plic a maligního lymfomu.

Pokud se týká vedlejších účinků, bylo referováno, že u léčených pacientů dochází k fibrose plic a k dalším nežádoucím účinkům.

Z vedlejších účinků vyvolávaných bleomyciny je nejobávanější fibrosa plic. Lze si snadno představit, že karcinostatická účinnost bleomycinů by se při klinické aplikaci ještě více projevila, kdyby se shora uvedený vedlejší účinek podařilo více či méně potlačit.

Vzhledem k těmto okolnostem zabývali se autoři vynálezu několik let synthesou různých bleomycinů a v testech na zvířatech sledovali jejich karcinostatickou účinnost a toxicitu, včetně vlivu na vyvolání fibrosy plic jako hlavního testu. Výsledkem jejich studia bylo, že objevili 3-[ (S)-r-fenylethylaminojpropylaminobleomycin [v dalším popisu je tento nový bleomycin označován symbolem „NK 631”, který zahrnuje jak formu obsahující měď, tak formu prostou mědi-, který je novým bleomycinem získaným reakcí reaktivního derivátu karboxylové skupiny bleomycinové kyseliny s N-[ (S)-l’-fenylethyl]-l,3-dtammopropanem, a u kterého je výrazně potlačen vedlejší účinek způsobující fibrosu plic, přičemž jeho· karcinostatická účinnost není ve srovnání s komerčním bleomycinovým komplexem a jinými známými bleomyciny snížena. Na základě tohoto objevu byl realisován předložený vynález. Účelem vynálezu je zaústit způsob výroby nového bleomycinů vzorce I, 3-[(SJ-Γ-fenylethylamino ] propylaminobleomycinu, a jeho netoxických solí. Bližší podrobnosti vynálezu vyplynou z . následujícího popisu.

Vynikající biologická aktivita nového bleomycinu vzorce I vyplývá z níže uvedených experimentálních testů.

Biologická účinnost bleomycinů NK 631 byla hodnocena tím způsobem, že byla srov6 nána s účinností monosulfátu 3-[(R,Sj-r-f enylethylamino^! ] propylaminobleomycinu (formy prosté mědi- (v dalším popisu je pro tento bleomycin používáno označení „RS-forma”] a s účinností bleomycinového komplexu ve čtyřech následujících testech:

účinek na vyvolání fibrosy plic antineoplastická účinnost antimikrobiální účinnost toxicita.

Ke srovnání použitá RS forma bleomycinů byla získána fermentačním způsobem, popsaným v US patentu číslo 3 846 400.

1- Toxicita vůči plícím u myši .(vliv na vznik fibrosyK testování byly použity dvanáctičetné skupiny myších samců kmene ICR ve stáří 15 týdnů. Každý testovaný farmaceutický přípravek byl aplikován v dávce 5 mg/kg. Dávky byly podávány ve formě intraperitoneálních injekcí, jednou denně, po dobu deseti po · sobě následujících dnů. Po skončení aplikace byly myši chovány dalších 5 týdnů. Po uvedené době pozorování byly myši usmrceny a pitvou zjištěn rozsah fibrosy plic. Byl porovnán výskyt a stupeň fibrosy plic vyvolané u myší po podávání nového^ bleomycinů vzorce I, obchodního bleomycinového komplexu a RS formy antibiotika. Nalezené výsledky jsou uvedeny v tabulce I.

Tabulka 1
	Výskyt fibrosy	Stupeň onemocnění
Počet myší s pulmonární fibrosou	Relativní hodnota	Celkové bodové zhodnocení stupně fibrosy plic^x: celkový počet vzorků	Re^ivní hodnota
Monosulfát NK 631 (forma prostá mědi-	4/12 (0,33-	0,36	6/36 (0,17-	0,25
RS forma	7/12 (0,58-	0,63	12/36 (0,33-	0,49
Bleomycinový	11/12 (0,92}	1,0	24/36 (0,67-	1,0

komplex

Hodnoceetstuunёfibbossp lic: 0 plicních sklípcích a fibrose podobné změny v alveobodu — žádná fibrosa bod — hromadění exudátu lárních přepážkách body — fibrosa na několika místech plic body — roztroušená fibrosa bodů — fibrosa na více než dvou třetinách celé plochy plic

5'12 6

Jak je zřejmé z nalezených výsledků, je fibrosa · plic vyvolaná mmosulfátem NK 631 (formou prostou mědi), · ve srovnání s fibrosou · plic · vyvolanou RS · formou antibiotika a bleomycinovým ·komplexem snížena ·· asi na · 1/2, popřípadě 1/3, pokud se · týká · výskutu, a asi na 1/2, popřípadě 1/4, pokud se týká stupně onemocnění. Z tůho · vyplývá výhodnost monosulfátu NK 631 · pro klinické použití.

2. Antir^eoplastická účinnost až 1. · Účinek · in vitro na kultury HeLa Ss buněk

Pro · -každý ' shora uvedený bleomycin bylo stanoveno procento inhibice · růstu buněk po 72 hodinách kultivace v přítomnosti testovaného · bleomycinů · a vypočteno hodnota ID50. Bylo · nalezeno, · že látka NK 631 má IDso = 0,82 ^g/ml, na rozdíl · od b^omyc^vého · komplexu, který má IDso — · 1,70 · ^g/ml, což znamená, že bleomycin NK ' 631 · inhlbuje růst buněk dvakrát silněji než bleomyclnový ·komplex. ·Hodnota IDso pro RS formu an<-8 tibiotika je rovna 0,80 · pg/ml, cdž · znamená, že · jeho inhibiční ·efekt na růst · ·buněk · je srovnatelný · s efektem monosulfátu · NK ·631 (formy prosté mědi}.

