CS197288B2 - Process for preparing aminoderivatives of sugar - Google Patents

Process for preparing aminoderivatives of sugar Download PDF

Info

Publication number
CS197288B2
CS197288B2 CS215177A CS215177A CS197288B2 CS 197288 B2 CS197288 B2 CS 197288B2 CS 215177 A CS215177 A CS 215177A CS 215177 A CS215177 A CS 215177A CS 197288 B2 CS197288 B2 CS 197288B2
Authority
CS
Czechoslovakia
Prior art keywords
glucose
sucrose
minutes
sie
compound
Prior art date
Application number
CS215177A
Other languages
English (en)
Inventor
Werner Frommer
Bodo Junge
Uwe Keup
Lutz Mueller
Walter Puls
Delf Schmidt
Original Assignee
Bayer Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE2614393A external-priority patent/DE2614393C3/de
Application filed by Bayer Ag filed Critical Bayer Ag
Publication of CS197288B2 publication Critical patent/CS197288B2/cs

Links

Landscapes

  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Seasonings (AREA)

Description

Vynález se týká způsobu výroby nových aurnocukrových derivátů. Dále se zde poukazuje na farmaceutické směsi, které obsahují tyto am‘nocukrové deriváty jako účinné látky, stejně jako na řízení výměny uhlohydrátů u lidí a zvířat potlačováním glykosid-hydroláz pomocí těchto aminocukrů, jako například pro ošetřování Diabetes, otylosti a zvýšeného množství tuku v krvi.
Je známo, že řada mikroorganismů třídy
Aktinomycet potlačuje tvorbu glykos:d-hydroláz, přičemž se vždy podle podmínek při pěstování získávají inhib ' tory s - účinkem -potlačujícím převážně amylázu nebo sacharázu (viz například americké patentové - spisy 3 876 766, 3 855 066 a 3 879 546).
Nyní byl objeven způsob výroby nových aminocukrových derivátů obecného - vzorce I
kde ni znamená číslo 1 až 7 a nz znamená číslo 1 až 7, přičemž součet ni a na má hodnotu 2 až 8.
Vždy podle hodnoty součtu ni-j-nz mají tyto aminocukrové deriváty převážně účinek potlačující působení amylázy nebo sacharázy. Tak aminocukrové deriváty, které směřují k potlačování - působení amylázy - jseu deriváty ' s ni-|-n2 = 4 až ' 8, zvláště s . ni---.ni = = 4 a 5. Aminocukrové deriváty, - - - které - směřují k potlačování působení sacharázy jsou deriváty s ni--n.2=l až 3, účelně s ni-J-n?= =- 2 až 3 a s výhodou s nn = 2. . ;
Kromě -toho bylo objeveno, - že - se - s překvapením dosahuje - in - vivo - - silného - - potlačení odbourávání škrobů aminocukrovými deriváty s m4-n=l až 3, zvláště s ni = 2.
Způsob výroby aminocukrových derivátů podle vynálezu se provádí tím, že se kultivují kmeny SE 50 (ATCC 31 042), SB 18 [ATCC 31041), SE 82 (ATCC 31045), SE 50/ /13 (ATCC 31 043) a SE 50/110 (ATCC 31 044) rodu Actinoplanaceae aerob v pevném nebo tekutém živném prostředí, které obsahuje zdroj, uhlíku a dusíku, stejně jako soli a prostředek zabraňující pěnění, při teplotě 15 až 45 °C a pH 5,0 až 8,5 a požadované sloučeniny se o sobě známým způsobem izolují.
V úvahu pro výrobu aminocukrových derivátů podle vynálezu tedy přicházejí kmeny SE 50 (ATCC 31 042, CBS 961.70), SB 18 (ATCC 31041, CBS 957.70) a SE 82 (ATCC 31 045, CBS 615.71), stejně jako mutanty nebo varianty těchto kmenů. Zvláště dobře se přitom- -osvědčují —s ohledem -na výtěžek získaných aminocukrových derivátů kmeny SE 50/13 (ATCC 31 043, CBS 614.71) a SE 50/110 (ATCC 31 044, CBS 674.73). Oba kmeny odpovídají svým popisem co nejvíce původnímu kmeni SE 50 (ATCC 31 042, CBS 971.60), ze kterého byly získány přirozenou selekcí bez vyvolávání ' změn.
Pro. , pěstování - mikroorganismů . se používají pevné nebo tekuté, zvláště však tekuté, vodné živné půdy, které obsahují v obvyklé koncentraci známé výchozí látky pro uhlík -a dusík, soli a prostředky zabraňující pěnění v běžné koncentraci.
Jako výchozí látky pro uhlík slouží převážně uhlohydráty, zvláště škroby, maltóza, glukóza, stejně jako komplexní směsi látek, jako například běžně komerčně dostupný sladový extrakt.
Jako výchozí látky pro dusík přicházejí v úvahu o sobě známé komplexní směsi látek, jako například kaseinový hydrolyzát, kvasnicový extrakt, pepton, rybí moučka, masový extrakt, dále také směsi těchto výchozích látek, stejně jako jednotlivé aminokyseliny a/nebo amoniové soli jako zdroje dusíku.
Pěstování mikroorganismů se provádí aerobně v provzdušňovaných třepaných kulturách nebo v obvyklých nádobách pro kultury.
Druh koncentrace uhlíkaté látky používané jako výchozí látka ovlivňuje ve spojitosti s kmenem používaným pro fermentaci druh převážně vznikajícího konečného produktu.
Tak například v živných roztocích, které obsahují 2 hmotnostní % škrobů, tvoří se především sloučenina s ni — n2 = 4 až 8. Pro výrobu těchto aminocukrových dezivátů s ni — m = 4 až 8 je zvláště vhodný kmen SE 50/13 (CBS 614.71).
Pokud živný roztok obsahuje dostatek glukózy (asi 3,5 hmotnostního %) postačí však již 0,1 až 3 hmotnostní % škrobů, aby se získaly převážně směsi aminocukrových derivátů s ni -j- n2 = 4 až 8. Všechny takto získané aminocukrové deriváty se mohou používat jako výchozí sloučeniny pro výrobu nižších homologů postupem spočívajícím v chemické nebo enzymatické hydrolýze.
Aminocukrové deriváty s ni -J ns = 1 až 4 se v převážném měřítku získají, když se pracuje v živném roztoku prostém škrobu. Zvláště příznivě přitom působí přídavek maltózy k živnému roztoku. Tak se získají například při přidání maltčzy a za použití kmene SE 50 (CBS 961.70) směsi amniocukrových derivátů s převážně ni -j- n2 = 2 -až 3. Tvorby aminocukrů s ni = 1 se zvláště dosahuje tím, že se jako výchozího materiálu pro uhlík použije pouze glukózy. Zde je třeba dát pozor na to, že při přebytku glukózy při déletrvající fermentaci vznikají také vysokomolekulární aminocukrové deriváty.
Pokud se použije živný roztok, který neobsahuje glukózu a k němu se jako výhradní výchozí látka pro uhlík přidá maltóza, —získá se převážně aminocukr s ni -|- nz = 2. V technicky výhodné formě provedení se může přitom č'stá maltóza nahradit levnějším produktem, jako například malzinem, to je přírodním komerčně dostupným sladovým extraktem.
Jako zvláště vhodný pro výrobu aminocukkrových derivátů, které převážně obsahují _ deriváty s ni, — nz = 1 až 3, se osvědčil kmen SE 50/ÍlO (CBS 674.73).
Tento kmen poskytuje výtěžky nízkomolekulárních aminocukrových derivátů, které . jsou asi dvojnásobné, než jaké se získají s kmenem SE 50/13 (CBS 614.71).
Pěstování mikroorgan/smů se provádí obecně při inkubačních teplotách mezi 15 a 45 °C, s výhodou mezi 24 a 32 °C. Při použití kmenů SE 50 (CBS 961.70) nebo SE 50/13 (CBS 614.71) se tak získají aminocukrové deriváty s ni -j- Π2 = 4' až 8 při vyšší teplotě, například 28 °C, zatímco při nižší teplotě, například 24 °C, příkladně kmeny SE 50 (CBS 961.70) a SE 50/110 (CBS 674.73) tvoří v převážném rozsahu aminocukrové de_riváty s ni + n2- = 1 až 3.
Doba pěstování obecně činí 1 až 8 dnů, s výhodou 2 až 6 dnů. Delší doba pěstování, zvláště v souvislosti s přebytkem uhlohydrátů v živném prostředí podporuje tvorbu aminocukrových derivátů s vyššími hodnotami ni -j- nz.
Hodnota pH v prostředí kultury se mění obecně od 5,0 do 8,5, přečemž hodnoty pH 6,0 až 7,0 jsou výhodné.
Konec fermentace se určuje obecně -stanovením potlačovacího účinku v enzymatickém inhibičním testu, stejně jako stanovení složení fermentačního prostředí chromatografií na tenké vrstvě.
Oddělování a izolace jednotlivých aminocukrových derivátů podle vynálezu vychází bud z mikrobiologických kultivačních bujónů nebo z hydrolyzátů, popřípadě inkubačních směsí, ve kterých se provede enzymatické a/nebo mikrobiologické odbourávání vysolí(^im^ll^l^i^O^árních aminocukrových derivátů.
Zpracování se provádí různými způsoby vždy podle hodnoty pro ш Ц- nz. Tak se postupuje při výrobě čistých aminocukrových derivátů s ni + пг = 1 až 4 obecně tím způsobem, že se popřípadě po předchozím oddělení mycel příslušný kultivační bujón nebo hydrolyzát zpracuje s aktivním uhlím při neutrálním pH a potom se aminocukrové deriváty vázané na aktivním uhlí desorbují zpracováním aktivního uhlí s vodným alkoholem nebo acetonem, s výhodou s 50 až 80 °/o acetonem. Zvláště kvantitativně desorpce se přitom odpaří při hodnotě pH v kyselém rozmezí 1,5 až 4, s výhodou 2 až 3.
V případě, že oddělené kultivační bujóny , nebo hydrolyzáty jsou velmi tmavě zbarvené, ukazuje se jako výhodné, aby se před shora popsaným zpracováním s aktivním uhlím při kyselé pH nejprve zpracovaly s aktivním uhlím nebo absorpčními pryskyřicemi, jako komerčně dostupným Laxapolem Ca 9221 (zrnění 0,35 mm, výrobce firma Bayer AG) při hodnotě pH 2 až 6, s výhodou 2 až 3 a tak se dosáhlo odbarvení. Aktivní uhlí váže přitom v kyselé oblasti s výhodou pouze barvivo a nikoli aminocukrové deriváty.
Oddělování jednotlivých aminocukrových derivátů podle vynálezu z de9orbátu aktivního uhlí získaného jak shora popsáno se potom. provádí obecně tím způsobem, že se tento desorbát vede přes o sobě známý kyselý katex, jako například Dowex 50 W (vyrábí firma Dow Chemicals) (pH 1 až 8 s výhodou 2 až 4; při nižší iontové síle odpovídající vodivost <10 mS.cnr1, s výhodou <2 mS.cnr1]. Jednotlivé aminocukrové deriváty se přitom váží na katex. Na takové katexy lze vázat zvláště výhodně přitom aminocukrové deriváty z acetonového roztoku (50 až 80% acetonu, pH 1 až 5, s výhodou 2 až 4).
