CS203539B1 - Způsob čištění nsurohypofyzárních hormonů a jejich analogů - Google Patents
Způsob čištění nsurohypofyzárních hormonů a jejich analogů Download PDFInfo
- Publication number
- CS203539B1 CS203539B1 CS722978A CS722978A CS203539B1 CS 203539 B1 CS203539 B1 CS 203539B1 CS 722978 A CS722978 A CS 722978A CS 722978 A CS722978 A CS 722978A CS 203539 B1 CS203539 B1 CS 203539B1
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- acetic acid
- product
- solution
- lyophilization
- fractions
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 21
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 title claims description 5
- 239000005556 hormone Substances 0.000 title claims description 5
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 title description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 141
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 13
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 9
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 6
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 6
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 5
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- -1 carboxylate cation Chemical class 0.000 claims description 3
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 claims description 3
- 238000004810 partition chromatography Methods 0.000 claims description 3
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N Styrene Natural products C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 claims description 2
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 claims description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 2
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 claims 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 26
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 12
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 12
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 11
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 6
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 3
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 description 3
- WCTCYQXADOLLKF-CKNUHMDMSA-N (2s)-1-[(4r,7s,10s,13s,16s,19r)-19-amino-7-(2-amino-2-oxoethyl)-10-(3-amino-3-oxopropyl)-13-[(2s)-butan-2-yl]-16-[(4-methoxyphenyl)methyl]-6,9,12,15,18-pentaoxo-1,2-dithia-5,8,11,14,17-pentazacycloicosane-4-carbonyl]-n-[(2s)-1-[(2-amino-2-oxoethyl)amino]- Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](N)C(=O)N1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(N)=O)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(OC)C=C1 WCTCYQXADOLLKF-CKNUHMDMSA-N 0.000 description 2
- 101800000989 Oxytocin Proteins 0.000 description 2
- 102400000050 Oxytocin Human genes 0.000 description 2
- XNOPRXBHLZRZKH-UHFFFAOYSA-N Oxytocin Natural products N1C(=O)C(N)CSSCC(C(=O)N2C(CCC2)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C1CC1=CC=C(O)C=C1 XNOPRXBHLZRZKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 2
- NFLWUMRGJYTJIN-PNIOQBSNSA-N desmopressin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CSSCCC(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(N)=O)=O)CCC(=O)N)C1=CC=CC=C1 NFLWUMRGJYTJIN-PNIOQBSNSA-N 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 2
- 108700032510 methyl oxytocin Proteins 0.000 description 2
- XNOPRXBHLZRZKH-DSZYJQQASA-N oxytocin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](N)C(=O)N1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(N)=O)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 XNOPRXBHLZRZKH-DSZYJQQASA-N 0.000 description 2
- 229960001723 oxytocin Drugs 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NDBNSZKHDMXOJE-UHFFFAOYSA-N 3-benzylsulfanylpropanoic acid Chemical compound OC(=O)CCSCC1=CC=CC=C1 NDBNSZKHDMXOJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108010070873 Posterior Pituitary Hormones Proteins 0.000 description 1
- 102000005320 Posterior Pituitary Hormones Human genes 0.000 description 1
- GXBMIBRIOWHPDT-UHFFFAOYSA-N Vasopressin Natural products N1C(=O)C(CC=2C=C(O)C=CC=2)NC(=O)C(N)CSSCC(C(=O)N2C(CCC2)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C1CC1=CC=CC=C1 GXBMIBRIOWHPDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010004977 Vasopressins Proteins 0.000 description 1
- 102000002852 Vasopressins Human genes 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 235000008504 concentrate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 125000000325 methylidene group Chemical group [H]C([H])=* 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- GAPYKZAARZMMGP-UHFFFAOYSA-N pyridin-1-ium;acetate Chemical compound CC(O)=O.C1=CC=NC=C1 GAPYKZAARZMMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 229960003726 vasopressin Drugs 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Vynález se týká způsobu čištění neurohypofyzárních hormonů a jejich analogů. Jak známo, využívá se těchto novodobých léčiv ve stále širší míře v humánním i veterinárním lékařství, a to ve formě preparátů připravovaných ze substancí získaných metodami syntézy peptidů. Jedním z kvalitativních požadavků je standardní čis2 tota. Syntéza neurohypofyzárních hormonů a jejich analogů je mnohastupňový proces, v jehož závěru jsou z chráněného prekurzoru odštěpeny chránící skupiny a je proveden oxidativní uzávěr disulfidického můstku podle následujícího schématu (závěrečné stupně syntézy l-desamino-8-D-arginin-vasopressinu ):
Mpa (Bzl) -Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys (Bzl) -Pro-D-Arg (Tos) -Gly-NH2 . redukce sodíkem i v kapalném amoniaku
SH
SH oxidace, čištění
Závěrečný stupeň je v principu u všech látek uvedeného typu stejný nebo velmi podobný.