2—2.' Karčinostatícký · účinek · na myší ^;:EhHichův · karcinom (solidní nádor}

Myším · samcům · kmene · IGR, · starým · 6 · týdnů, bylo · transplantováno podkožně ·do · tříselné obilast:i'l^a^2^dému · po ··2 X X^Wrtěk. Po 24 hodinách byl ·každé · myši · podán tetovaný · preparát stejným · Jak · byio-pOpsáno výše v testu 1. '-'Patnáctý děn po -subkutánní transplantaci byly ·myším ''nádory odstraněny a · jejich ' 'hmotnosti 'byly · ·srovnány s · hmotností nádorů, které · se · vyvinuly u kontrolní ·skupiny · myší, které · nebyly ošetřeny, a bylo · stanoveno · procento · inhibice.

Jak je · · zřejmé z · tabulky 2, · je : kareinostatická · účinnost mmosuHátu-NK --631 · (formy prosté mědi} srovnatelná · s · účinností Rs formy · antibiotika ·a asi · 1,4 · X · vyšší než 'Účinnost bleůmyclnůvého · komplexu.

Tabu1k a · 2

Dávka mg/kg X 10	monosulfát · NK 631 (prostý mědi.)	Procenta · inhibice RS forma	bleomycinový -komplex
2,7	84	78	67
0,9	68	60	55
0,3	39	51	49
0,1	24	51	24
0,03	19	13	21
0	0	0	0
IDso	0,35	0,31	0,49
mg/kg/den

2—3. · Karcinůstatická účinnost vůči ascitickému hepatonu (ascitický typ) u krys

Krysám kmene Donryu · bylo transplantováno intřapeřitůneálně po 1 X 106 AH 66 buněk. Za 24 hodin po transplantaci bylo započato s aplikací testovaného preparátu, který · byl podáván intrapentoneálně · jednou denně po dobu deseti po sobě-tiáslédújících dnů. Během 30 dnů po transplantaci hýla sledována hmotnost . jednotlivých krys · a -počet uhynulých · a přežívajících, zvířat. 'Výsledky jsou uvedeny ^v · tabulce 3.

Tabulka 3

Relativní . hodnoty průměrného přežití zvířat (počet dnů)

Dávka mg/kg X 10 mo^su^át NK 631 [prostý mědi)

RS forma antibiotika bfeomycinový fkomplex

3,12	296	298	241
1,56	269	257	257
0,78	216	196	145
0,39	163	149	116
0,19	116	121	110
0	100	100	100

2W126

Jak vyplývá z tabulky 3, je účinnost monosulfátu NK 631 (formy prosté mědi) vůči AH ' 66 ascitickému hepatomu srovnatelná s účinností RS _ formy antibiotika a ' je ve všech dávkách vyšší než účinnost · 'bleomycinového· komplexu.

2—4. Inhibiční účinek vůči epidermálnímu karcinomu · 'kůže vyvolávanému 20-methylcholathrenem

Roztok -20-meth'ylc:holanthrenu (dále označovaný jako „20-MC”) v acetonu byl dvakrát týdně, po dobu 18 týdnů, lokálně aplikován na ostříhaný hřbet myší kmene -ddy (sam ci 10 týdnů staří). Za pět týdnů od začátku aplikace 20-MC bylo započato s podáváním testovaného preparátu, který byl aplikován intraperitonálně v dávce 62,5 ^g/myš, dvakrát · týdně, · po · dobu 15 · týdnů. ' Během prvního’ týdne s po·'' skončení podávání testovaného ' ' preparátu byla pathologicky vyšetřována oblast kůže, na kterou byl aplikován 20-MC a sledován výskyt karcinomu.

Jak vyplývá z tabulky 4, jsou monosulfát NK 631 ' (forma prostá mědi) a RS-forma antibiotika o - ' něco málo účinnější pokud se týká inhibice karcinogenesy vyvolané 20-MC, než bleomycinový komplex.

Tabulka ' 4

Úmrtnost Výskyt Procento inhibice karcinomů ' (%)

Monosulfát NK 631 (prostý- mědi)	5/11 (45,4)	47,8
RS-forma	1/12	5/11 (45,5)	47;8
B-l-eomycino-vý
komplex	2/12	5/10 (50,0)	42,5
kontrola	1/24	20/23 (86,9)	0

Ze · ' všech ' ' shora - uvšedených · výsledků tesťů · vyplývá, že · móriosulfát ŇK 631 - (fóřma prostá mědi) má ve srovnání · s komerčním bleomycinovým ''komplexem zřetelně ' vyšší anťineo^lastickou · účinnost.

3. Antimikrobiální účinnost nismům Mycobacterium ''607. a '' Bacillus subtilis 'PCI byla ' zjišťována ' diskovou ' 'metodou za ' 'použití ·bleomycínu Až jako . ' stáň’dářdu (1000 j/mg). '' Výsledky jsou ' uvedeny v tabulce 5.

Antimikrobiálm účinnost vůči mikroorgaTabu 1k a 5

M. 607

B. Sub.

momosuufát NK 631 (prostý mědi)

848

550

RS-forma

535

400 bleomycinový komplex

234

886

Jak vyplývá z tabulky 5, vykazují monosulfát NK 631 (forma prostá mědi) a RS forma antibiotika mnohem vyšší antimikroh ální mohutnost než bleomycinový komplex.

4. Toxicita

4—1. Akutní toxicita u krys (LDso) při intraptrítontáimm podávání

Jak vyplývá z tabulky 6, jsou hodnoty LDso u krysy nalezené pro monosulfát NK 631 (formy prosté mědi) přibližně stejně vysoké jako hodnoty nalezené u bltomycinového komplexu a RS formy antibiotika.

