CS198195B2 - Process for preparing 4-imino-1,3-diazabicyclo/3,1,0/hexan-2-one - Google Patents

Description

Je již známa řada kancerostaticky účinných sloučenin, které svým zásahem do metabolismu rychle se dělicích rakovinných buněk tak silně poškozují nádory, že se sníží jejich růst nebo se dokonce dosáhne původního stavu. Úplné remise pouze pomocí léčiva lze však jen velmi těžko dosáhnout, protože к danému účelu potřebné vysoké dávky napadají a rozkládají i zdravé tělesné tkáně. Mimoto se ukázalo, že většina cytostatik v potřebných vysokých dávkách poškozují autošmunologický obranný systém, který pak jíž není schopen ničit zbylé rakovinné buňky, popřípadě bránit jejich růstu. Dále se snížením imunologické obrany sníží i odolnost již tak zeslabeného organizmu vůči bakteriálním a virovým infekcím.

Existuje tedy úkol nalézt kancerostaticky účinné léčivo, které by autoimunologickou obranu neomezovalo a popřípadě ještě stimulovalo. Nyní bylo zjištěno, že 4-imino-l,3-diazabicyklo) 3,1,0 ]hexan-2-on, který je možno znázornit následujícími tautomerními strukturními vzorci I až III

NH

popřípadě jeho fyziologicky snášitelné soli, vykazují žádané kancerostatické a imunostimulační vlastnosti.

Není ovšem ještě . s určitostí známo, zda účinná je samotná sloučenina nebo jej.í metabolit vzniklý v těle.

Nyní bylo rovněž zjištěno, že 1-karboxamido-2-kyanaziridin známý z patentního spisu NDR č. 110 492, je možno v bezvodých polárních organických rozpouštědlech, s výhodou v nižších alkoholech s 1 až 4 atomy uhlíku, za přídavku katalytických množství alkalických činidel, isomerizovat na shora uvedenou sloučeninu, která dobře krystaluje, v suché formě je stálá, dobře se však rozpouští ve . vodě, ve fyziologickém roztoku chloridu sodného ' a ve vodných roztocích hydroxidů alkalických kovů nebo· jiných bází.

Struktura nové sloučeniny není ještě definitivně jistá, fyzikálně-chemické výzkumy (analýza, hmotové spektrum, IC spektrum, NMR spektrum], kterým byla tato sloučenina podrobena, však ukazují na některou ze struktur popsaných shora uvedenými vzorci I až ' III. . Dobrá rozpustnost ve vodě, jakož i . bod rozkladu této látky, ležící nad 250 °C, poukazují na iontovou interakci a tím rovněž na tautomerní struktury I až III.

Přípravu · nové sloučeniny podle vynálezu ilustruje následující příklad provedení.

Příklad

4-Imino-l,3-diazabicyklo [ 3,1,0 ] hexan-2-on

1,1 g ' (10 mmol] l-karboxaimido-2-kyanaziridinu . .se rozpustí v 5 ml bezvodého methanolu a k roztoku se při teplotě 50 °C za vyloučení vlhkosti přikape 56 mg (1 mmol] hydroxidu . draselného v 5 ml bezvodého methanolu. Během několika málo minut se vysráží . 0,66 g (6 mmol] 4-imino-l,3-diazabicyklof 3,1,0]hexan-2-onu, což odpovídá výtěžku 60 % teorie. Po překrystalování z bezvodého^{* 1} methanolu se získaná sloučenina rozkládá při teplotě nad 250 °C.

IC spektrum produktu .(KBrr-echnika) obsahuje dva široké pásy mezi 3300 až 2500 cm-¹ a 1800 až 1400 a^'1, a ostré pásy například při

1295 onr1,

1232 cm-1,

1178 cm-1, .

1013 cm-1,

922 cm1,

855 c^'1,

820 cm-1,

682 cm-1 _a

542 cm1.

Hmotové spektrum obsahuje signál pro molekulární iont při 111, jakož i signály ' při 110, 83, 68 a 41.