Selektivní desorpce aminocukrových derivátů podle vynálezu z katexů se potom provádí obecně za použití vodných kyselin nebo bází jako elučriích činidel, přičemž se s výhodou používá amoniaku nebo kyseliny chlorovodíkové o koncentracích 0,01 až 1 val/ /litr.
Z jednotlivých desorbátů se potom příslušný aminocukrový derivát dostane poi neutralizaci desorbátů slabě kyselým nebo bazickým ionexern nebo po odstranění báze, popřípadě kyseliny ve vakuu, v případě těkavých bází nebo kyselin, po odpaření roztoku lyofilizací nebo vysrážením organickými rozpouštědly, s výhodou acetonem.
Dále jo možné nízkomolekulární aminocukrové deriváty odvozené od inertních sacharidů oddělovat chromatografií na ionexu na bázi celulčzy, s výhodou na bázi fosfor -celulózy (vyrábí firma Serva, Heidelberg). Jako eluční činidlo se přitom používají pufry, s výhodou fosfátový pufr, o malé iontové síle s výhodou 2 až 100 mM, zvláště 5 až 10 mM, v rozmezí pH 2,5 až 8, s výhodou 5 až 6. Předpokladem pro účinné frakcionování je přitom pokud možno nepatrný obsah so- li v přípravcích určených к frakcionování, jejichž barevné látky méně ruší.
К výrobě čistých jednotlivých aminocukrových derivátů se chromatografují potom předčištěné preparáty přes vhodné molekulární síto, například gel Bio-Gel P-2 (vyrábí firma Bio-Rad, Mnichov), a frakce eluátu se podrobí chromatografií na tenké vrstvě. Frakce, které obsahují čisté sloučeniny podle vynálezu se spojí, opět chromatografují a potom po odpaření lyofilizují nebo pomocí organického rozpouštědla sráží, jako je popsáno shora.
Všechny aminocukrové deriváty se vyznačují tím, že při kyselé totální hydrolýze tvoří „složku I“ vzorce C13H21O7N, stejně jako glukózu. Pro „složku strukturní
I“ byl odvozen tento vzorec:
(složka. LJ člen řady aminocukrových dePočáteční rivátů podle tohoto vynálezu má jednu glukozovou jednotku. Tato sloučenina je bezbarvá amorfní látka s dobrou rozpustností v.e vodě, dimethylformamidu, dimethylsulfox/du, methanolu a horkém ethanolu. Při chromatografii na tenké vrstvě za použití ethylacetátu, methanolu a vody v poměru 10:6:4 má tato sloučenina hodnotu Rř 0,46 (maltóza = 0,50 a glukóza = 0,65) na silikagelová fólii F 1500 [Schleicher a Schíill] a 0,47 (maltóza = 0,54 a glukóza = 0,66) na silikagelových deskách F 254 [Merck, Darmstadt].
Při použití postřikového činidla dusičnan stříbrný a hydroxid sodný se dostane hnědočerné vybarvení při teplotě místnosti nebo po nepatrném zahřívání.
Sloučenina se silyluje společně s D-glukózou jako standardy ve směsi z pyridinu (1), trimethylchlorsilanu (0,5) a N-methyl-trimcthylsilyltrifluoracetamidu (1) a potom se podrobí chromatografií ve skleněném sloupci dlouhém 1,8 m naplněném 3 % SE 30 silikonového elastomeru (Packard) na chromosorbu WAW.
Vstřikovací teplota a teplota detektoru činí 300 °C. Teplota pece je 220 °C, isotermně až do eluování a- a β-D-glukózových standardů. Potom se teplota zvyšuje rychlostí 15 °C za minutu až na 300 °C.
Používá se plamenový ionizační detektor, přičemž se zavádí dusík jako nosný plyn rychlostí 40 ml/minutu, vzduch jako spalný plyn rychlostí 80 ml/minutu a vodík rychlostí 20 ml/minutu. Sloučenina má retenční dobu 16 až 17 minut (α-D-gukóza = 3 minuty, β-D-glukóza = 4 minuty a sacharóza = 12 až 13 minut).
Odpařením methanolického roztoku získaný nekrystalizující vzorek sloučeniny se roz pustí ve vodě a stanoví se specifická optická rotace [a]D = +134,3°.
NMR spektrum v CD3OD při 220. MHz je znázorněno na ohr. 1 (první souřadnicová osa = δ ppm).
Převládající znaky NMR-spektra jsou uvedeny v tabulce 1.
Tabulka 1
v ppm Multiplicita Relativní intenzita
1,3 dublet, J =6,5 Hz 3 H
2,3 „triplet“, Ji a J2 8 až 10 Hz 1 H
3,15 „triplet“, Ji a J2 7 až 9 Hz 1 H
3,3-3,9 signály nejsou jenotlivě přiřaditelné 12 H
4,13 AB-systém, J = 12 Hz 2 H
4,48 a 1 dublet, J = 7 Hz ) 1 H
5,1 J 4,9 dublet, J = 2,5 Hz J singlet -L И 11 H
5,0 dublet, J = 2 až 3 Hz za deuterium vyměněné protony IH
5,8 (těžko rozeznatelné) dublet, J — 3 až 4 Hz 1 H
(těžko rozeznatelné) 33 H
Když se tato sloučenina nechá reagovat ve směsi acetanhydridu a pyridinu v poměru 1:1 při teplotě místnosti, získá se dekaacetylový derivát (molekulová hmotnost: 903). NMR-spektrum dekaacetylového derivátu je znázorněno na obr. 2.
Pokud se reakce provádí v ethylacetátu a acetanhydridu v poměru 1:1 s katalytickým množstvím kyseliny sírové, tak lze dokázat hmotovou spektroskopii vedle dekaacetylového derivátu také vznik undeacetylového derivátu (molekulová hmotnost: 945).
Hmotové spektrum dekaacetylového derivátu má molekulový pík při 903 (2,5 °/o relativní intenzita) a základní pík při 843. Důležité dílčí píky ve shora uvedeném rozsahu hmotového spektra jsou 844 (55 % relativní intenzita [dále г. I.))
784 (36 % r. I.),
783 (34% г. I.),
759 (34 % г. I.),
556 (36 % r. I.),
496 (37 % r. 1.) a
436 (29 % г. I.).
Methylace s CH3j/NaH v dimethylsulfoxídu podle Hakomoriho poskytuje jako hlavní produkt dekamethylový derivát a v malém množství také undekamethylový derivát.
Molekulové spektrum má molekulový pík při 623 (6,1 % relativní intenzita) a základní pík při 535. Druhý molekulový pík se pozoroval při 637 [0,% relativní intenzita).
Spektroskopická data a chemické vlastnosti ukazují, že sloučenina má strukturu vzorce Ha
OH OH CHt У-0 CHpM(l·
нон У-N \ )~0 OH
\^OH
CH-OH H OH OH H(+ (1/aJ
NMR-spektrum zvláště ukazuje, že sloučenině obecného vzorce Ha přísluší struktura O-/4,6-bisdesoxy-4- [ 1-S- (1,4,6/5) -4,5,6-tri hydroxy-3-hydroxymethylcyklohex-2-en-1-ylamino ] -a-D-glukopyranosyl/- (1—4) -D-glukopyranózy souhlasná se vzorcem lib
Následující člen rady (ш + П2 = 2) má celkové složení C25H43O18N a je dobře ve vodě rozpustný produkt. Při chromatografii na tenké vrstvě má hodnotu Rř 0,35 na silikagelové fólii F 1500 a 0,33 na silikagelových deskách F 254 při použití shora popsaných systémů.
Optická rotace ve vodě [a]D je -|-167 °/o.
NMR-spektrum v D2O při 220 MHz ukazuje obr. 3 a13C-NMR-spektrum obr. 4.
Methylace jako je popsaná shora poskytuje třináctkrát methylovanou sloučeninu a v malém množství také čtrnáctkrát methylovaný produkt.
Hmotové spektrum methylovanjého produktu má molekulový pík 827 (1,5 % relativní intenzita) a odpovídá sumárnímu vzorci C38H69NO18. Druhý molekulový pík s 0,1% relativní intenzitou je při 841.
Důležité dílčí píky jsou:
739 (27 % г. I.)
592 (3,7 % г. I.)
535 (30 % г. I.)
388 ( 9 % r. 1.)
386 (13 % г. I.)
284 (13 % г. I.)
187 (12 % г. I.)
171 (40 0/0 г. I.)
101 (34 % г. I.)
88 (25 % г. I.)
75 základní pík.
Z chemických a spektroskopických vlastností vyplývá, že sloučenina má strukturu vzorce lila:
přičemž tomuto druhému členu rady aminocukrových derivátů podle vynálezu přísluší struktur O-/4,6-bisdesoxy-4- [ 1S- (1,4,5,6/5)-4,5,6-trihydroxy-3-hydroxymethylcyklo hex-2-en-l-ylamino]-a-D-gylkopyranosyl/- (l->4) -O-a-D-glukopyranosy 1- (l->4) -D-glukopyranózy souhlasí se vzorcem Illb
Nejbližší vyšší člen rady (ni -j- П2 = 3) se dostane ve dvou isomerníéh formách, přičemž jedna z obou isomerních forem vniká převážně.
Při kyselé částečné hydrolýze se mohou obě isomerní sloučeniny štěpit na první člen řady (m + иг = 1) a glukózu v molárním poměru 1:2.
Produkt přítomný v menším množství je sloučenina O74,6-bisdesoxy-4-[l S-(l,4,6/S)-4,5,6-trihydroxy-3-hydroxymethylcyklohex-2-en-l-y lamino ]-a-D-glukopyranosyl/- (1-4) -O-a-D-glukopyranosyl- (1-4) O-a-D-glukopyranosyl- (1-4)-D-glukopyranóza souhlasící se vzorcem IV:
197268 но гноон
О ZE
Isomerní produkt přítomný ve větším množství : je sloučenina O-/4,6-bisclesoxy-4-[:L S- (1,4,6/5) [4,5,6-trihydroxy-3-hydroxymethyl[ -4-O--a-D-glukopyranosy 1- (l-4) -cyklo14 hex-2-en-l-ylammo]-a-D-glukopyranosyl/- (L->4) -Oxa-D-glukopyranosyl- (4^4) -D-glukopyranóza souhlasící se vzorcem V
О α:
1S
Tyto isomery mají na deskách F 1500 za použití n-butanolu, ethanolu a vody v poměru 50:30:20 hodnotu Rgiukoza 0,41 až 0,46. Přítomnost isomerů se strukturou vyznačenou vzorcem V lze dokázat, když se produkt hydrogenačního odbourávání (paládium na aktivním uhlí) analyzuje. Patří těmto produktům odbourávání: 3-hydroxymehyl-4,5,6-trihy droxy- [ 4-Cba-D-glukopyranosyl- (1) ] -cyklohexan, O-(4-amino-4,6-bisdesoxy-a-D-gluko16 pyranosyl )-(1-+4)) -O-^-D-glukopyranosyl-(l-+4)-D-glukopyranóza a glukóza.
Protože při tomto odbourávání C—N-vazba v alkylové poloze se štěpí a hydrogenuje vodíkem je jasné, že tato sloučenina, která je vzhledem ke sloučenině vzorce IV isomerní, se přemění na sloučeninu vzorce III a nebo vzorce Illb, je však přítomna další glukopyranosylová skupina v poloze 4 cyklohexenového kruhu.