Tabulka 6

	LD50 mg/kg	Meze spolehlivosti (5% hranice významnosti)
	monosulfát NK 631 (prostý mědi)	155,0	133,6—179,8
krysa	RS forma	150,6	129,0—170,6
	bleomycinový komplex	168,0	130,0—217,0

4—2. Subakutní a chronická toxicita u krys a psů

Subakutní a chronická toxicita monosulfátu NK 631 (formy prosté mědí) u krys a psů je srovnatelná s analogickou toxicitou bleomycinového komplexu. Je však třeba se speciálně zmínit o tom, že v místě vpichu injekce byla pozorována u psů nekrosa ve všech případech, kdy byly podány vysoké dávky bleomycinového komplexu (90 injekcí v dávce 1,2 mg/kg), ale v žádném případě, kdy byla podána psům stejná · dávka monosulfátu NK 631 (formy prosté mědi). Toxicita monosulfátu NK ' 631 (formy prosté mědi) vůči plícím je rovněž nižší než toxicita bleomycinového' komplexu.

Z výše uvedených výsledků vyplývá, že toxicita monosulfátu NK 631 (formy prosté mědi) jest srovnatelná s toxicitou bleomycinového komplexu, s ' výjimkou toxicity vůči plícím a nekrosy, které jsou podstatně nižší u NK 631.

5. Souhrn

Ze shora uvedených výsledků testů lze učinit závěr, že bleomycin NK 631 jest nová sloučenina mající následující výhodné vlastnosti:

a) extrémně nízkou toxicitu vůči plícím,

b) antimikrobiální a antineoplastickou účinnost vyšší než komerční bleomycinový komplex,

c) systemickou toxicitu srovnatelou s toxicitou komerčního bleomycinového komplexu, a

d) · nízkou lokální toxicitu v místě vpichu injekce.

Z uvedených důvodů lze očekávat, že bleomycin NK 631 bude výhodný při klinickém použiti.

Podstata výroby nového bleomycinu NK 631 shora uvedeného vzorce I· způsobem podle vynálezu je v tom, že · se kyselina bleomycinová vzorce II i

СИОН uvede do reakce s N-[ (Sj-r-fenylethylj-1,3-diaminopropanem v prostředí rozpouštědla a v přítomnosti aktivačního činidla, při teplotě 0 až 30 °C po dobu 1 až 24 hodin, nebo se kyselina bleomycinová uvede do reakce nejprve s aktivačním činidlem a potom s N-[ (S)-l’-fenylethyl]-l,3-diaminopropanem za uvedených reakčních podmínek, a získaný produkt se popřípadě převede působením kyselinou na příslušnou netoxickou sůl.

* Na jeden ekvivalent kyseliny bleomycinové se obvykle používá 1 až 10 ekvivalentů N- [ (S)-1 ’-fenylethy 1 ] -1,3-diaminopropanu.

Jako rozpouštědla se s výhodou používá « vody, methanolu, dimethylformamidu, dimethylsulfoxidu, nebo jejich směsi.

Získaný produkt se převede popřípadě působením kyseliny chlorovodíkové, kyseliny sírové nebo kyseliny octové na příslušnou netoxickou sůl.

Kyselina bleomycinová používaná jako výchozí látka při postupu jest známá sloučenina a lze ji vyrábět enzymatickým štěpením bleomycinu Bz způsobem popsaným v US patentech číslo 3 843 448 a 3 846 400.

Druhá výchozí složka, N-[(S)-l’-fenylethyl]-l,3-diaminopropan, jest nová sloučenina synthetisovaná ponejprv autory tohoto vynálezu následujícím způsobem.

К fenylethylaminu, ochlazenému asi na 0 °C, se přidá asi ekvivalentní množství akrylonitrilu a reakce se dokončí zahříváním směsi na 80 °C až 100 °C po dobu 10 až 24 hodin. Přebytek akrylonitrilu se oddestiluje za sníženého tlaku a zbývající surový produkt se předestiluje za sníženého tlaku. Získaný 3-[ (S)-r-fenylethylamino]propionitril se zredukuje obvyklým způsobem, například vodíkem v přítomnosti Raneyova niklu, a získá se žádaný N-[ (S]-r-fenylethyl]-l,3-diaminopropan (v dalším popisu je tato látka označována jako „aminosloučenina”). Fyzikálně-chemické vlastnosti uvedené aminosloučenlny jsou shrnuty v tabulce 7.

2' 05 l· 2· 6

Fyzikálně-chemické vlastnosti N-[ (S)-r-fenylethyl]-l,3-diaminopropanu

Tabulka 7

Volná base Dihydrochlorid

1. Vzhled při teplotě místnosti bezbarvá kapalina

2. Teplota tání

3. Teplota varu

4. Absorpční maxima v ultrafialové oblasti (nm)

5. Molekulární extinkční koeficient, ε (256 nm)

6. Specifická optická otáčivost [í]d25

D_n26

7. Hodnota Rf při tenkovrstevné chromatografií, soustava n-propanol-pyridin-kys.octová-voda (15 : 10 : 3 : 12, obj/obj), deska zn. Avicel-SFR

8. Hodnota R_m při vysokovoltové elektroforese, soustava kys. mravenčí* -kys. octová-voda (25 : 75 : 900, obj/obj), deska zn. Avicel-SFR, 800 V, 10 min., Rm alanínu = 1,0

9. IČ absorpční spektrum, cm⁴, KBr tableta — 103 °C při 0,267 kPa

241, 247, 252, 257, 263

267 (methanol) —56,38° (neředěno, λ = 1)

0,73

1,52

10. Sumární vzorec (molekulová hmotnost)

700, 760, 820, 910, 1025,

1080, 1130, 1200, 1305, 1350,

1370, 1450, 1495, 1605, 2850, 2940, 3300, 3375

CnHieNž (178,28) bílé ' jehličkovité krystalky

223,5 — 224 °C

250, 256, 259, 266 (destilovaná voda)

206 (destilovaná voda) —20,6 0 (c = 1, destilovaná voda)