NMR spektrum (deuterodimethylformamid) obsahuje následující signály:

Chemický posun vůči Interakční kontetramethylsilanu v ppm stanty v H2

V [1] = 2,23 J (1,2) 0,5

V (2) = 2,51 J (1,3) 2,93

V (3) = 3,47 J (2,3) 5,27

Při elementární mikroanalýze byly získány následující hodnoty:

pro C4H5ON3 vypočteno:

43,24 % C, 4,53 . % H, 37,82 % N, nalezeno:

42,62. % ' C, 4,03 % H, 37,52 % N.

Farmakologické vlastnosti produktu podle vynálezu byly zjišťovány následovně:

1. Kancerostatické účinnost

Krysy (kmen Spragůe-Dawley) o· váze 80— —120 g, ve stáří 6 až 8 týdnů, se na šíji subkutánně inokulují nádorovými buňkami. Používá se vždy 0,1 ml vodné suspenze obsahující cca 106 nádorových · buněk Walkerova sarkomu 256 (pevný, krysa).

4-Imino-l,3-diazabicyklo[ 3,1,0' ] hexan-2-on se rozpustí ve fyziologickém roztoku chloridu sodného (vždy požadované množství účinné látky v 5 ml roztoku na kilogram · tělesné hmotnosti pokusného zvířete). Připravené roztoky se pak za 6 hodin po . inkulaci podají zvířatům intravenózně nebo orálně za pomoci polykací sondy. Kontrolní zvířata dostanou 5 ml/kg tělesné hmotnosti fyziologického roztoku chloridu sodného. Pro . každý pokus se použije 20 pokusných a 20 kontrolních zvířat. Po 10 dnech se zvířata usmrtí etherem, nádory se vyjmou a hmotnost nádorů u kontrolní skupiny. zvířat se porovná s hmotností nádorů u zvířat pokusných.

Z následující tabulky 1 vyplývá, že růst nádorů je při intravenózním nebo orálním podání testované látky významně zbrzděn:

Tabulka 1

Inhibice růstu Walkerova sarkomu 256 po jednorázové aplikaci 4-imlno-l,3-diazabicyklo[3,l,0]hexan-2-onu krysám (Sprague-Dawley)

Způsob aplikace Dávka (mg/kg ) Inhibice v %

intravenózní	0,1	7,5
intravenózní	1,0	17,5
intravenózní	10,0	49,5
intravenózní	100,0	31,0
intravenózní	200,0	39,5
orální	5,0	20,0
'orální	125,0	62,0

2. · Imunostimulace ......

Osmi krysám (kmen Sprague-Dawley) · o průměrné váze 200 až 250 g se do ocasní tepny intravenózně· aplikuje účinná látka rozpuštěná v 5 ml fyziologického roztoku chloridu sodného. Jako kontrolní skupina slouží 8 krys ošetřených pouze 5 ml fyziologického roztoku chloridu sodného na kg tělesné hmotnosti. V následujících dnech se z ocasní tepny zvířete odebere 1 nebo 2 kapky krve a zjistí · se množství krevních tělísek. Ze zjištěných 8 hodnot u jednotlivých zvířat se statisticky vypočtou průměrné hodnoty.

Bylo zjištěno, že počet leukocytů silně vzrostl a zvýšil se rovněž procentický podíl lymfocytů. Teprve po 20 až 25 dnech se opět dosáhlo hodnot kontrolní skupiny zvířat. Počet erytrocytů se naproti tomu v průběhu celého pokusu nijak významně neměnil. Výsledky pokusu zjištěné třetí den, odpovídající zhruba maximálnímu zvýšení, jsou shrnuty do následující tabulky · 2:

Tabulka 2

Zvýšení počtu leukocytů po jednorázovém intravenózním podání 4-imino-l,3-diazabicyklo[3,1,0]hexan-2-onu krysám (Sprague-Dawley) 3. den po aplikaci mg účinné látky/kg Počet leukohmotnosti krysy cytů/mm* mg účinné látky/kg hmotnosti krysy

Počet leukocytů/mm³ ' 2

150

400

300

800

800

300

800

800

000

500

Dále se postupem, který popsal Jerne (Jerne · a spol., Science 140, 1963, str. 405), zjistí počet slezinných buněk tvořících protilátky.