PdíCJH^
CH.OH CH.OH γ-ο но-< У-оч >
+ HZN \)~O\ /°\ / ( но он он OH OH он он он OH OH
Přítomnost isomerů struktury vyznačené ve vzorci IV lze dokázat tvorbou validatolu a O- (4-amino-4,6-bisdesoxy-a-D-glukopyranosyh
- (T>4) -Cha-D-glukopyranosy 1- (l->4) -O-a-D-glukopyranosyl- (l->4) -D-gluko pyranózy.
: MOH ! сн3 снрн CHOH снрн %\ ·' Η Λ Г0. PA(C)H
HO-C\\N ohoh\ ohoh он он он он OH OH
он он он он он OH
Při dalších zkouškách se isomery s ni + П2 = 3 podle známých metod methyluj.í, hydrolyzují a redukují natriumborhydridem, acetylují a analyzují plynovou chromatografií. Zatímco sloučenina obecného vzorce IV poskytuje pouze 1,4,5-tri-O-acetyl-2,3,6-tri-O-mehyl-D-glucitol, poskytuje sloučenina obecného vzorce V 1,4,5-tri-O-acetyl-2,3,6-tri-O-methyl-D-glucitol a 1,5-di-Oacetyl-2,3,4,6-tetra-O-methyl-D-glucitol v molárním poměru 2:1. Isomery s ni + П2 = 3 vzorce IV a vzorce V se nedegradují β-amylázou.
Isomerní sloučeniny vzorců IV а V se oddělují chromatografií na kyselé iontoměničové pryskyřici s 0,025 N kyselinou chlorovodíkovou, jako elučním činidlem.
Produkt s ni + П2 = 4 se hydrogenuje na paládiu na uhlí, jako katalyzátoru. Ne bazjcký produkt hydrogenolýzy se oddělí přes kyselý ionex a rozdělí preparativní chromatografií na tenké vrstvě. Po acylaci se identifkují hmotovou spektrometrií tyto dva pseudotrisacharidy jako hlavní produkty odbourávání:
HO OH OH OH OH OH (jako dekaacetát s molekulovým pikem při m/e = 906) a
МО
Vyšší členové řady, kteří obsahují 4 až 8 glukózových jednotek o molekulové hmotnosti 969 až 1617 nemohou tolik potlačovat působení sacharózy.
Chromatografie na tenké vrstvě při použití n-butanolu, ethanolu a vody v poměru 50:30:20 poskytuje na silikagelových deskách F 1500 hodnotu RglukoZa:
(jako nonaacetát s molekulovým pikem pří m/e = 848).
Značně převládající hlavní součást složky 5 je tudíž isomer odpovídající vzorci VI s glukosidicky na cyklitolovém zbytku vázanou maltózovou jednotkou.
Tato struktura je také jako výsledkem odbourávání s β-amylázou, při kterém převážná část složky s ni + П2 = 4 se degraduje na sloučeninu vzorce III a maltózu.
Složka s ni + nz = 5 se chová při odbourávání s β-amylázou takto:
Přibližně 90% se degraduje na sloučeninu vzorce V a odpovídající množství na maltózu, z čehož vyplývá, že isomerní maltózová jednotka vázaná glykosidicky na cyklitolový zbytek je hlavní složkou produktu; asi 10 % se β-amylázou nedegraduje.
0,30 až 0,34
0,21 až 0,23
0,14 až 0,16
0,09 až 0,11 glukózové jednotky, glukózových jednotek, glukózových jednotek a glukózových jednotek.
Jako u nižších členů této řady poskytuje totální kyselá hydrolýza, ,,složku I“ a glukózu a navzájem odlišných molárních poměrech, totiž 1:4, 1:5, 1:6, 1:7 a 1:8 (přičemž procentuální obsah glukózy je 74,4 %, 79,7 %,
83,3 %, 86,5 % a 89,1 %).
Při chromatografíi na tenké vrstvě při použití silikagelových desek F 1500 s n-butanolem, ethanolem a vodou v poměru 45:35: :20, jako rozpouštědla se pozorují při trojnásobném vyvíjení tyto hodnoty Rf:
Poměr standard Hodnota Rf glukóza:složka I
glukóza 0,77
maltóza 0,65
maltotrióza 0,51
maltotetraóza 0,39
maltopentaóza 0,27
4:1 0,25
maltohexaóza 0,21
5:1 0,18
maltoheptaóza 0,15
6:1 0,13
maltooktaóza 0,11
7:1 0,09
8:1 0,07
Při shora popsané katalytické hydrogenaci se rovněž ukazuje, že jednotlivé, avšak nikoli všechny glukózové jednotky těchto vyšších členů jsou v poloze 4 cyklohexenové skupiny.
Protože tyto sloučeniny obsahují lineární oligoglukosidové řetězce s vazbou 1-4, mohou být používány jako substráty pro určitá enzymatická odbourávání uhlohydrátů. Rozsah enzymů je zřejmě omezen na takové enzymy, které se v podstatě nepotlačují těmito sloučeninami.
Bakteriální α-amylázy a α-amylázy druhu hub se mohou používat к odbourávání oligoglukosidového řetězce, který obsahuje 3 ne- , bo více glukosidové jednotky na nízkomolekulární sloučeniny ,a inertní sacharidové fragmenty, jako například maltózu a maltotriózu. Tento způsob odbourávání je použitelný u sloučenin s ш + иг ? 3 a představu je další důkaz pro a, 1-4 vazbu. Sloučeniny podle vynálezu se 4 až 7 glukosidovými jednotkami jsou částečně odbouratelné /3-amylázou. Protože β-amyláza odštěpuje maltózové jednotky od neredukovatelného konce glukózového řetězce s a, 1-4 vazbami, poskytuje pečlivá analýza produktu /3-amylázového odbourávání cenné informace o každém z oligoglukosidových substituentů vázaných v poloze 4 cyklohexenového kruhu, zvláště podle své délky řetězce a počtu „glukóz“ v řetězci vázaných na bisdesoxyglukóze, to znamená na redukovatelném konci sloučeniny. Sloučeniny obsahující 4,5,6,7 nebo 8 glukózových jednotek nelze však zcela odbourat ^-amylázou. Odolnost části sloučenin je nutno zřejmě připsat strukturním podmínkám pro napadení β-amylázou.
Výsledky β-amylázového odbourávání se mohou takto shrnout:
197288 20 Odstranění maltózové jednotky
19 Počet glukózových jednotek ve · výchozím materiálu Počet glukózových jednotek v · produktu odbourávání
4 4 0
2 1
5 5 0
3 : 1
6 6 0
4 1
2 2
7 7 0
5 1
3 2
8 8 0
6 1
4 2
2 3
Popřípadě se část výchozího materiálu opět získává.
S ohledem na /'-arnylolyttcké odbourávání je zapotřebí ještě jednou zdůraznit, že /3-.amyláza umožňuje odstranit pouze maltózové jednotky a to pouze z neredukovatelného konce oligosacharidů. Je nutno se vyvarovat domněnky, že kterákoli teorie vede k nějakému omezení. Ačkoli přesná struktura těchto· vyšších sloučenin není zcela osvětlena je podle shora uvedených zjištění nutno vyvodit, že sloučeninám se 4, 5, 6, 7 a 8 glukózovými jednotkami přísluší deriváty nižších sloučenin vzorce lila, které obsahují řetězce se 2, 3, 4, 5 a 6 glukózovými jednotkami, které jsou navzájem spojeny a, l->4 vazbami, přičemž oligosacharidový řetězec v ά-konformaci je vázán s polohou 4 cyklohexenového kruhu.
Methylace sloučenin inethyljodidem a natriumhydridom v dimethylsulfoxidu, totální hydrolýza, příprava derivátů a konečně plynová chramatografická analýza poskytují
2,3,6-arímethylglukózový derivát, takže glukózové jednotky jsou nutně 1>4 vázány v připojené lineární struktuře.
Jeden ze dvou methylačních produktů, který v závislosti na methylační sloučenině je přítomen v různém měřítku nebo za určitých okolností vůbec není přítomen, · je 2,3,4,
6-tetramethylový derivát. Výskyt tohoto derivátu a jeho molární poměr k trimethylovému derivátu je závislý na substituentech vázaných na cyklohexenovém kruhu.
Je známo, že u zvířat a lidí po požití potravin a nápojů obsahujících uhlohydráty (například obilných a bramborových škrobů, ovoce, ovocných šťáv, piva, čokolády] dochází ke zvýšení množství cukru v krvi, které v důsledku rychlého odbourávání uhlohydrátů glykosid — hydrolázami (například amylázami ze slin a slinivky břišní, maltázy, sacharózy) probíhá podle ’ tohoto schématu:
amyláza škroby, popřípadě, glykogeny —---->
maltáza
--'-----► maltóza '----—>glókóza sacharáza sachaгóza----—> glukóza +
Tato hyperglykémie je u diabetiků zvláště silná a nepřetržitě se projevuje. U otylých jedmců způsobuje hyperglykemie v důsledku potravy často zvláště silné vylučování insulinu, ’ která z jedné strany vede ke zvýšené tvorbě tuku a. snížení · jeho odbourávání. Ve spojitosti s takovým zvýšením množství cukru v krvi dochází u . lidí s dobrou látkovou výměnou a u otylých · osob v důsledku vylučování insulinu často ke snížení hladmy cukru v krvi. Je známo, že jak hypoglykémie, tak také v žaludku přítomná kaše podporuje tvorbu žaludeční šťávy, která sama napomáhá nebo podporuje vznik zánětu žaludku, žaludečního vředu nebo zánětu dvanáctníku.
Nyní bylo· objeveno, že . aminocukrové deriváty · podle vynálezu značně snižují potravou vyvolanou hyperglykémii, hyperinsulinemii a hypoglykémii a zvláště také reaktivní po jídle vzniklé zvýšení množství cukru v krvi.
Dále je známo, že v ústní dutině se štěpí uhlohydráty, zvláště sacharóza působením mikroorganismů a tím se podporuje tvorba zubního kazu.
Aminocukrové deriváty podle vynálezu se mohou používat pro zamezení, popřípadě snížení takovýchto zubních kazů.
Amylázový test in vitro
Amylázová · inhibitorová jednotka (1 AIE] je definována jako množství inhibitoru, kte197288 ré potlačí dvě amylázové jednotky na 50 procent.