0,73

1,52

690, ' 750, 820, 910, 980,

1020, 1065, 1075, 1150, ‘ 1205,

1385, 1460, 1500, ' ·1515, 1590, 2500, 2850, 3000, 3500

C11Hžd№C12 (251,20)

Jako vhodných aktivačních činidel lze při postupu podle vynálezu používat například

6-chlor-l-p-chborbznzeusulfynyloxynznzotriazolu (CCBT),

N-ethyl-5-fenylisoxazolium-3’-sulfonátu (NEPIŠ),

N-terc.butyl-5-methylisoxazoliumperchlorátu,

N.-ethoxykarbonyl-2-ethoxy-l,2-dihydrochinolinu, p-nitrofenyl-trichloracetátu,

N-hydroxysukcinimidu, dicyklohexylkarbodiimidu (DGC ], l-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyI Jkarbodi imidu, l-cykloliexyl-3- (2-morfolinoethyi Jkarbodiimidu, difenylkarbodiimidu, di-p-toluylkarbodiimidu, diisopropylkarbodiimidu, di-p-nitrofenylsulfitu, tri-p-nitrofenylfosfitu, p-nitrofenolu, pentachlorfenolu a benzylalkoholu.

Podrobný popis postupu

Kyselina bleomycinová (forma obsahující měď) se rozpustí ve vodě, dimethylformamidu, dimethylsulfoxidu nebo v jejich, smě, sích. К roztoku se při teplotě 0°C až 30 °C, * za míchání, přidá jedno ze shora uvedených aktivačních činidel. Získaný roztok se upraví na pH 3 až 10, které je vhodné к aktivaci karboxylové skupiny, přidáním buď anor- * ganicke kyseliny nebo base, jako kyseliny chlorovodíkové nebo hydroxidu sodného, nebo přidáním organické kyseliny nebo base, jako kyseliny trichloroctové nebo N-methylmorfolinu. Po uvedené úpravě dojde к aktivaci karboxylové skupiny bleomycinové kyseliny. Bezprostředně poté, nebo během 30 minut po úpravě pH, se к roztoku této reakční složky přidá aminosloučenina (definovaná výše), buď jako taková nebo ve formě roztoku upraveného na pH 7,0. Reakční směs se udržuje 1 až 24 hodin při teplotě 0 až 30 °C, přičemž proběhne reakce a vznikne bleomycin NK 631 vzorce 1. Vhodný poměr reakčních složek jest 1 až 10 ekvivalentů aktivačního činidla nebo aminosloučeniny na 1 ekvivalent kyseliny bleomycinové.

Za účelem isolace látky NK 631 z reakční směsi se nejprve bleomycinové složky úplně vysráží přidáním 5 až 10 objemů acetonu na 1 objem reakční směsi. Vyloučená sraženina se odfiltruje, promyje důkladně acetonem a rozpustí v nejmenším možném objemu destilované vody. Získaný vodný roztok se okamž^Jtě upraví kyselinou chlorovodíkovou jiebo podobnou kyselinou na pH 6,0 a nanese se na horní konec chromatografického sloupce, připraveného z CM-Sephadexu © C-25 (NH4⁺ forma; vyráběný firmou Pharmacia * Fine Chemicals), rozmíchaného ve vodném roztoku chloridu amonného. Nezreagovaná kyselina bleomycinová projde sloupcem aniž by byla adsorbována. Bleomycin NK 631 se < adsorbuje na pryskyřici a eluuje se vodným roztokem chloridu amonného se stoupající koncentrací, zvyšující se stupňovitě nebo plynule od 0,05 M do 1,0 M. Bleomycin NK 631 jest obsažen v modře zbarvených frakcích, vytékajících ze sloupce při koncentracích asi 0,35 M až 0,45 M chloridu amonného, které vykazují absorpci v ultrafialové oblasti při 292 nm. Uvedené frakce se separátně spojí a nechají se protéci přes sloupec Amberlitu (§) XAD-2 (výrobek firmy Rohm and Haas Co.) nebo Diaionu ® HP 40 (výrobek firmy Mitsubishi Chemical Co.). Adsorbovaný bleomycin NK 631 se promyje vodou a pak se eluuje; získá se solí zbavený efluent, ze kterého se získá čistý, modře zbarvený, amorfní práškovitý NK 631. Hydrochlorid nebo síran bleomycinů NK 631 se získají elucí látky ze sloupce vodným methanolem obsahujícím kyselinu chlorovodíkovou, popřípadě kyselinu sírovou. Při tomto postupu se s výhodou regeneruje nezreagovaná kyselina bleomycinová.

Shora popsaný způsob, při kterém se к isolaci bleomycinů NK 631 používá CM-Sephadexu ©C-25 (obchodní značka pro měnič kationtů, tvořený mikroskopickými kuličkami karboxymethylovaného derivátu polysacharidu dextranu, vyráběný a prodávaný firmou Pharmacia Fine Chemicals lne., Švédsko), jest uveden jen jako názorný příklad, a lze ho v určitých mezích modifikovat, aniž by se tím podstatněji ovlivnily výsledky. Tak například lze použít jako elučního čin^:dla vodného roztoku chloridu sodného nebo síranu amonného.

Uvedeným postupem získaný bleomycin NK 631 obsahuje měď, které se dá zbavit kteroukoliv známou metodou, například působením sirovodíku, pří kterém se měď vysráží ve formě sirníku měďnatého, nebo vyredukováním mědi ve formě kovu vhodným redukčním činidlem (postupem podle US patentu číslo 3 646 197), nebo extrakcí mědi organickým rozpouštědlem obsahujícím clielatotvorné čin^:dlo, jako dithizon [viz Umezawa a spolupracovníci, Journal of Antibiotics, 19A, 210 (1960)], nebo pomocí neionoganní makroskopicky síťované výměnné pryskyřice (postupem podle US patentu číslo 3 929 993). Jeden příklad způsobu odstraňování mědi jest popsán níže.