' samečků bílých myší o hmotnosti 20 až 25 g se imunizuje vždy 1 ml konzervovaných ovčích erytrocytů (1 ml obsahuje 5X X108 erythrocytů). Téhož dne se pak myším, intravenózně aplikuje 4-imino-l,3-diazabicyklo[3,l,0]hexan-2-on, popřípadě srovnávací účinná látka, rozpuštěná v 5 ml fyziologického roztoku chloridu sodného/kg· tělesné hmotnosti zvířete. Jako kontrolní skupina slouží 20 zvířat rovněž imunizovaných 1 ml ovčích erythrocytů a ošetřených 5 ml/kg fyziologického· roztoku chloridu · sodného. · Za tři dny po aplikaci se sleziny zvířat sterilně vyjmou a technikou, kterou popsal Jerne, se zjistí počet slezinných buněk tvořících protilátky. Z jednotlivých hodnot se pak vypočítá průměr. Dosažené výsledky · jsou uvedeny · v následující tabulce 3:

7 300

Tabulka 3

Průměrné hodnoty slezinných buněk tvořících protilátky po intravenózním podání různých účinných látek

Účinná látka Dávka (mg/kg) Počet slezinných Hodnota v % konbuněk trolní skupiny

kontrola	-__________	4 600	100
4-imino-l,3-diazabicyklo-
[ 3,1,0 ]hexan-2-on	2,5	23 000	500
fytohemaglutinin	500,0	1400	30
cyklofosfamid	125,0	460	10

198

Z ' výše uvedených pokusů je možno odvodit, že k dosažení požadovaného farmakologického efektu imunostimulace je potřebná dávka cca 1 až 50 mg/kg tělesné hmotnosti, kteroužto dávku je možno aplikovat buď jednorázově nebo v několika dílčích dávkách. Protože tento účinek pozvolna odezní zhruba po 2 týdnech, může být popřípadě zapotřebí ošetření opakovat.

Pro jednorázové intravenózní podání byly zjištěny následující hodnoty akutní toxicity: LD50 660, mg/kg u krys a 750 mg/kg u myší. Hodnota' LDso při orálním podání myším je vyšší než 4,0 g/kg.

K přípravě farmaceutických preparátů se 4-imino-l,3-dlazabicyklo[3,l,0]hexan-2-on, popřípadě jeho farmakologicky' snášitelné soli, o ' sobě známým způsobem mísí s vhodnými farmaceutickými nosnými látkami a upravují se například na tablety nebo dražé, nebo se za přídavku vhodných pomocných látek suspendují nebo rozpouštějí ve vodě či oleji, jako například v olivovém oleji, a plní se do zasouvacích , kapslí. Protože účinná látka je nestálá v kyselém prostředí, opatřují , se preparáty povlakem rozpustným teprve v alkalickém prostředí tenkého stře95 va nebo se k , nim přimíchává vhodná, nosná látka, například vyšší mastná kyselina nebo karboxymethylcelulóza. Pevnými nosnými látkami jsou například škroby, laktóza, mannit, methylcelulóza, mastek, vysocedisperzní kyselina křemičitá, vysokomolekulární mastné kyseliny (jako kyselina stearová), želatina, ' agar-agar, fosforečnan vápenatý, stearát hořečnatý, zvířecí ' a rostlinné tuky a pevné vysokomolektilární polymery (jako ' polyethylenglykoly). Preparáty vhodné k orální aplikaci mohou popřípadě obsahovat chuťové přísady a sladidla.

Účinná látka podle vynálezu se však ' s výhodou aplikuje injekčně. Jako prostředí pro přípravu injekcí přichází v úvahu s výhodou voda, která může obsahovat přísady obvyklé u injekčních roztoků, jako stabilizátory, látky usnadňující rozpouštění nebo slabě alkalické pufry. Takovýmito přísadami jsou například fosforečnanové nebo uhličitanové . pufry, komplexůtvorná ' činidla (jako ethylendiamintetraoctová kyselina a její ' netoxické soli), jakož i vysoko^(^]^(^l^)^!^<ární polymery (jako kapalný polyethylenoxid) k regulaci ·. viskozity.

Claims (1)

1. FŘED.MĚT

   Způsob výroby 4-imino-l,3-diazábicyklo[3,l,0]hexan-2-onu, vyznačující se tím, že se l-karboxamido-2-kyanaziridin isomerizuje v

   VYNALEZU polárních bezvodých rozpouštědlech za přídavku katalytického množství alkalického ' činidla.