Amylázová jednotka (AE] je množství enzymu, které za jednu minutu za dále uvedených podmínek testování štěpí 1 ^ekvivalent glukosidických vazeb na škroby, ^val štěpltelných vazeb se kolorimetricky stanoví ' jako μνβΐ vytvořených redukovatelných cukrů s kyselinou dinitrosalicylovou a udává pomocí maltózové kalibrační křivky jako ^val ekvivalentů maltózy. Při provádění testu se 0,1 ml roztoku amylázy (20 až 22 AE/ml) smíchá s 0 až 10 pg inhibitoru nebo 0 až 20 μΐ testovaného roztoku v 0,4 ml - 0,02 M natriumglycerofosfátového pufru a 0,001 M chloridu vápenatého CaClž [pH 6,9] a asi 10 až 20 minut ekvilibruje na vodní lázni při 35 °C. Potom se 5 minut inkubuje s 0,5 ml 1% škrobového roztoku (rozpustný škrob čís. 1252 firmy Merek Darmastadt] zahřátého na 35 °C při 35 °C a potom se přidá 1 ml činidla na bázi kyseliny dinitrosalicylové (podle P. Bernfelda v Colowick-Kaplan, Meth. Enzymol., sv. - - 1, str. 149). Pro vyvinutí barviva se . násada zahřívá 5 minut na vroucí vodní lázni, potom ochladí a přidá 10 ml destilované vody. Extinkce při 540 nm se měří proti odpovídající určené slepé hodnotě bez amylázy. Pro vyhodnocení se odečte z předem sestrojené amylázové kalibrační křivky účinek amylázy ještě po přidání inhibitoru a z toho se vypočte procentuální potlačení nasazené amylázy. Procentuální potlačení se vyjadřuje jako funkce kvocientu μξ inhibitoru + *
AE + + ' kde + je vztaženo na suchou látku a ++ je v neinhibované násadě stejné série, bod 50'% potlačení _ se odečte z křivky a opět přepočítá na AIE/mg inhibitoru.
Sacharázový test in vitro
Sacharózová inhibitorová jednotka (1SIE) je definována jako množství inhibitoru, které potlačí dvě sacharózové jednotky na 50 %. Sacharózová jednotka (SE) je množství enzymu, které za jednu minutu za dále uvedených podmínek testování štěpí 1 μπιο·1 sachrózy na glukózu a fruktózu. Počet μΐηοΐύ vzniklé glukózy se stanovuje kvantitativně pomocí glukosoxidázové reakce za podmínek, při kterých již nedochází k dalšími štěpení ' sacharózy působením sacharázy. K provedení testu se 0,05 ml roztoku sacharázy1’ upraveného na 0,12 SE smíchá s 0 až 20 ^g inhibitoru nebo 0 až 20 μΐ roztoku určeného k testování a doplní s 0,1 M natriummaleinátovým pufrem [pH 6,0] na 0,1 ml. 10 minut se ekvilibruje při 35 °C a potom se přidá 0,1 ml
0,05 M ' roztoku sacharózy předem zahřátého na 35 °C v 0,1 M natriummaleinátovém pufru (pH 6,0). Inkubuje se 20 minut při 35 °C a reakce sacharázy se zastav přidáním 1 ml glukosoxidázového reakč ního- činidle^2' a inkubuje dalších 30 minut při 35 °C. Potom se přidá 1 ml 50% kyše líny sírové a při 545 nm měří proti odpo vídající slepé hodnotě. Pro vyhodnocení se vypočte procentuální potlačení působení použité sacharázy a z bodu 50·% potlače ní pomocí glukózové - kalibrační křivky vy počítá SIE/g, popřípadě SIE/litr.
1) Rozpustná sacharáza ze sliznice ten kého střeva vepře podle B. Borgstroma, A. Dahlquista, Acta Chem. Scand. 12, (1958) , str. 1997, s 0,1 natriummaleinátovým pufrem [pH 6,0], zředěno na odpovídající ob sah SE.
2) Glukosoxidázové reakční činidlo se vyrobí rozpuštěním 2 mg glukosoxidázy (firma Boehringer, stupeň čistoty I) ve 100 ml 0,565 M tris-HCl pufru [pH 7,0] a potom se přidá 1 ml roztoku detergentu (2 g tritonu X 100 + 8 g 95% ethanolu p. a,), 1 ml dianisidinového roztoku (260 mg dihydrochloridu o-dianisidinu ve 20 ml vody) a 0,5 ml 0,1% vodného roztoku peroxidázy (firma Boehringer, lyofilizát, stupně čistoty II).
Maltázový test
Maltázová inhibitorová jednotka (1MIE.) je definována jako množství inhibitoru, které potlačí dvě maltázové jednotky na 50 %. Maltázová jednotka (ME) je množství enzymu, které za jednu minutu za dále uvedených podmínek testování štěpí 1 μΐηοΐ maltózy na 2 μΐηοΐγ glukózy. Počet μΐηοΐύ vzniklé glukózy se stanovuje kvantitativně pomocí glukosoxidázové reakce za podmínek, při kterých již nedochází k dalšímu štěpení maltózy maltázou. K provedení testu se smíchá 0,05 ml maltázového roztoku1’ upraveného na 0,060 až 0,070 ME s 0 až 20 μ£ inhibitoru - nebo 0 až 20 - μΐ roztoku určeného k testování a doplní 0,1 M natriummaleinátovým pufrem[pH 6,0] na 0,1 ml. Ekvilibruje se 10 minut při 35 °C a potom se přidá 0,1 ml 0,05 M maltózového roztoku předem zahřátého na 35 °C v 0,1 M natriummaleinátovém pufru (pH 6,0]. Inkubuje se 20 minut při 35 °C a reakce maltázy ukončí přídavkem 1 ml glukosoxidázového reakčního činidla.2’ a inkubuje dalších 30 minut při 35 °C. Potom se přidá 1 ml 50% kyseliny sírové a při 545 nm měří proti odpovídající slepé hodnotě.
K vyhodnocení se vypočte procentuální potlačení působení - použité maltázy a z bodu 50% potlačení pomocí glukózové kalibrační křivky vypočítá MIE/g, popřípadě MIE/litr.
1) Rozpustná maltóza ze sliznice tenkého střeva vepře podle B. - Borgstroma, A. Dahl197288 quista, Acta Chem. Scand. 12, (1958) str. 1997, s 0,1 M natriummaleinátovým pufrem [pH 6,0], zředěno na odpovídající obsah ME.
2) Příprava glukosoxidázového reakčního činidla: j,ako je popsáno u sacharázového testu v poznámce 2).
Výsledky testu potlačujících účinek enzymů in vitro pro jednotlivé aminocukrové deriváty podle vynálezu jsou uvedeny v tabulce 2.
Tabulka 2
Vzorec Počet glukózových jednotek Potlačení účinku a-amylázy AIE/g Potlačení účinku sacharázy SIE/g Potlačení účinku maltázy MIE/g
II в 1 300 000 30 000 5 000
III в 2 300 000 68 000 15 000
v 3 1 400 000 21000 5 000
4 až 6 17 500 000 8 500 —
5 až 7 30 000 000 2 500 —
Jak je z tabulky zřejmé, silně stoupá účinek potlačování při pokusech in vitro proti pankreas-a-amyláze s přibývající molekulovou hmotností; tak vykazují sloučeniny s 5 až 7 glukózovými jednotkami stonásobně silnější potlačeni účinku enzymu in vitro než sloučenina s 1 nebo 2 jednotkami. Potlačení účinku sacharázy je nejsilnější u derivátu se dvěma jednotkami, derivát s 1 glukózovou jednotkou potlačuje již jen z polovice tak silně a vyšší člen má další pokles specifického účinku potlačení působení sacharázy.
In vivo probíhá účinnost potlačování působení sacharázy přibližně souběžně jako u specificky zjištěného účinku potlačování. Naproti tomu s překvapením bylo objeveno, že při testu škrobového zatěžkávání in vivo pro sloučeniny s 1, 2 nebo 3 glukózovými jednotkami v porovnání s potlačováním působení amylázy in vitro se zjistí desetkrát až čtyřicetkrát silnější účinek.
Pro dosažení hyperglykémie způsobené potravou a hyperinsulinemie dostávají skupiny vždy o 6 nenakrmených krysách:
a) 2,5 g sacharózy
b) 2,5 g maltózy nebo
c) 1 g vařeného škrobu per os ve. vodném roztoku nebo jako suspenze. Šest jiných krys obdrží jmenované uhlohydráty ve stejném množství a dodatečně inhibitor glukosid-hydrolázy v uvedeném dávkování.
Kromě toho 6 dalších krys dostane odpovídající množství roztoku soli.
Krevní glukóza a sérum inzulín se měří v krátkých časových intervalech v krvi z retroorbitální Venenplexus. Stanovení krevní glukózy se provádí v autoanalyzátoru (Technicon (§) podle Hoffmana: J. bíol. Chem. 120, 51 (1937) nebo enzymaticky s glukosoxidázou a o-dianisidinhydrochloridem), stanovení seruminsulinu se provádí metodou, kterou popsal Hales a Randle [Biochem. J. 88, 137 (1963)].
Výsledky potlačování působení sacharázy in vivo (zpracování sacharózy) u hladových krys uvádí následující tabulka 3:
co cd P Έ5 £3 cd H zd íti s o
CO
LÍD 'φ w>
s cd N Ό 4tí
Д , . o bočo
Й > Φ t-« w
Д
S
LCD cd > 'cd *
* * O ' rH CM CD r> CD CO LO tn oo oo o cd ld cd O? co tj Cl+I+I+I+I+I+I-H+I+I CO -- -- ------- . .
o
O CO
CO co
UOOO C OC
OM O
CM O
OÍ *
* *
OD ’d CD OD _ oo o CD rH cm irT oo rd t< CD rH χφ rH CD к CD 'Φ' tH * * *
‘ 'Φ O CD * * *
* oo * *
* in hs t> oo 03 * rH *
.. W rH
HO rHrH.._. — — +ΙΉ+Ι+Ι+Ι+ΙΉΉ+ΙΉ+Ι+Ν+Ι+Ι+Ι+Ι+Ι+Ι+Ι+Ι+Ι+ΙΉ
CD
CD <n'oo co
rd c 00 o Ό UD N tu CO C oo cu UL lu CM c MC M O Ό M O C3'CO
C LD OC M O co OC M OO O co M CO OO LO cn cO co O Ю co o ООЗ
t- tH rd rH rH r-L rd od rH rH rO cH cO rO
оз
LCD 00 00 «o
H 1Л N
CM rH 03 O) *
♦ *
N *
* oo * 00
CD O CM o
O co CM
CM 00 t>
UD rd CM o *
O O 00
_. * °o
LCD
CD oo co 03 oo oo
CD O
N LÍD N
CM O O 03 tH 00 CD M4 CM O O 00 * * * * * * t t Líd cd ud cd ts оз^ co^ rd cd Ф -Ф оз oo uo xF co rd оз Г< cm rd co -φ oo CM rd rd t< oo = Pravděpodobnost proti kontrolní skupině se sacharózou = <0,05 =-Pravděpodobnost proti kontrolní skupině se sacharózou = <0,01 = Pravděpodobnost proti kontrolní skupině se sacharózou= < 0,001 *
* ”Φ * ♦
*
I ’Φ rd rd * <Φ CM
CD ^rd
LíD rd , . _ ____, _ , . . _ _____....____ +Ι+Ι+Ι+Ι+Ι+Ι+Ι+Ι+Ι+Ι+Ι+Ι+ΙΉ+Ι+Ι+Ι+Ι+Ι+Ι+Ι+Ι+Η-Ι _------- , .— ----— . . — . -----co
К in rd o o £ д o 4tí
Ы ►—I co
CD
O rd
CD CM UD sin w w »—CO co
OO rd r-d N co UD cd
CM 00 rH CM 00 CD
CO oo lcd
O CD O O o
to oo
UD
К cm o o
CM CD
LÍD 03
O O rH
O O CM o
LÍD . . . , +++·!
o tn » O
4tí
CO lo CM
CO
O O cO ++
Ό
P o Λ
ЫЫ ·—< — CO CO
CO
O O rO m o ΝΠ +++..
cd г—4
O
S-<
P o Λ
HM
O— Co
Ы r-( CO
СЛ
Ы t—I ω co in o NC . . +++:
o LÍD o o 00 in К - .