Bleomycin'NK 631 (forma obsahující měď) se rozpustí v destilované vodě a roztok se nalije na sloupec pryskyřice značky Amberlite (§) XAD-2 (obchodní značka pro absorpční pryskyřici na basi styren-divinylbenzenového kopolymeru, vyráběnou a prodávanou firmou Rohm & Haas Co., USA) nebo pryskyřice značky Diaion @ HP 40 (obchodní značka pro absorpční pryskyřici tvořenou styren-divinylbenzenovým kopolymerem, vyráběnou a dodávanou firmou Mitsubishi Chemical Co., Japonsko), připravený rozmícháním pryskyřice v destilované vodě. Sloupec s naadsorbovaným bleomycinem NK 631 se promyje 5% vodným roztokem dvojsodné soli kyseliny ethylendiamintetraoctové (v dalším je tato látka označována jako „EDTA.Na?”), přičemž se měďnatý iont roztokem EDTA.Na2 vymyje ze sloupce a na pryskyřici zůstane naadsorbován bleomycin NK 631 prostý mědi. Pryskyřice se promyje za účelem odstranění EDTA.Naz vodným roztokem vhodné soli, jako chloridu sodného, síranu sodného nebo octanu sodného, a pak destilovanou vodou. Posléze se sloupcem nechá protékat okyselená směs methanolu s vodou, jako například směs methanolu s 0,0025 N kyselinou chlorovodíkovou (1:1, V/V), přičemž se eluuje látka mající absorp205126 ci v ultrafialové oblasti při 290 nm. Frakce s ' touto absorpcí . se spojí, zahustí, roztok se upraví na pH 6,0 a rozpouštědlo se odstraní lyofilisací. Získá se dihydrochlorid NK 631 (forma prostá mědi) ve formě světležlutě bílého amorfního prášku.

K přípravě okyseleného vodného methanolu potřebného k eluci se dá použít jakékoliv farmaceuticky vhodné kyseliny. Použije-li se například kyseliny sírové nebo kyseliny octové, získá se uvedeným postupem . . práškovitý monosulfát nebo diacetát bleomycinu NK 631 (formy . prosté mědi).

Bleomycin NK 631 vzorce I lze převádět obvyklými způsoby na jiné netoxické soli, jako například na sulfát nebo sůl s kyselinou octovou, které lze rovněž získat tak, že se, jak bylo uvedeno výše, příslušným způsobem zamění kyselina používaná při eluci bleomycinu ze sloupce.

Vzhledem k tomu, že při postupu 1 reaguje aminosloučenina s karboxylovou skupinou kyseliny bleomycinové aktivovanou přítomností aktivačního činidla používaného při . synthese . ' polypeptidů, probíhá kondensační reakce hladce a za extrémně mírných podmínek. V důsledku toho reaguje s akti20 vovanou karboxylovou skupinou pouze primární aminoskupina aminosloučeniny, zatím co sekundární iminoskupina se reakce nezúčastňuje, a při reakci vzniká přednostně bleomycin NK 631. To je významná přednost postupu.

Základní fyzlkálně-chemické vlastnosti bleomycinu NK 631 jsou uvedeny v tabulkách 8 a 9.

Strukturní vzorec I bleomycinu NK 631 byl potvrzen následujícím způsobem: monosulfát NK 631 (forma prostá mědi) byl rozpuštěn v těžké vodě a změřeno jeho 1³C-NMR spektrum· metodou potlačení protonového šumu, za použití dioxanu jako vnitřního standardu. Signály příslušející všem jedenácti 13C atomům obsaženým ve zbytku 3-f(Sj-l’-fenylethylaminojpropylaminu v postranním řetězci bleomycinu NK 631 byly zaznamenány při 19,4, 26,3, 37,0, 43,5, 58,9, 128,3 (dva signály), 130,0 (dva signály) a 136,3 ppm. Signály vyvolané ostatními atomy uhlíku odpovídají signálům charakteristickým pro látky bleomycinové skupiny [viz Naganawa a spolupracovníci, Journal of Antibiotics, 30, 388 (1977)j.

Tabulka 8

Fyzlkálně-chemické vlastnosti bleomycinu NK 631 (formy obsahující měď)

Sůl	Dihydrochlorid	Monosulfát
1.	Vzhled	modrý amorfní prášek	modrý amorfní prášek
2.	Rozpustnost	rozpustný ' ve vodě, metha-	stejná jako u .,dih^ydro-
		nolu, dimethylsulfoxidu, dimethylformamldu; málo rozpustný v dioxanu; nerozpustný v ethanolu, aceto-	chloridu
		nu, etheru, benzenu. *
3.	Teplota tání (rozkladu), °C	205 až. 207	205 až 207
4.	Specifická rotace (destilovaná voda, c — 1,0) [ Oí¹] 436²⁵	—95,6°	—93,7°	1
5.	TL-chiOmaaografie V R_r hodnota	a) 0,72 b) 0,75	a) 0,72 b) 0,75
6.	Elektroforesa 2/	0,80	0,80

RM. hodnota [alanin — 1)

Poznámky:

V a) na tenké vrstvě Silica Gelu G(§) (obchodní značka adsorbentu pro tenkovrstevnou chromatografií, tvořený silikagelem, vyráběný firmou Merek lne., USA)., v soustavě methanol — 10% octan amonný — 10% amoniak (10 : 9 : 1, obj/obj).

b) na ten^ké vrstvě Avicelu SF ® (obchodní zna^čka adsor^bentu ^pro ten^kovrstevnou chromatografii, tvořený krystalinickou celulosou, vyráběný firmou FMC corporation, USA), v soustavě n-propanol — pyridin — kyselina octová — voda (13 : 10 : : 3 : 12).