Při procesu probíhá obvykle i řada vedlejších reakcí a surový produkt bývá kontaminován velkým množstvím solí. K čištění produktů byla dosud používána beznosičová elektroforéza, protiproudné roztřepávání a různé způsoby gelové chromatografie. Nevýhodou elektroforetických postupů je zatím jejich poměrně malá kapacita, nezbytnost pracovat v nepřetržitém provozu, potřeba speciálně školených pracovníků, kteří jsou vystaveni riziku práce s vysokým napětím (4000 VJ. Při poruše přístroje může dojít ke ztrátě ve mi drahého materiálu.
Technika protiproudného roztřepávání vyžaduje použití obtížně dostupného a velmi drahého přístroje. Čištění trvá značně dlouho, zejména při práci ve velkém ebjemu. Po provedené operaci je nutno průběh čištění komplikovaným způsobem vyhodnotit.
Při využití gelové filtrace dochází za obvykle užívaných podmínek k částečné (někdy ireverzibilní J adsorpci materiálu na sloupci gelu. Provádí-li se gelová chromatografie ve dvoufázovém systému, jsou produkty obvykle kontaminovány pyridinacetátem, který je možno dokonale odstranit jen zařazením další čisticí operace. Postup je sice účinný, vyžaduje však náročnou přípravu gelového sloupce. Vyhodnocení průběhu čištění je pracné a výtěžky jsou nízké.
Ve všech případech, s výjimkou protiproudného roztřepávání, je jednou z podmínek úspěchu při čištění dokonalé odsolení surového materiálu. To se provádí obvykle buď na sloupci gelu, nebo pomocí ionexu. Při odsolení na sloupci gelu je nutno produkt rozpuštěný ve velkém objemu vody nejprve izolovat odpařením. U některých peptidů je tento způsob odsoioní výhodnější než ionexová chromatografie, jejíž použití je omezeno adsorpčními schopnostmi látek a velmi závisí na přesném dodržení pracovního postupu.
K zajištění standardní čistoty syntetických substancí neurohypofyzárních hormonů a jejich analogů bylo zapotřebí nalézt a vypracovat čisticí postup dostatečně šetrný a jednoduchý a se zřetelem na objem výroby s velikou a plynule měnitelnou kapacitou, jenž by ovšem neměl nevýhody čistících metod dosavadních.
Zmíněným požadavkům odpovídá způsob čištění neurohypofyzárních hormonů a jejich analogů, obsažených v reakčním roztoku po odštěpení chránících skupin a po oxidaci, podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se reakční roztok nejprve zbaví solí, s výhodou stykem s karboxylátovým katexem na bázi kopolymeru styrenu s divinylbenzenem nebo s prokříženým dextranem nesoucím karboxylové skupiny, potom se žádaný produkt vymývá koncentračním gradientem kyseliny octové od 0,25 až do 60% hmot., frakce obsahující produkt se zbaví vody, s výhodou lyofilizací, získaný produkt se opět rozpustí v 5 až 20% kyselině octové na roztok o koncentraci 3 až 5% hmot. a tento roztok se po odstranění mechanických nečistot zbaví hežádoucích podílů adsorpční rozdělovači chromatografií na molekulárním sítě, s výhodou typu zesí (ováného dextranu, s dělící schopností pro látky s molekulární hmotností od 100 do 1500, načež se frakce eluují zředěnou kyselinou octovou v koncentraci 5 až 60% hmot., s výhodou 20% hmot. a frakce obsahující produkt se zpracují, například lyofilizací.