+++
o Cti oti od od o Cd cd cd 'q od od od od - oti otJ cti cti Q Cti ord cd cti
V) N N N N CO N N N OO N N N N CO N N N N OO N N N N
Ό Ό Ό o Ό Ό Ό Ό Ό Ό Ό Ό Ό Ό Ό Ό Ό '□ Ό
i-M tn tn to to fo tn to to чи to t-l to K4 to to tn t-4 —c to to IH tn
Q oti od od od o od od od DJ cí cd od Ctí o cd a Cti Cti o cd Oti Cti Cti
4-» 43 43 Λ 43 4-> 43 P P •M P P P P UJ 4-1 43 P P 43 4-o P P P P
N CJ CJ CJ CJ N CJ CJ CJ N CJ CJ CJ CJ N CJ Ο CJ CJ N CJ CJ CJ CJ
O od od od od O od od od O od od od od O od od cti cti O oti od cd oa
tn CO CO CO co ÍH CO CO CO to CO CO OO CO to CO CO CO CO. to CO CO CO CO
P rH
CM CO co >N cd ’φ к
>N cd
LO
CJ
Φ o N >
ED50, zatímco jednotka potlačování působení sacharázy na každý mg klesá. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 4.
Jak je ze shora uvedených údajů zřejmé probíhá paralelně in vivo účinek potlačování působení sacharázy s in vitro nalezeným účinkem potlačování. Tak stoupá hodnota
Tabulka 4
Vzorec
Glukózové jednotky
Potlačení působení sacharázy in vitro in vivo (SIE/mg) (EDso mg/kg)
lib (1) 30 3,0
IIIb . (2) 68 0,21
v (3) 21 2,65
— (4 až 6) 8,5 -15,30
— (5 až 7) 2,5 -52,00
In vivo potlačení odbourávání škrobů působením sloučenin vzorců lib, IIIb а V je s překvapením mnohem vyšší než by se dalo očekávat na základě in vitro nalezených údajů pro potlačování působení amylázy a tedy neodpovídá očekávanému vzoru. V dále uvedené tabulce 5 uvádějí se jako shora zprůměrované údaje in vivo pro nenakrmené krysy po podání škrobů.
ω Ό O
β LM Ο β Ί5
Ο β τβ Φ >μ
4-»
CD α s ιη r
β β o
co
O
CM lO o cn co m
CM co
Ο rH
CO CM
Mf co co
CM rH in cm rH o
co
CM ο o
rH o bx
MCM μι rH
Mf co o co
Cd ο
LO oo co oo
CM ο
ι_ο со
* * * * * * *
* * * * * * * * * * *
* * * * * * * * * * * *
^..00 rH 00„ (N OD' rH CM. · O~ ^510 ♦ •—I OO' Mi, bx Ib <X b (X 0, 00^ UD
LO rH rH LO” LO LO” UĎ cc” cn” cd” in 00 rH rH co” co Mi” 00 rH co co” m” co” co co co
+1НННЧНН+1НЧ+Ж4Н+1НННН+1+Ж-Н+1+1+1Н-1-Н-Н-Н+1Н-1-Н OOinin(Or-HLnMti(DO>CMD(OCMCXCMa:CltbCDCMCOH:OLn bMMrHODCDDrHOQOOÍOJrHQbMMrHNbMrHDD Η H ri rH rH rH rH rH rH rH tH rH τ—iH H rH rH
LO * * * * 00 rH b>
* *
* „ ~ OO b OD rH ♦
* * CM in
LO OD rH *
*
CM
LO β
Η5 bO
S β Ν Ό 44 β β > ω í-l β
β
LO β 44 > 'β Q ο Ν Ό 44
I
4—1 O β T2
Φ 'Φ >
b
CJ Φ μι O N >
* * *. '· * ' ’ .*.
* ,τ ..
* *
b. LO_ _
OD** ML” LO” CD ' 0°· M” 00 LO' CO 1° 00 OD” cO to * r ... l. .· .··*·*· · *· rH rt b οο lO ιηιη σ>
. . „ . . .....CM +I+I+I+I+I+I+I+I+I+I+I+I+I+I+I+I+I+I+I+I+I+I+I+I+I+I — b ------ ‘ ---- -------------- ------CM rH LO
CO
Mi rH rH LO rH b
O Mi Mi CM co
CD
Ib CD
CO bx
CM LO
CM tH co
CM
Ib CO CO rH
CD CD co b oo CM 00 CO rH o
CD
Mi *
* * .
Mi OO CD CO *
* * LO *
* *
Mi *
*
OM CD CD OD OO л * аз *
*
- - - - - - . .. - О ?lΐ+l+l+l+l+l?líl+l+l+l+l-_l+l+l+l-_l+l+l+ Ι+Ι+Ι+Ι+Ι+Ι --------------- — -- _ ___ -_ — ------— o
CM rH
Ml co *
CD *
b^
00” bx” co CD cY O)' rH b> co
CO
CM
OD' X^
LO” 00 LO” 0° ' CM' ' L° * 00 * 0° * CO ' b”
CM CO 00 M<
oo
CM
CM ___ co rH OO rH
CM CO
O
CM
LO
O
Mi CD
CO co b LO b rH _M CD
CM co b co CD rH rH
CM co CD co CO b b rH o
MO)
Mi 00
LO O
CD rH O CD ~
V
II s CD 42
O μ >0D
CD CD >Φ β * * * b *
* *
CD *
* * ΟΟ * *
CM *
ο„ o (Od 0OO” M' o” 0DO”bHÍ * .
co но” 0 OO MÍ ' rH Mi” uTlo' Mf” rL M” oo” co Ж+H^LHLHLH^L|-HLH+|LH+Ι+I bx - --------------- - .
O rH *
CO * CO * CD qo o v
II s CD 42
O μ 44 >CD
CD
CD
ΧΦ β co
Q CO
4-|+Ι+Ι+Ι+Ι+Ι+Ι+Ι+Ι+Ι--|--|+Ι·
Mi Ю Ο co------------b co CO rH
CD
CO
O
O ю co cm о rH rH b o CD oo
CD
CM
W rH IQ.
CM 00 CD b
Ml LO
O0 bx
CO co
CM
CD rH LO O LO
CO O
CD CD o
CD
Mf b
LO LO
LO CD bx OO
Mi b
V
II s
CD
X O μ >сл φ ω >Φ
Β
.. а а з з ω
* *
* ιο *
*
Ο CO *
* CM CD *
.. ....... .. .. .. .Mi
CObbCOMibCMbOOrH bx CD LO co
LO „ OO » I+I+IWI+I-H+I+I+I+I+I+I
.. ------ . ~ O - b>
Mi Ib
O
CD
O 4—·
N O μ rH cm
O O
CO b CD oo
CO
LO CM 00 00
CD tb
O bx
CM LO
OO CO CD O0 b LO tb co β
Ο
Ο U >CD
W tó < <.2
O O
- LO 0 — +++
- “ X
Ο μ 44 )CD in b
42 Ο Ο μ μ 44 44 XD >cn ω
O 4·» Ν O μ β O 44
O μ >cn
CM
Λ! β 44
W
CD
I I
W <
o o o
Mi я
O
4-J
N O μ
I w < o o o OM rH β O μ Μ β O 44 β Ό μ 4-» β o 44 β
О μ 4-J β О 44
I—1 <
o o
OJ rH o
CD
O
Ή
O μ —
<
o o O
OO . . . , _|—|—[1
Λ ‘ O μ 44 >CD
W < O O
OD
W < <
O Q L0 O rH 00 _ .
++++
- - - 42
Ο μ
>0D
Ό μ •w β O 44
O μ
XD
42 Ο Ο μ μ 44 44 >cd хл
Ο μ
XD
W t—I <
O LO b . . - +++ * ~
Ο μ
XD < O o LO rH
O U
XD < o o .^4 o O • OD
O
N O (-4
Ό μ >0D co co >N β
ML
Ό μ w β o 44 τβ
С) μ Μ β Ο 44
X ο μ 44 XD
X Ο μ 44 >ω
Ο μ
XD
Ο μ 44 >cn < o o o o o g o o O OM Mi CO rH CM +++ X ‘ o μ хл
X Ο μ 44 XD
Ο μ
XD b
>Ν β
LO cn ο β X ο ΊΟ ο
(Λ Ο β X
Ο
Ί5
Ο
X
Se shora uvedených údajů je zřejmé, že zatímco se projevuje stupeň potlačování působení sacharázy jak in vitro, tak . také in vlvo · jako zřetelná funkce molekulová hmotnosti, potlačování působení amylázy in vitro závisí na molekulové hmotnosti, zatímco potlačování odbourávání škrobů in vivo neklesá s poklesem molekulové hmotnosti, nýbrž zůstává s překvapením konstantní.
Ačkoli tedy účinek potlačování působení amylázy in vivo klesá s molekulovou hmotností, jsou hodnoty EDso potlačování stravování škrobu v zažívacím' ústrojí pro všechny sloučeniny podle vynálezu v podstatě stejné. Tyto údaje jsou shrnuty v tabulce 6.
Tabulka 6
Vzorec Glukózové jednotky Potlačení působení á-amylázy in vitro AIE/mg Potlačení stravování škrobů v zažívacím ústrojí in vivo (EDso mg/kg)
lib (1) 300 0,76
illb (2) 300 1,60
V , (3) 1 400 1,61
= . '· (4 až 6) 17 500 ’ 1,42
= -' -· ' . (5 až 7) 30000 1,00
• S · překvapením · je . také možné se sloučeninami vzorců lib, illb a · V současně potlačovat působení sacharázy a stravování škrobů v zažívacím ústrojí a to při přesně předem předvídané a charakteristické dávce.
Sloučeniny · kromě toho mají výhodný účlnek s ohledem na absorpci glukózy. Toto je zřejmé z · údajů uvedených v tabulce 7 (pokusy s hladovými krysami) pro sloučeninu vzorce illb (ni = 2).
Tabulka 7
Dávka
Krevní glukóza v mg % (střední hodnota+odch.) minut 30 minut 45 minut roztok soli 72+4,6 glukóza (kontrola) 142+12 glukóza-j-30 mg 135+13 glukóza+6O mg 12!^:+^1^3*
78+1,3
142+12
128+5,5
118+2,9**
87+6,8
158+19
132+7,3
130+9,0 * = Pravděpodobnost proti kontrolní skupině s glukózou = 0,05 * = Pravděpodobnost proti kontrolní skupině s glukózou = 0,01
Čištění směsi vyšších členů této řady a použití v čisté formě vede neočekávaně k ještě vyššímu účinku a specifičnosti. To lze dokázat porovnáním údajů o potlačování pů sobení a-amylázy a sacharázy in vitro· uve děných v tabulce 2 a údajů uvedených v tabulce 8 pro čisté sloučeniny.