^2/ Na Avlcelu ^SF @ v soustav^ě k^ysehna mravenft — ^kyselina octov^á . — voda (2⁵ : 7⁵ : : 900, obj/obj); 800 V; 15 minut.

Tabulka 9

Fyzikálně-chemické vlastnosti bleomycinu NK 631 (formy prosté mědi)

Sůl	Dihydrochlorid	Monosutfát	Diacetát
1. Vzhled	světle žlutobíle zbarvený amorfní prášek	světle žlutobíle zbarvený amorfní prášek	světle žlutobíle zbarvený amorfní prášek

2. Rozpustnost Rozpustný ve vodě, methanolu, kyselině octové, dimethylsulfoxidu, dimethylformamidu; málo rozpustný v dioxanu; ' nerozpustný v

	ethanolu, acetonu, etheru, benzenu
3.	Teplota tání (rozkladu), °C	195—197	196—198	188—190
4.	Specifická rotace (destilovaná voda, c = 1,0) [ a] 25436	—2,1°	—2,0°	—2,0'
5.	TL-chromatografie, V Rt· hodnota	a) 0,56 b) 0,70	a) 0,56 b] 0,70	a) 0,56 b) ' 0,70
6.	Elektroforesa, 2/ Rm hodnota (ala-	0,94	0,94	0,94

nin = 1)

Poznámky:

V a) Silica Gel G (P.' ; methanol — 10% octan amonný — 10% amoniak (10 : 9 : 1, obj/obj)

b) . Avicel SF (g) ; n-propanol — pyridin — kyselina octová — voda (15 : ' 10 : 3 : 12)

2/ Avicel SF (§) ; kyselina mravenčí — kyselina octová — voda (25 : 75 : 900, obj/obj); 800 V; 15 minut.

V příloze jsou na obrázcích 1 a 2 znázorněny ultrafialové absorpční křivky, a na obrázcích 3 a 4 infračervené absorpční křivky bleomycinu NK 631 vzorce I.

Obrázek 1 znázorňuje ultrafialovou absorpční křivku dihydrochloridu 3-[ (SJď-fenylethylamino ] propylaminobleomycinu (formy obsahující měď), obrázek 2 ultrafialovou absorpční křivku monosulfátu 3-( (S Jď-fenylethylamlnojpropylaminobleomycinu (formy prosté mědi), na obrázku 3 je znázorněna infračervená absorpční křivka dihydrochloridu 3-[ (Spr-fenylethylaminojpropylaminobleomycinu (formy obsahující měď) měřená v tabletě bromidu draselného, a na obrázku 4 je znázorněna infračervená absorpční křivka 3-[ (S))l’-fenylethylamino]propylaminobleomycinu (formy prosté mědi) změřená rovněž v tabletě bromidu draselného.

Způsob podle vynálezu je podrobně objasněn v následujících příkladech provedení, které však rozsah vynálezu žádným způsobem neomezují.

Příklady provedení

Příklad 1

Synthesa dihydrochloridu (formy obsahující měď] a monosuKátu (formy prosté mědi) bleomycinu NK 631

Stupeň A: K roztoku 15,0 g kyseliny bleomycinové (formy obsahující měď) ve 400 ml dimethylformamidu se za chlazení na 0 °C přidá ' 1,1 ml N-methyymorfolinu a · 10,3 gramu činidla CCBT, roztok se míchá 5 . minut při 0 °C, pak se k němu přidá 5,3 g aminosloučeniny a směs se míchá další 1 hodinu. Reakce se přeruší přidáním 200 ml 25% vodného roztoku kyseliny octové a roztok se zředí 5 litry chladného acetonu. Vysrážený surový reakční produkt se odfiltruje, promyje acetonem a rozpustí v 500 ml destilované vody. Vodný roztok se ihned okyselí na pH 6,0 a nalije na sloupec připravený ze 2 litrů CM-^Sephadexu ⁽§⁾ 02⁵ (NPH + forma] nasuspendovaného v 0,05 M vodném roztoku chloridu amonného.

Naadsorbované bleomyciny se eluují vodným roztokem chloridu amonného tím způsobem, že se sloupcem nechá protéci 20 litrů eluentu, ve kterém koncentrace chloridu amonného kontinuálně stoupá z 0,05 M na 1,0 M. Nezreagovaná kyselina bleomycinová vytéká ze sloupce při koncentraci chloridu amonného asi 0,05 M, a bleomycin NK 631 při koncentraci chloridu - amonného asi 0,45 M. Frakce obsahující shora uvedené bleomyciny, vykazují absorpci v ultrafialové oblasti při 292 nm, se separátně spojí.

Frakce obsahující bleomycin NK 631 se nalije na sloupec iontoměniče, připravený ze ^2,6 litrů Amberlitu _ @ ^XAD-2. ^Sloupec s naadsorbovanou látkou se promyje důkladně vodou a produkt se eluuje 0,01 N roztokem kyseliny chlorovodíkové ve směsi methanolu s vodou (4:1, obj/obj). Jímá se celkem 2,5 litrů modře zbarvených frakcí, které vykazují UF absorpci při 292 nm. Ze spojených eluátů se odpaří methanol, vodný koncentrát se upraví na pH 6,0 Dowexem (§) 44 v OH~ formě (obchodní značka pro anexovou pryskyřici složenou z kopolymerů epichlorhydrinu s amoniakem, vyráběnou a dodávanou firmou Dow Chemical Co., USA] a rozpouštědlo se odstraní lyofilisací. Získá se 16,1 g (výtěžek 92 %) dihydrochloridu bleomycinu NK 631 - (formy obsahující měd] ve formě modře zbarveného amorfního prášku.