Způsob podle vynálezu v sobě spojuje výhody ionexové chromatografie a molekulárních sít typu dextranového gelu, zejména při použití diskontinuálního koncentračního gradientu kyseliny octové po odsolení a čištění. Hustě síťované gely obsahují větší množství karboxylových skupin (některé druhy představují slabě kyselý katex obsahující na dextranové matrici vázané methylenkarboxylové skupiny), které látky uvedeného typu silně adsorbují. Při frakcionaci lze této vlastnosti využít a pracovat za podmínek, kdy se adsorpční a sítovací schopnosti materiálů vhodně doplňují, je to patrné u některých typů dextranových gelů v oblasti pH, kdy se již prakticky neuplatňují jejich ionexové vlastnosti (oblast pH 1,5 až 2,5j, při použití 15 až 30% kyseliny octové k eluci peptidu. jde tedy v tomto případě o adsorpční rozdělovači chromatografií.
Při kombinaci ionexové chromatografie a adsorpční chromatografie na molekulárním sítě způsobem podle vynálezu, je odstraněna většina nevýhod výše zmíněných postupů. Způsob podle vynálezu je šetrný, má značnou, plynule měnitelnou kapacitu, je velmi jednoduchý, jeho pracnost je ve srovnání s ostatními postupy zanedbatelná a je maximálně sníženo riziko ztráty materiálu. Další předností je bezpečnost, nízké nároky na kvalifikaci obsluhy a na energii.
Bližší podrobnosti způsobu podle vynálezu jsou patrné z příkladů provedení, které tento způsob pouze ilustrují, ale nijak neomezují.
Příklady provedení
Příklad 1
Odsolení a čištění l-desamino-8-D-arginin-vasopressinu
a) Reakční roztok po oxidaci, který obsahuje l-desamino-8-D-arginin-vasopressin, směs vedlejších produktů a soli ve 30 litrech vody (pH asi 4,5), se přečerpává přes kolonu slabě kyselého katexu v H+-cyklu (objem katexu 2,0 až 2,5 litru). Při této operaci se látka zachytí na sloupci, soli protékají a odvádějí se do odpadu. Kolona se pak promývá koncentračním gradientem kyseliny octové od 0,25 až do 60 procent hmotn. Sleduje se absorpce při 280 nm. Eluát obsahující produkt se zbaví vody, nejlépe lyofilizací. Získá se asi 10 g odsoleného produktu,
b) Reakční roztok jako výše se na odparce zahustí na objem 2,5 až 5,0 litru a lyofilizuje. Získaná směs peptidů a solí (150 až 300 g) se rozmíchá se 400 až 600 mililitry 50% kyseliny octové, zfiltruje se a filtrát se nanese na kolonu molekulárního síto sypu dextranového gelu (objem gelu 7 litrů), ekvilibrovaného v 50% kyselině octové. Eluuje se 20% kyselinou octovou rychlostí 300 až 500 ml/h a sleduje se absorpce při 280 nm. Eluát se lyofilizuje. Získá se asi 10 g odsoleného produktu.
c] Odsolený produkt se rozpustí na 3 až 5% roztok v 1 M kyselině octové, zfiltruje se a nanese na kolonu molekulárního síta (10 x 100 cm], ekvilibrovaného v 1 M kyselině octové. Eluuje se 20% kyselinou octovou rychlostí 300 až 500 ml/h a sleduje se absorpce při 280 nm. Frakce obsahující dostatečně čistou látku se dále zpracují například lyofilizací. Získají se asi 3 g 100% peptidu.
d) Odsolený produkt se rozpustí na 3 až 5% roztok ve 20% kyselině octové a nanese se na 2 litry dextranového gelu ekvilibrovaného ve 20% kyselině octové. Kolona se eluuje buď 20% kyselinou octovou nebo koncentračním gradientem kyseliny octové od 20 do 70 % hmotn. Sleduje se absorpce při 280 nm. Frakce obsahující dostatečně čistou látku se dále zpracují například lyofilizací. Získají se asi 3 g 100% peptidu.