Počet glukózových jednotek
Tabulka 8
Potlačování působení 5-amylázy AiE/g
Potlačování působení sacharázy SiE/g
4 67 000 000 7000
5 57 000 000 3500
6 42 000 000 1200
7 24 000 000 60
8 5 000 000 10
Předchozí výsledky ukazují vysoký účinek sloučeniny se 4 glukózovými jednotkami jako inhibitoru působení α-amylázy. Také sloučeniny s 5 a 6 jednotkami mají podstatně vyšší · specifický účinek potlačování než jaký byl shledán u přípravků až dosud známých. Úbytek účinku potlačování nastává s přírůstkem molekulové hmotnosti, jako je zřejmé u sloučenin se 7 a 8 glukózovými jednotkami, ačkoli i tyto sloučeniny · mají ještě podstatný účinek potlačování. Při potlačování působení sacharózy in vitro je naopak zřejmá závislost na molekulové hmotnosti. Sloučenina se 4 glukózovými jednotkami má asi 1/10 specifického účinku, jaký má sloučenina se 2 glukózovými jednotkami, proti kterému je účinek potlačování u sloučeniny s 8 glukózovými jednotkami jen nepatrný. ·
Sloučem.ny se mohou používat bez ředění, například jako prášek nebo v želatinovém obalu nebo v kombinaci s nosičem ve farmaceutických směsích.
Farmaceutické přípravky mohou obsahovat větší nebo menší množství inhibitoru, například 0,1 až 99,5 % v kombinaci s farmaceuticky přijatelným netoxickým inertním nosičem, přičemž nosič může obsahovat alespoň jedno pevné, polopevné nebo' tekuté ředidlo, plnivo a/nebo netoxický inertní farmaceuticky snášenlivý pomocný prostředek pro formulaci. Takovéto farmaceutické přípravky jsou s výhodou ve formě dávkových jednotek, to znamená fyzikálně oddělených jednotek obsahujících stanovení množství inhibitoru, které odpovídají zlomku nebo' násobku dávky, jež je potřebná k dosažení požadovaného účinku ' potlačování. Dávkové jednotky mohou obsahovat 1, 2, - 3, 4 nebo více jednotlivých dávek nebo 1/2, 1/3 nebo 1/4 této jednotkové dávky. Jednotková dávka obsahuje s výhodou dostatečné množství účinné látky, aby se při její aplikaci podle předem stanoveného dávkovacího schématu dosáhlo jedné nebo několika dávkovými jednotkami požadovaného účinku potlačování, přičemž se podává celá, polovina, třetina nebo čtvrtina denní dávky obyčejně jednou, dvakrát, třikrát nebo čtyřikrát za den. Jiné terapeutické přípravky se mohou také používat. Ačkoli by se mělo v každém případě pečlivě uvážit dávkování a dávkovači schéma, při ' použití ' důkladných odborných úsudků a s ohledem na stáří, hmotnost a stav pacienta, druh a obtížnost onemocnění je dávkování obyčejně možné v rozmezí asi 30 až asi 3 . 105 AIE/kg a asi 1 až asi 1. 104 SIE/kg tělesné hmotnosti a den. V mnoha případech se přitom dosahuje dostačujícího terapeutického účinku s menší dávkou, zatímco v jiných případech je potřebná větší dávka.
Orální aplikace se provádí za použití pevných a tekutých dávkových jednotek, jako například prášků, tablet, dražé, kapslí, granulátů, suspenzí, roztoků a podobně.
Prášky se vyrábějí rozmělněním látky na vhodnou velikost a míšením s rovněž rozmělněným farmaceutickým nosičem. Ačkoli k tomuto účelu se normálně používají jedlé uhlohydráty, jako například škroby, laktóza, sacharóza nebo glukóza a také zde je možné je použít, Je žádoucí používat nemetabolizovatelné uhlohydráty, jako například deriváty celulózy.
Společně s nimi se mohou používat také sladiva, ochucovadla, konzervační prostředky, dispergovadla a barviva.
Kapsle se mohou vyrábět smísením shora popsané práškové směsi a plněním již do připravených želatinových obalů. K práškové směsi se mohou přidávat před plněním kluzné látky, jako' například křemelina, mastek, stearát hořečnatý, stearát vápenatý nebo pevné polyethylenglykoly. Směs může rovněž obsahovat látky napomáhající rozpadávání nebo pomocná rozpouštědla, jako například agar-agar, uhličitan vápenatý nebo uhličitan sodný, aby se při použití kapsle usnadnila dostupnost inhibitoru.
Zhotovování tablet se provádí například výrobou práškové směsi o hrubém nebo jemném zrnu a přidáním kluzné látky - a látky napomáhající rozpadávání. Z této směsi - se formují tablety. Prášková směs se získává smíšením látek, které se vhodným - způsobem rozmělnily a ' doplnily zřeďovadly nebo jinými nosnými látkami, jak bylo ' popsáno 'shora. Popřípadě se přidává - pojivo, například karboxymethylcelulóza, alginát, želatina nebo poJyvinylpyrrolidon, zpomalovač - rozpouštění, jako například parafin, ' urychlovač resorpce, jako například kvartérní sůl a/nebo adsorpční prostředek, jako například - bentonlt, kaolin nebo střední - fosforečnan vápenatý. Prášková - směs se může granulovat společně s pojivém, jako například sirupem, škrobovým mazem, akáciovým mazem nebo roztoky na bázi celulózových nebo polymerních materiálů. Potom se produkt - protlačí hrubým sítem. Podle jiné možnosti se může prášková směs nechat procházet tabletovacím strojem a získané nerovnoměrně formované kusy rozmělnit až na velikost zrna. Aby vzniklá zrna neuvázla v tabletovací trysce, může se přidávat kluzná látka, jako například kyselina stearová nebo její sůl, mastek nebo minerální olej. Tyto směsi s kluznými vlastnostmi se potom lisují do ' tablet. Účinná látka může být také spojena s volně tekoucími - inertními nosiči a přímo používána k výrobě tablet při vynechání granulačního a rozmělňovacího' stupně. Produkt se může opatřit čirým nebo opalescentním - ol chranným potahem, například potahem ze šelaku, z cukru nebo polymerních látek a potah se může vyleštit voskem. K povlaku se mohou přidávat barviva, aby se mohlo rozlišit mezi různými dávkovými jednotkami.
Formy pro orální podávání, jako například roztoky, sirupy nebo elixíry mohou být vyrobeny v dávkových jednotkách, tak že stanovené množství přípravku obsahuje - _ určené množství účinné látky. Sirup se může vyrábět tak, že se účinná látka rozpustí ve vodném roztoku, který obsahuje vhodné ochucovadlo, elixíry se vyrábějí za použití netoxických alkoholických nosičů. Suspenze - mohou představovat disperze sloučeniny v - netoxickém nosiči. Lze též přidávat pomocná rozpouštědla a - emulgátory, jako například ethoxylovaný isostearylalkohol a - polyoxyethylensorbitester, konzervační prostředky a přísady zlepšující chuť, jako je například peprmátoívá silice, sacharid a podobně.
Dávkovači předpisy - mohou být - také uvedeny pro kapsle. Dávkování může být mimo to zajištěno tak, že účinná látka se - - podává protrahovaně, například při zadržování účinné látky v polymerních substancích, voscích a podobně.
Toxicita těchto sloučenin je velmi malá. Také bez konečného čištění se například surový produkt z příkladu 8 s účinkem 26 000 SIE g snáší bez vedlejších účinků, když se aplikuje 340 000 SIE/kg u myší a krys perorálně. Také při intravenózní injekci snášejí myši 10 000 SIE/kg bez vedlejších účinků.
Farmaceutická . .přípravky podle vynálezu mohou obsahovat ' (ake . jiné farmaceuticky úč:nné sloučeniny, zvláště jiná orální antidiabetika, jako například β-cytotropní deriváty sulfonylmočoviny a biguanidiny snižující hladinu krevního cukru.
Kromě shora zmíněných farmaceutických přípravků lze dodatkově vyrábět také potraviny obsahující tyto účinné látky, například cukr, chléb, bramborové produkty, ovocné šťávy, pivo, čokoládu a jiná druhy cukrovinek a konzervované potraviny, . jako například marmeládu, přičemž k těmto produktům se přidává terapeuticky účinná množství alespoň jednoho inhibitoru podle vynálezu.
Osvětlení některých používaných reagencií a pomocných látek
Jako ionexy se mohou používat například tyto. komerčně dostupná produkty:
Amber lit IRA 410 Cl~ (anex), Amberlit (ЫСОзЧогта) (anexj,
Amberlit IRC 120 (H+forma), (silně kyselý katex),
Amberlit IRA 410 OH- (silný bazický anex], Amberlit IRC 50 H + (slabě kyselý katex] (zboží firmy Rohm a Haas ' Company), Dowex 50 WX 4H + (silně kyselý katex] (značka zboží firmy Dow Chemical Co. Midland, Michigan, USA).
Jako anex na bázi celulózy se může používat například EAE-celulóza firmy Schleicher a Schúll.
Jako polyakrylamidový gel se může používat například Bio-Gel P-2 (označení zboží firmy Bio-Rad Laboratories, Richmond, Kalifornie, USA).
Malcin je přírodní sladový extrakt formy Diamalt AG, Mnichov (NSR).
Levapol (g) je nespecifická adsorpční pryskyřice firmy Bayer AG, Leverkusen (NSR).
Klarcel je pomocný . filtrační prostředek firmy CECA, Velizy-Viilacoublay (Francie).
SE 50 je silikonový elastomer firmy Hewlett Packard.
Používané mikroorganismy jsou uchovávány v americké sbírce typů kultur (ATCC) pod těmito čísly:
Kmen ATCC—-Nr.
SE 50 (CBS 961.70) 31042
SE 18 (CBS 957.70) 31041
SE 82 (CBS 615.71) 31045
SE 50/13 (CBS 614.71) 31043
SE 50/110 (CBS 674.73) 31044
Příklad 1
Skleněný fermentátor s 8 ' litry živného roztoku obsahujícího 5,0 % škrobů, 1 % kvasnicového extraktu, 0,2 % K2HPO4 se naočkuje 3 dny třepanou baňkou s kmenem SE 50/13 (CBS 614.-71) a Inkubuje za intenzivního míchání a provzdušňování ' 3 dny : při 28 stupních Celsia a získá ' ss kultivační bujón s 105 000 AIE/ml.
litrů tohoto fermentačního živného roztoku se po ochlazení na 20 °C upraví polokoncentrovanou kyselinou dusičnou na ' pH 2,5, přidá se 30 g aktivního uhlí Karboraf'n a míchá 10 minut. Potom se 15 minut odstřeďuje při 10 000 ot/min a čirý světle žlutý zbytek po neutralizaci amoniakem odpaří na 500 ml. 500 ml koncentrátu se 45 minut míchá s 200 g anexu Amberlit IRA 410' Cl, oddělí na. nuči a přidají 4/5 objemu tedy 400 mililitrů methanolu, aby se vysrážela hlavní část vysokomolekulárního produktu odbourávání škrobu (společně s ještě přítomným zbytkem aktivního uhlí). Potom se 5 minut odstřeďuje při 5000 ot/min. 850 ml zbytku se přikape za intenzivního míchání do 4' litrů vysušeného ethanolu. Bílá vločkovitá sraženina se oddělí na nuči, promyje třikrát vysušeným ethanolem a dvakrát etherem a suší ve vakuu při 50 °C. Výtěžek: 36 g bílého prášku s 10.106 AIE/g. V některých dalších příkladech se tato látka používá.