Podobným způsobem se z dříve přecházejících frakcí zregeneruje 280 mg nezreagované kyseliny bleomycinová (formy obsahující měď).

Získaný dihydrochlorid bleomycinu NK 631 (forma obsahující měď) má následující spektrální a antimikrobiální - charakteristiky:

Absorpční maxima v ultrafialové oblasti:

1%

Amax (nm) E - - . destilovaná voda

242 (151)

292 (121)

Antimikrobiální mohutnost: 8 100 j/mg

Poznámka:

Antimikrobiální mohutnost byla stanovena za použití Mycobacteria smegmatis ATCC 607 jako testovacího mikroorganismu, ve srovnání s antibakteriální mohutností bleomycinu Až (formy prosté mědi) rovné 1000 j/mg. Stejným způsobem byla testována antimikrobiální mohutnost u níže uvedených bleomycinu.

Stupeň B: Roztok 10 g dihydrochloridu bleomycinu NK 631 (formy obsahující měď) ve 200 ml destilované vody se nalije na sloupec Amberlitu (R) XAD-2, připravený nasuspendováním 600 ml iontoměniče v destilované vodě. Sloupec se postupně promývá 2 litry 5% vodného roztoku EDTA.Naž, 2,5 litry 5% vodného roztoku síranu sodného a 630 ml destilované vody. Poté se produkt ze sloupce eluuje 0,0025 N roztokem kyseliny sírové ve směsi methanolu s vodou (1 : : 1, obj/obj). Jímají se frakce- obsahující látku vykazující absorpci v UF oblasti při 290 nm (celkem 900 ml). Ze spojených frakcí se oddestiluje methanol, zbývající vodný rozto^k se uprav^í Dowexem @44 (v OH formě) na pH 6,0 a rozpouštědlo se odstraní lyofilisací. - Získá se 9,3 g [výtěžek - 95 %) monosulfátu bleomycinu NK 631 (formy prosté mědi] ve formě světle žlutobíle zbarveného amorfního prášku. Uvedený produkt má následující spektrální aantimlkrobiální charakteristiky:

Absorpční maxima v ultrafialové oblasti:

Amax (nm)

290

1% ^E 1% ^{0,1 N} HC1 (106)

Antimikrobiální mohutnost: 7 865 j/mg.

Příklad 2

Synthesa dihydrochloridu NK 631 (formy obsahující měď)

K roztoku 1,5 g kyseliny bleomycinová (formy .obsahující měď] ve 40 ml - destilované vody se za míchání, při teplotě - 26 - °C, přidá 800 mg činidla NEPIŠ, přičemž se pH reakční směsi udržuje přidáváním 0,01 N vodného roztoku hydroxidu sodného v rozmezí 4,8 až 5,5. Po- 30 minutách se ke směsi přidá roztok připravený rozpuštěním 1,8 g aminosloučeniny ve 20 ml destilované vody a upravením pH kyselinou chlorovodíkovou na hodnotu 7,0. Reakční směs se nechá stát 20 hodin při 26 °C a pak se k roztoku za míchání přidá 600 ml chladného acetonu. Vyloučená sraženina bleomycinových složek se odfiltruje, promyje acetonem, rozpustí ve 30 ml destilované vody -a roztok se ihned okyselí 0,1 N kyselinou chlorovodíkovou na pH 6,0. Získaný vodný roztok se čistí způsobem popsaným ve stupni A příkladu 1 a získá se 932 mg (výtěžek 53 %) dihydrochloridu bleomycinu NK 631 (formy obsahující měď] ve formě modře zbarveného amorfního prášku vykazujícího antimikrobiální mohutnost rovnou 8 073 j/mg.

Příklad 3

Synthesa dihydrochloridu NK 631 (formy obsahující měď]

K roztoku 1,5 g kyseliny bleomycinové (formy obsahující · měď] ve 40 ml dimethylsulfoxidu se při teplotě 30 °C, za míchání, přidá 740 mg N-ethoxykarbonyl-2-ethoxy-l,2-dihydrochinolinu a 0,1 ml N-methylmorfolinu. Roztok se míchá 30 minut, pak se za stálého míchání přidá 530 mg aminosloučeniny a směs se nechá stát 3 hodiny při 30 stupních Celsia, Bleomycinové složky se za míchání vysráží přidáním 600 ml chladného acetonu, sraženina se odfiltruje, promyje acetonem, rozpustí ve 30 ml destilované vody a roztok se ihned okyselí 0,1 N kyselinou chlorovodíkovou na pH 6,0. Získaný vodný roztok se zpracuje způsobem popsaným ve stupni A příkladu 1 a získá se 809 mg (výtěžek 46 %) dihydrochloridu bleomycinu NK 631 (formy obsahující měď] ve formě modře zbarveného amorfního prášku, který vykazuje antimikrobiální mohutnost 8 028 j/mg.

P,ř í k 1 a d 4

Synthesa dihydrochloridu NK 631 (formy obsahující měď)

K roztoku 1,5 g kyseliny bleomycinové (formy obsahující měď) ve 40 ml destilované vody se při 27 °C přidá 1,2 g hydrochloridu l-ethyl-3- (3-dimeehylaminopropyl )karbodiimidu a směs se okyselí 0,1 N kyselinou chlorovodíkovou na pH 4,5. Poté se přidá 530 mg aminosloučeniny, pH roztoku se upraví 1 N kyselinou chlorovodíkovou na hodnotu 5,0 a směs se nechá stát 20 hodin při 27 °C, K reakční směsi se za míchání přidá 400 ml chladného acetonu a vysrážené bleomycinové složky se odfiltrují a promyjí acetonem. Surový produkt se rozpustí ve 30 ml destilované vody a roztok se ihned upraví 0,1 N hydroxidem sodným na pH 6,0. Získaný vodný roztok se čistí způsobem popsaným ve stupni A příkladu 1 a získá se 440 mg (výtěžek 25 %) dihydrochloridu bleomycinu NK 631 (formy obsahující měď) ve formě modře zbarveného amorfního prášku, který vykazuje antimikrobiální mohutnost 7 985 j/mg.