Stanovení obsahu: a) z UV spektra minimálně 70 % b ) podle obsahu dusíku 13,5 — 18,34 % N
Optická otáčivost:
(α>)η 2θ — 62,0 (c 0,1 M kys. octová)
Aminokyselinová analýza:
Phe 1,02, Tyr 0,84, Gly 1,00, Pro 0,95,
Glu 1,04, Asp 0,98, Arg 1,01,
Cys — nestanovuje se
Příklad 2
Odsolení a čištění oxytocinu
a) Reakční roztok po oxidaci, který obsahuje směs oxytocinu, peptidů a solí ve 2 litrech vody (pH asi 4,5), se zahustí na objem 200 ml a lyofilizuje. Získaná směs peptidů a solí (7 g) se rozmíchá s 20 až 30 ml 50% kyseliny octové, zfiltruje a filtrát se nanese na 500 ml dextranového gelu, ekvilibrovaného v 50% kyselině octové. Eluuje se 20% kyselinou octovou rychlostí 60 ml/h a sleduje se absorpce při 280 nm. Eluát obsahující produkt prostý solí se lyofilizuje. Získá se 1 g odsoleného produktu. Ten se rozpustí na 3 až 5% roztok v 1 M kyselině octové, který se zfiltruje a nanese na kolonu dextranového gelu (3 x 100 cmj ekvilibrovaného v 1 M kyselině octové. Eluuje se 20% kyselinou octovou rychlostí 15 ml/h a sleduje se absorpce při 280 nm. Frakce obsahující dostatečně čistou látku se lyofilizují. Získá se 0,65 g produktu.
Stanovení obsahu:
aj UV spektra 89 % (e 15,76, voda pH 3,3, HC1)
b) podle obsahu dusíku 13, 63 %
Optická otáčivost:
(α)ϋ20-— 23,4 (c 0,1 1 M kys. octová)
Aminokyselinová analýza:
Gly 0,93, Leu 0,97, Pro 0,97, Asp 1,00,
Glu 1,05, Ile 1,05, Tyr 0,93, 1/2 Cys 1,93 Příklad 3
Odsolení a čištění metyloxytocinu
a) Reakční roztok po oxidaci, který obsahuje směs metyloxytocinu, peptidů a solí ve 20 litrech vody (pH asi 4,5) se přečerpává přes kolonu slabě kyselého katexu v H+—cyklu (objem 2 až 3 litryj. Při této operaci se látka zachytí na sloupci, soli protékají a odvádějí se do odpadu. Kolona se pak promývá koncentračním gradientem kyseliny octové od 0,25 až do 60. % hmotn. Sleduje se absorpce při 280 nm. Eluát obsahující produkt se dále zpracuje například lyofilizací. Získají se asi 4 g produktu prostého solí.
b) Reakční roztok po oxidaci, který obsahuje metyioxytocin, různé vedlejší produkty a soli v 60 litrech vody (pH asi 4,5) se zahustí na objem 2,5 až 5,0 litrů a lyofilizuje. Získaná směs látek (150 až 300 g) se rozmíchá se 400 až 800 ml 50% kyseliny octové, zfiltruje se a filtrát se nanese na · kolonu s obsahem 7 litrů dextranové ho gelu, ekvilibrovaného v 50% kyselině octové. Eluuje se 20% kyselinou octovou rychlostí 300 až 500 ml/h a sleduje se absorpce při 280 nm. Eluát obsahující odsolený produkt se lyofilizuje. Získá se 20 g odsoleného produktu. Celé toto množství se rozpustí na 3 až 5% roztok v 1 M kyselině octové, zfiltruje se a nanese se na kolonu dextranového gelu (10 x 100 cmj, ekvilibrovaného v 1 M kyselině octové. Eluuje se 20% kyselinou octovou rychlostí 300 až 500 ml/h a sleduje se absorpce při 280 nm. Frakce obsahující dostatečně čistou látku se pak zpracují například lyofilizací. Získá se asi 6 g produktu.