Potlačení působení enzymu na deskách v tenké vrstvě
Pro posouzení konečného produktu a složení přípravku pomocí chromatografie ' na tenké vrstvě se nanese 1 μΐ fermentačního živného roztoku nebo 1 pg preparátu na hotové desky ze silikagelu (firma Schleicher und Schúll, Dassel; typ F 1500) a vyvíjí dvakrát systémem n-butanol, ethanO1 a voda v pomě-ru 50 : 30 : 20.
K vybarvení pro potlačení působení sacharázy se postříkají vyvinuté a dobře usušené desky s enzymgelem (20 ml na desku 20X20 cm) ' a gel se nechá ztuhnout. Potom se 5 minut předem inkubuje ve vlhké komoře při teplotě místnosti a nakonec sytě postříká substrátovým gelem. Po ztuhnutí této druhé vrstvy gelu se desky vnesou do vlhké komory a inkubují při 40 °C. Zbarvení inhibitoru (světlé skvrny, červeno hnědé pozadí) se vyvine po 60 až 90 minutách. . Ve chvíli optimálního vyvinutí barvy se proces přeruší a desky s agarovými vrstvami na nich se nacházejícími suší proudícím horkým vzduchem.
Příprava gelů
Enzymgel: 1,5 g agarózy (L‘Industrie Biologique Francais] se suspenduje ve 100 ml
0,2 M natriummaleinátového pufru (pH 6,0) a potom rozpustí varem. Čirý agarózový roztok se ochladí na 50 °C a přidá 250 μϊ roz197288 teku Tritonu X-100 (2 g Tritonu X 100-)-8 g ethanolu p.a.) a 0,5 ml roztoku dianisidinu (20 mg dianisidinu v 1 ml acetonu] za třepání. Přímo před použitím gelu se přidá 1 ml reagencie GOD/POD (12,5 mg glukosoxidázy, stupeň č ' stoty I, firmy Boehringer, a 2,5 mg peroxidázy, stupeň čistoty II, lyofilizát firmy Boehringer rozpuštěné v 5 ml maleinátového pufru) a 4 až 5 jednotek sacharázy z tenkého střeva prasat. Gel se musí až do postříkání udržovat na 50 °C, protože jinak v průběhu stříkání tuhne v trysce.
Substrátový gel: 0,5 g agarózy se suspenduje ve 100 ml natriummaleinátového pufru (pH 6,0) a rozpustí za varu. Potom se ochladí na 50 °C, přidá 100 <d Tritonu (2 g Tritonu X-lOO-j-8 g ethanolu p. a.) a přidá 1 gram sacharózy (Serva č. 35 579). Po rozpuštění sacharózy je gel · připraven k použití.
K vybarvení inhibice acylázy se postříkají vyvinuté a usušené tenké desky pro chromatografii amyláz-gelem (20 ml na desku 20 X X20 cm) a nechají ztuhnout. Po 5 minutách předchozí · inkubace při teplotě místnosti se na desky nanese vrstva 0,5% škrobového roztoku (1 g škrobu Merek čís. 1252, ve 200 mililitrech 0,2 glycerofosfátového pufru 0,01 M CaClž (pH 6,9), rozpuštěno za varu) a nechá se tam 2 minuty při 40 °C roztok za třepání. Potom se desky dobře opláchnou destilovanou vodou a pro vybarvení neodbouraných škrobů se smáčí ve zředěném jodovém roztoku (4 ml základního jodového roztoku na 500 ml vody, základní jodový roztok: 2,2 g jodu-|-4,4 g jodidu draselného, rozpuštěno ve 100 ml vody). Asi po 1 minutě je vybarvení optimální. Hned se fotografují, protože modré skvrny rychle zblednou.
Příprava amylázového gelu g agarózy se rozpustí ve 100 ml pufru z 0,2 M natriumglycerofosfátu a 0,01 M chloridu vápenatého (pH 6,9) při 100 °C a po ochlazení na 50 °C se přidá 100 (ul Tritonu X-100 (2 g Tritonu X-100-|-8 g ethanolu p.a.). Přímo před postříkáním se přidá 100 μΐ suspenze krystalické amylázy (10 /ug amylázy ze slinivky břišní prasat na ml nasyceného roztoku síranu amonného, firma Boehringer).
Příklad 2
Pokud se naočkuje jednolitrová Erlenmeyerova baňka se 120 ml živného roztoku obsahujícího 4 % škrobu, 2,4 % glukózy, 0,9 % kaseinového hydrolyzátu a 0,9 % kvasnicového extraktu, pH upraví hydroxidem sodným na 7,6, přidá 0,4 % uhličitanu vápenatého a sterilizuje 30 minut při 121 °C, s 3 ml výchozí kultury kmene SE 82 (CBS 615.71) rostoucí v živném roztoku sestávajícím z 2 % škrobu, 1 % glukózy, 0,5 % kaseinového hydrolyzátu a 1 % kvasnicového extraktu, pH upraví s NaOH na 7,2, přidá 0,4 % uhličitanu vápenatého, sterilizuje při 121 °C 30 minut a inkubuje · 5 dní při. 28 °C na zakružovací třepače, · tak se získá · roztok kultury s 122 000 AIE/ml. Během zpracování se mycelium oddělí od spojených roztoků kultury odstřeďováním při 12 000 ot/min., 300 ml f · ltrátu kultury se upraví částečně koncentrovanou kyselinou dusičnou na pH 2,5 a míchá 10 minut s 2,4 g aktivního uhlí p. a. Po oddělení uhlí odstřeďováním při 12 000 ot/ /mm. se k roztoku neutralizovanému pomocí 10 N hydroxidu draselného na pH 6 přidá 300 ml methanolu, krátce nechá stát a při 12 000 ot/mm. odstraní sraženina. Nyní · se zbytek přikape do 3 litrů ethanolu a po · krátkém stání sraženina · izoluje odstřeďováním při 12 000 ot/min. Sraženina se dvakrát promyje absolutním ethanolem a jednou etherem a suší ve vakuu. Získá se tak 2,23 g produktu s 7,45.106 AIE/g, který obsahuje 95 % sloučenm s ni -ý- nz = 4 a více glukózovými jednotkami.
Příklad 3
Když se naočkuje jednolitrová Erlenmeyerova baňka se 120 ml živného· roztoku obsahujícího 3,5 % glukózy, 2 % škrobu, · 0,5 % kaseinového hydrolyzátu, 1,3 % kvasnicového extraktu, 0,3 % uhličitanu vápenatého a 0,3 % středního fosforečnanu draselného, před sterilizací · upraví na pH 7,8, sterilizuje 30 minut při 121 °C, s 6 ml kultury kmene SE 50/110 v živném roztoku obsahujícím 3 % sójové mouky, 3 % glycerinu a 0,2 % uhličitanu vápenatého a inkubuje 3 až 4 dny na zakružovací třepačce při 24 °C, získá se roztok kultury obsahující 153 000 AIE/ml a 12 200 SIE/litr.
litr · roztoku kultury se kyselinou dusičnou upraví na pH 2,5, míchá 10 minut s 5 g aktivního uhlí a potom odstředuje 30 minut při 5000 ot/min. Nakonec se neutralizuje přidáním · 25 g A^l^i^rlitu IRA 410 (OH_ forma). Neutrální zbytek se v rotačním přístroji upraví na 100 ml, přidá 100 ml methanolu a filtruje. Filtrát · se rozmíchá ve 2 litrech absolutního ethanolu, vysrážená sraženina se odstraní na nučl a třikrát promyje acetonem s etherem a suší ve vakuu.
Výtěžek: 14 g bílého prášku s 5.106 AIE/g; převážně sloučeniny · alespoň s ni + rn = 4 glukózovými jednotkami.
Příklad 4
Pokud se pracuje podle příkladu 3 avšak s 0,5 % škrobu, získá se po čtyřdenní fermentaci kultivační bujón s 40 000 AIE a 184 SIE/ml. Kultivační bujón obsahuje směs sloučenin podle vynálezu, které mají alespoň jednu glukózovou jednotku.
Příklad 5
Pokud se naočkuje jednolitrová Erlenmeyerova baňka, která obsahuje 120 ml živného roztoku skládajícího se z 3 % glukó197288 zy, 0,6 % kaseinového hydrolyzátu, 1,6 % kvasnicového extraktu, 0,3 % uhličitanu vápenatého, 0,3 % středního fosforečnanu draselného, pH se před sterilizací upraví hydroxidem draselným na 7,8, s výchozí kulturou kmene SE 50/110 (CBS 674.73) podle příkladu 3 a inkubuje 4 dny při 24 °C na zakružovací třepačce, získá se kultivační bujón se 10 800 SIE/litr, obsahující převážně sloučeninu podle vynálezu s jednou glukózovou jednotkou.
litrů filtrátu kultury se oddělí od mycelia při 13 000 ot/min., upraví polokoncentrovanou kyselinou dusičnou na pH 2,5 a 15 minut míchá s 55 g aktivního uhlí a 200 g klarcelii. Po odstranění pevného podílu odsátím se neutralizuje koncentrovaným amoniakem na pH 7, roztok se odpaří na 1,5 litru a vysráží pětinásobným množstvím ethanolu.
Získaná vločkovitá sraženina se oddělí na odstředivce s průběžným rotorem při 12 000 ot/min. a žlutavý zbytek odpaří na 150 ml a pro oddělení nepatrného podílu nerozpustného materiálu odstřeďuje na pomaloběžné odstředivce. 50 ml tohoto roztoku se vnese na silně kyselým katexem Amberlit IR-120 (H + —forma) plněnou kolonu (30 X X 300 mm; 30 ml vody na hodinu). Potom co se zachytí celkem 300 ml eluátu, který obsahuje inertní sacharidy stejně jako podíl neadsorbovaných inhibičně účinných složek, převede se katex s asi 400 ml vody do kádinky a za míchání přidává tak dlouho koncentrovaný amoniak, až se upraví hodnota pH na 11,5. Po 30 minutách dalšího míchání se oddělí katex, odpaří se na 1/20 objemu, filtruje přes sloupec (20 X 150 mm) ionexu Amberlit IRA-410 (НСОз-—forma) a jímá při rychlosti toku 30 ml/h asi 500 ml eluátu, který se odpaří a po lyofilizaci poskytne 1,3 g surového produktu.
Pro další čištění se surový preparát frakcionuje na polyakrylamidovém gelu Bio-Gel P-2, 100—200 mesh (firma Bi-Rad, Mnichov). К tomu slouží sloupec o průměru 50 mm a délce 450 mm, kde se pracuje s vodou při rychlosti toku 40 ml/h, přičemž se shromažďují frakce vždy po 10 ml. Všechny frakce se zkouší anthronovým testem na uhlohydráty, stejně jako piomocí testu potlačujícího působení sacharázy na inhibičně účinné složky. Frakce obsahující inhibitor sacharázy se dále zkoušejí chromatografií na tenké vrstvě podle příkladu 1 na jejich obsah individuálních složek. Frakce obsahující sloučeninu s 1 glukózovou jednotkou se spojí, odpaří a lyofilizují. Dostane se 35 mg látky s 0,3.106 AIE/g a 30 000 SIE/g.