Příklad 5

Synthesa dihydrochloridu NK 631 (formy obsahující měď)

K roztoku 9,0 g monohydrochloridu 3-N-benzoylaminopropylesteru kyseliny bleomycinové (formy obsahující měď) se za chlazení na 0 °C přidá 9,16 g aminosloučeniny.

Reakční směs se míchá 40 hodin při 0 °C a pak se přidá dostatečné množství chladného acetonu, kterým se vysráží reakční produkty. Sraženina se odfiltruje, promyje acetonem a · rozpustí v 300 ml destilované vody, Roztok se ihned okyselí 0,1 N kyselinou chlorovodíkovou na pH 6,0 a nalije na sloupec připravený z 1 litru CM-Sephadexu (g)

C-25 (NH4⁺ forma] rozmíchaného v 0,05 · M vodném roztoku chloridu amonného. Sloupec s naadsorbovanými bleomyciny se promývá 10 litry vodného roztoku chloridu amonného, jehož koncentrace se kontinuálně zvyšuje z 0,05 M až na 1,0 M. Nezreagovaný 3-N-eenzoalaminopropeleerer kyseliny bleomycinové se vymývá ze sloupce roztokem chloridu amonného o koncentraci asi 0,2 M, a bleomycin NK 631 chloridem amonným o koncentraci asi 0,45 M. Frakce obsahující tyto bleomyciny, vykazující absorpci v UF oblasti při 272 nm, se separátně spojí. Podíl . obsahující bleomycin NK 631 se nalije na sloupec iontoměni^čové pryskyřice, připravený z 1,3 litru AmbeeUitu @ XAD-2. Sloupec se promyje důkladně vodou a produkt se . eluuje 0,01 N roztokem kyseliny chlorovodíkové ve směsi methanolu s vodou (4:1, obj/obj). Jímá s celkem 2,5 litrů modře zbarvených frakcí, které vykazují absorpci v UF oblasti spektra · při 292 nm. Ze spojených frakcí se oddestiluje methanol, · zbylý vodný roztok bleomycinu se upraví Dowexem f 44 (v OH~ formě) na pH 6,0 a pak se lyofilis^uj^e. Získá se 8,2 g [výtěžek 90· %) dihydrochloridu · bleomycinu NK 631 (formy obsahující měď) ve formě modře zbarveného amorfního prášku, který vykazuje antimikrobiální mohutnost 8 030 j/mg.

Podobným způsobem se z dříve přecházejících frakcí získá 910 mg nezreagovaného monohydrochloridu 3-N-benzoylaminopropylesteru kyseliny bleomycinové (formy obsahující měď).

P říklad 6

Synthesa N-[ (S )-r-fenylethyl]-l,3-diammopropanu („amieotloučeniea”)

K 50 g (Sl-l-fenylethylamirnu se za chlazení na 0 °C a za míchání přidá 33 g akryloeitrilu. Na.baňku s reakční směsí se nasadí zpětný chladič opatřený chlorkalciovým uzávěrem a směs se za míchání · zahřívá 18 hodin na 93 °C. Po skončení zahřívání se přebytečný alkrylonitril oddessiluje za sníženého tlaku a zbývající surový produkt se předestiluje za sníženého tlaku; jímá · se frakce vroucí při 142 až 145 °C při 0,93 kPa. Získá se 53,5 g 3-[ (S))Γ-fenylethylamieoJrropionitrilu.

Získaný nitnl se vnese do hydrogenačního autoklávu, přidá se 5 g Raneyova niklu W-7 a 50 ml ethanolu obsahujícího 15 % amoniaku a směs se hydrogenuje, za míchání rychlostí 1000 otáček za minutu, při teplotě 50 až 58 °C, vodíkem pod parciálním tla205126 kem 10 až 4 MPa po dobu 1,5 hodiny. Po skončení hydrogenace se reakční směs destiluje za sníženého tlaku a jímá se frakce vroucí při 95 až 103 °C při 0,27 kPa. Získá se 48,3 g N-[ (S)-l’-fenylethyl]-l,3-diaminopropanu (výtěžek 66 % teorie, počítáno na výchozí (S]-l-fenylethylamin).

Claims

1. Způsob výroby 3-[ (S)-l’-fenylethylami-no]propylaminobleomycinu vzorce I •G i*

O

1 z a jeho netoxickýcli solí, vyznačující se tím, že se kyselina bleomycinuová vzorce II

CH.

^H0'cR'c' o

H (ID uvede do reakce s N-[ (S)-r-fenylethyl]-l,3-diaminopropanem v prostředí rozpouštědla a v přítomnosti aktivačního činidla, při teplotě 0 až 30 °C po dobu 1 až 24 hodin, nebo se kyselina bleomycinová uvede do reakce nejprve s aktivačním činidlem a potom s N- [ (S) -Γ-f enylethyl ] -1,3-diaminopropanem za uvedených reakčních podmínek, a získaný produkt se popřípadě převede působením kyselinou na příslušnou netoxickou sůl.

2. Způsob podle bodu 1 vyznačující se na jeden ekvivalent kyseliny bleomycinové používá 1 až 10 ekvivalentů N-[ (S)-l’-fenylethyl ] -1,3-diaminopropanu.

3. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se jako rozpouštědla používá vody, methanolu, dimethylformamidu, dimethylsulfoxidu nebo jejich směsi.

4. Způsob podle bodů 1 až 3 vyznačující se tím, že se získaný produkt převede působením kyseliny chlorovodíkové, kyseliny sírové nebo kyseliny octové na příslušnou netoxickou sůl.