Stanovení obsahu:
aj UV spektrum 88,6 % (e 15,76, voda, pH 3,3, HClj
b) podle obsahu dusíku 15,0 %
Optická otáčivost:
(orJD 20 — 18,9 (c 0,15, 1 M kys. octová)
Aminokyselinová analýza:
Asp 0,98, Glu 1,02, Pro 1,04, Gly 0,93,
Ile 0,93, Leu 1,02, Tyr 0,92, 1/2 Cys 1,90 Příklad 4
Odsolení a čištění (Gly.Gly.Gly.CyshLys1 }vasopressinu
a) Reakční roztok po oxidaci s obsahem produktu, směsi peptidů a solí ve 30 litrech vody (pH asi 4,5) se přečerpává přes kolonu slabě kyselého katexu v H+ — —cyklu (objem katexu 2,0 až 2,5 litru). Při této operaci se žádaná látka zachytí na sloupci, soli protékají a odvádějí se do odpadu. Kolona se pak promývá koncentračním gradientem kyseliny octové od 0,25 až do 60 % hmotn. Sleduje se absorpce při 280 nm. Eluát obsahující produkt se zpracuje lyofilizací. Získá se asi 10 g odsoleného produktu.
b) Reakční roztok jako výše se zahustí na objem 2,5 až 5,0 litrů a lyofilizuje. Získaná směs peptidů a solí (150 až 300 g) se rozmíchá se 400 až 600 ml 50% kyseliny octové, zfiltruje a filtrát se nanese na kolonu obsahující 7 litrů dextranového gelu ekvilibrovaného v 50% kyselině octová. Eluuje se 20% kyselinou octovou rychlostí 300 až 500 ml/h a sleduje se absorpce při 280 nm. Eluát se lyofilizuje a získá se asi 10 g odsoleného produktu.
c) Odsolený produkt, získaný podle a) nebo bj se rozpustí v 1 M kyselině octové na 3 až 5% roztok, zfiltruje se a nanese na kolonu dextranového gelu (10 x 100 cm) ekvilibrovaného v 1 M kyselině octové. Eluuje se 20% kyselinou octovou rychlostí 300 až 500 ml/h a sleduje se absorpce při 280 nm. Frakce obsahující dostatečně čistou látku se dále zpracují lyofilizací. Získají se asi 3 g 100% peptidů.
d) Odsolený produkt, získaný podle a] nebo b), se rozpustí ve 20% kyselině octové na 3 až 5% roztok a nanese se na kolonu obsahující 2 litry dextranového gelu ekvilibrovaného ve 20% kyselině octové. Kolona se eluuje buď 20% kyselinou octovou, nebo koncentračním gradientem kyseliny octové od 20 do 70 % hmotn. Sleduje se absorpce při 280 nm. Frakce obsahující dostatečně čistou látku se lyofilizují. Získá se kolem 3 g 103% peptidů. Stanovení obsahu:
podle obsahu dusíku 13,5 — 18,25 % N Optická otáčivost:
(a)D 20 — 95,0 (c 0,2 1 M kys. octová)
Aminokyselinová analýza:
Lys 0,99, Phe 1,04, Tyr 0,90, Cys :1,72, ;
Gly 4,03, Glu 1,01, Pro 1,06, Asp 0,98
Claims (1)
- PŘEDMĚTZpůsob čištění neurohypofyzárních hormonů a jejich analogů, obsažených v reekčním roztoku po odštěpení chránících skupin a po oxidaci, vyznačující se tím, že se reakční roztok nejprve zbaví solí, s výhodou stykem s karboxylátovým katexem na bázi kopolymeru styrenu s divlnylbenzenem nebo s zesíťovaným dextranem nesoucím karboxylové skupiny, potom se žádaný produkt vymývá koncentračním gradientem kyseliny octové od 0,25 až do 60 procent hmot. frakce obsahující produkt se zbaví vody, s výhodou lyofylizací, získanýY N Á L E Z U produkt se opět rozpustí v 5 až 20% kyselině octové na roztok o koncentraci 3 až 5 % hmot. a tento roztok se po odstranění mechanických nečistot zbaví nežádoucích podílů adsorpční rozdělovači chromatografií na molekulárním sítě, s výhodou typu zesíťovaného dextranu, s dělicí schopností pro látky s molekulární hmotností od 100 do 1500, načež se frakce eluují zředěnou kyselinou octovou v koncentraci 5 až 60 % hmot., s výhodou 20 % hmot. a frakce ohsahujcí produkt se zpracují, například lyofilizací.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS722978A CS203539B1 (cs) | 1978-11-06 | 1978-11-06 | Způsob čištění nsurohypofyzárních hormonů a jejich analogů |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS722978A CS203539B1 (cs) | 1978-11-06 | 1978-11-06 | Způsob čištění nsurohypofyzárních hormonů a jejich analogů |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS203539B1 true CS203539B1 (cs) | 1981-03-31 |
Family
ID=5421062
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS722978A CS203539B1 (cs) | 1978-11-06 | 1978-11-06 | Způsob čištění nsurohypofyzárních hormonů a jejich analogů |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS203539B1 (cs) |
-
1978
- 1978-11-06 CS CS722978A patent/CS203539B1/cs unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4519646B2 (ja) | プレプロインスリンの精製方法 | |
| Simon et al. | A new procedure for purifying histone pairs H2A+ H2B and H3+ H4 from chromatin using hydroxylapatite | |
| EP0229696A1 (en) | Tangential flow affinity ultrafiltration | |
| von Holt et al. | Fractionation of histones on molecular sieve matrices | |
| JPS63503352A (ja) | タンパク質の精製 | |
| US5728805A (en) | Pharmaceuticals and method for making them | |
| Bishop et al. | High-performance liquid chromatography of amino acids, peptides and proteins: XXI. The application of preparative reversed-phase high-performance liquid chromatography for the purification of a synthetic underivatised peptide | |
| CS203539B1 (cs) | Způsob čištění nsurohypofyzárních hormonů a jejich analogů | |
| JPH03118393A (ja) | ペプチド又はプソイドペプチド構造の低分子量化合物の精製方法 | |
| EP0087066B1 (en) | Process for purifying secretin | |
| Chin et al. | A convenient method for preparative peptide separation | |
| US3959249A (en) | Method for isolating transferrines from biological materials | |
| NZ208241A (en) | Purification of blood plasma or serum: selective removal of (very) low density lipoproteins (ldl and vldl) | |
| JP2003512069A (ja) | 高純度アカルボース製造方法 | |
| US4677192A (en) | Process for the separation of mixtures of insulin, insulin derivatives and, where appropriate, impurities | |
| KR0142172B1 (ko) | 리보뉴클레아제 이량체를 만드는 개량된 방법 | |
| US6015878A (en) | Antitumor agents isolated from intestinal mucosa, a method for their isolation and their application | |
| JPH09124565A (ja) | アミノ酸及び／又はアミノスルホン酸の分離除去法 | |
| Thamm et al. | Photoreactive insulin derivatives: preparation and characterization | |
| Knight et al. | Purification of synthetic peptides on a high-resolution preparative reversed-phase column | |
| Ashman et al. | High-speed preparative reversed-phase high-performance liquid chromatography of synthetic oligonucleotides | |
| Johnson et al. | Resin effects in solid-phase peptide synthesis. Enhanced purity of tryptophan-containing peptides through two-step cleavage of side chain protecting groups and peptide–resin linkage | |
| JPH08183768A (ja) | Ｌ−プロリンの単離法 | |
| Vasconcellos et al. | Adsorption of phenylalanine from casein hydrolysates | |
| AT398767B (de) | Verfahren zur reinigung eines rohpeptids mittels präparativer mitteldruckflüssigkeitschromatographie |