Příklad 6
Pokud se naočkuje jednolitrová Erlenmeyerova baňka vždy se 120 ml živného roztoku obsahujícího 5 % škrobu, 1 °/o kvasnicového extraktu, 0,2 % středního fosforečnanu draselného pokaždé 2 ml výchozí kultury podle příkladu 3, získá se po třídenní inkubaci při 28 °C roztok kultury s výtěžkem inhibitoru amylázy:
kmen AIE/ml
SE 50 (CBS 861.70) 37 000
SE 50/13 (CBS 614.71) 109 000
SE 50/110 (CBS 674.73) 53 500 který převážně tvoří směs sloučenin se 4 nebo více glukózovými jednotkami.
P ř í к 1 a d 7
Pokud se naočkuje jednolitrová Erlenmeyrova baňka vždy se 120 ml živného roztoku obsahujícího 1,3 % maltózy, 3,5 % glukózy, 0,5 % kaseinového hydrolyzátu,
1,3 % kvasnicového extraktu, 0,3 % uhličitanu vápenatého a 0,3 % středního fosforečnanu draselného, vždy 2 ml výchozí kultury podle příkladu 3, získají se po čtyřdenní inkubaci na zakružovací třepačce při 24 °C s různými kmeny tyto výtěžky:
kmen SIE/ml AIE/ml
SE 50 (CBS 961.70) 25580
SE 50/13 (CBS 614.71) 14,81460
SE 50/110 (CBS 674.73) 57,9755 kde převážně jde o směs sloučenin se 4 nebo méně glukózovými jednotkami.
P ř í к 1 a d 8
Pokud se naočkuje v fermentátoru 100 litrů živného roztoku obsahujícího 3,5 % glukózy, 2,5 % sladového extraktu maleinu, 0,5 % kaseinového hydrolyzátu, 1,3 % kvasnicového extraktu, 0,3 % uhličitanu vápenatého, 0,3 % středního fosforečnanu draselného a 0,1 °/o protipěnivého prostředku, ’ s 5 litry výchzí kultury podle příkladu 3 a inkubuje se za míchání s provzdušňování 5 dnů při 24 °C, tak se získá roztok kultury s 73 000 SIE/litr, který obsahuje převážně sloučeninu s ni + П2 = 2.
litrů fermentační násady s myceliem se upraví na pH 2,5 koncentrovanou kyselinou dusičnou při sledování pH-metrem a za míchání přidá 900 g ( = 1 %) aktivního uhlí pro adsorpci hlavního podílu vzniklých barevných látek. Míchá se 15 minut, potom oddělí na odstředivce pri 3000 ot/min. od mycelia a hlavního podílu uhlí a zbytek potom filtruje za přídavku 3 kg klarcelu přes tlakovou nuči. Získá se 61 litrů světle hnědého čirého filtrátu s obsahem 60 000 SIE/ /litr.
Filtrát se upraví koncentrovaným amoniakem na pH 7 a pro adsorpci se účinná látka míchá s 1300 g [2 %) aktivního uhlí 30 minut. Filtruje se přes tlakovou nuči a sediment aktivního uhlí dobře do sucha odlisuje a míchá třikrát se 4 litry 50% acetonu při pH 2,5 vždy 15 minut, aby se účinná lát197288 ka desorbovala z uhlí. Acetonové desorbáty se pio· oddělení uhlí filtrací spojí. Spojené desorbáty se odpaří na rotační odparce na 250 ml, přidá se stejný (250 ml) objem me ' · hanolu a filtruje přes skládaný filtr. Filtrát (480 ml) se za intenzivního míchání nakape do 5 litrů acetonu. Vysrážená sraženina se oddělí na nuči a třikrát promyje acetonem a etherem. Potom se suší ve vakuu při. 35 °C. Výtěžek: 230 · g s 8500 SIE/g.
g shora uvedeného surového produktu se rozpustí v 1 litru vody a míchá s 300 g silně kyselého katexu DowexR 50WX 4 H + (200 až 400 mesh) 30 minut. Pryskyřice se odfiltruje a ' promyje třikrát 2 litry 0,001 N kyseliny chlorovodíkové. .Promytý katex Dowex se potom suspenduje v 500 ml vody a suspenze upraví přidáním 25% amoniaku na pH 9,0 při sledování pH-metrem. Nakonec se desorbuje ještě dvakrát vždy 500 ml 0,6% amoniaku, desorbáty spojí a odpaří na rotační odparce na 100 ml. Pro odbarvení tohoto koncentrátu se míchá 5 minut s 2 g anexu DEAE-celulóza (firma Schleicher und Schull, čís. 02035, 0,6 mval/g) a potom odstřeluje. Světle žlutý zbytek se přidá ke stejnému objemu (100 ml) methanolu a potom nakape do 2 litrů acetonu za intenzivního míchání. Sraženina se odsaje na nuči, promyje acetonem a etherem a suší ve vakuu při 35 °C. Výtěžek činí 4,2 g s 26 000 SIE/g.
Pro řádné vyčistění se 4,0 g inhibitoru gelově filtrují po 0,5 g dílech přes polyakrylamídový gel Bio-Gel P-2. Potom se vždy 0,5 g preparátu rozpustí v 10 ml vody a vnese na sloupec gelu Bio-Gel P-2 (200 až 400 mesh, firma Bio-Rad) o průměru 5 cm a délce 95 cm. Vyvíjí se vodou při rychlostí toku 80 ml/h. Jímají se 12 ml frakce. Ve všech frakcích se vyšetří celkový obsah uhlohydrátu (ve formě anthronového testu, jako ext.nkce pří E6zo), stejně jako obsah inhibitoru sacharózy a inhibitoru amylázy. Kromě toho· se frakce zkoušejí chromatografií na tenké vrstvě (vybarvení inhibitoru enzymu podle příkladu 1).
Frakce obsahující sloučeniny se 4 až 6 glukózovými jednotkami se spojí, odpaří ve vakuu na 10 ml a vysráží nakapáním do 200 ml suchého ethanolu. Sraženina se oddělí odstředěním, promyje acetonem a etherem a suší ve vakuu. Výtěžek ze 4,0 g surového inhibitoru: 0,2 g sloučenin se 4 až 6 glukózovými jednotkami s 17,5.106 AIE/g a 8500 SIE/g.
Frakce obsahující sloučeninu se 3 jednotkami se zpracují stejným způsobem, přičemž se jysrážení provede 200 ml acetonu. Výtěžek ze 4,0 g surového inhibitoru: 0,1 g sloučeniny s ni -j n2 = 3, s 1,4.106 AIE/g a 21 000 SIE/g.
Z frakcí obsahujících sloučeninu s ni -j+ .02 = 2 (vysráženo acetonem) se izoluje
0,9 g sloučeniny s m + n2 = 2 jednotkami s 0,3.106 AIE/g a 68 000 SIE/g.
P ř í k 1 a d: 9
Pokud se naočkují 3 malé fermentátory vždy s 8 litry živného roztoku s obsahem
7,5 % sladového extraktu maleinu, 0,3 % kaseinového hydrolyzátu, 0,7 % kvasnicového extraktu, 0,3 % uhličitanu vápenatého, 0,3 % středního fosforečnanu draselného, s 5 % výchozí kultury kmene SE 50/110 (CBS 674.73) . (získáno podle· příkladu 3), tak se po pětidenní inkubaci při 24 °C získá kultivační bujón s 73 SIE/ml, který převážně obsahuje sloučeninu s ni -J- nz = 2. Po odstředování [30 minut, 3000 ot/min) po oddělení mycelia se získá 20,5 litrů tmavohnědého roztoku kultury s 67 000 SIE/litr. Upraví se kyselinou dusičnou na pH 3,5 a přidá pro odbarvení 60 g adsorpční pryskyřice Lewapol (Ca 9221, 0,35 mm zrnění, firma Bayer) na litr, tedy 1,23 kg Lewapolu. Po dvacetiminutovém míchání se oddělí na nuči přes filtr (Seitz K3). Odbarvený roztok kultury se neutralizuje amoniakem (18,5 litru, 67 000 SIE/litr). Nakonec . se pro adsorpci účinné látky vmíchá 20 g/litr aktivního uhlí, tedy 370 g a po· dobu 20 minut míchá. Pak se odfiltruje přes filtr (Seitz K3), který je opatřen vrstvou pomocného filtračního prostředku klarcel. Filtrát (17,5 · litru, 3600 SIE/litr) se odloží. Zbytek na uhlí se třikrát promyje 2 litry destilované vody. Pro desorpci účinné látky z uhlí se třikrát . míchá vždy s 1 litrem 80% acetonu . 15 · minut, přičemž se pH upraví na 2,5 koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou. Desorbáty se spojí (2,4 · litry, 371 000 SIE/litr). Do desorbátu se vnese 20 g/litr katexu Dowex H+ (Dowex 50 W X 4, H + -forma firma Serva, Heidelberg), tedy 46 g Dowexu a míchá 20 minut. Potom se pryskyřice odfiltruje (Dowexová frakce I) a promyje asi 75 % acetonem. Filtrát a promývací kapalina (3 litry = 215 000 SIE/litr) se rozmíchají s 60 g/litr silně bazického anexu Amberlit IRA 410 (OH_-forma, firma Serva, Heidelberg) a upraví na pH 7. Potom se odfiltruje a k filtrátu (2,8 litru, 219 000 SIE/litr) přidá 72 gramu katexu Dowex H+ a míchá 20 minut. Př'tom se udržuje pH 3,0 zavěšením porézního nylonového sáčku naplněného anexem Amberlit IRA 410 OH~. Potom se odfiltruje od katexu Dowex (Dowexová frakce II) a filtrát (2,6 litru, 27 000 SIE/litr) odloží.
Dowexová frakce I a II se promyjí odděleně třikrát vždy 75 % acetonem při pH 3,5 a potom desorbují vždy třikrát 100 ml (dowexová frakce I) nebo 150 · ml (dowexová frakce II) 0,6 % amoniaku. Při první desorpci, při které množství · amoniaku pro neutralizaci pryskyřice · Dowex není dostačující, se upraví přídavkem koncentrovaného . amoniaku pH na 9 při sledování pH-metrem. 3 desorbáty dowexových frakcí I a II se spojí, na rotační odparce odpaří skoro do sucha, vyjmou 50 ml vody, pomocí pH-metru upraví kyselinou chlorovodíkovou na 3 až 4 a přidá 50 ml methanolu. Roztok se za míchání nakape do 1,5 litru absolutního acetonu, vysrážená sraženina se odsaje na nuči a promyje třikrát acetonem, stejně jako' jednou etherem a suší ve vakuu.
Výtěžek:
frakce I 6,5 g 25 000 SIE/g
frakce II 12,3 g 66 000 SIE/g
Výtěžek
Objem SIEy/lttr
(litr)
1) Roztok kultury 20,5 67 000
2) Po odbarvení
Lewapolem 19,5 67 000
3] Po adsorpci na
aktivním uhlí 18,5 3 600
4) 1. desorbát 0,7 742 000
5) 2. desorbát 0,9 329 000
6) 3. desorbát 0,8 85 000
7) . Směsný desor-
bát (4—6) 2,4 371 000
8) Po 1. dowexové
adsorpci 3,0 215 000
9) Po neutralizaci
s IRA OH“ 2,8 219 000
10) Po 2. dowexové
adsorpci 2,5 27 000
11) Spojené NI-I3 de-
sorbáty z dowe-
xové frakce I 0,29 682 000
12) spojené NH3 de-
sorbáty z dowe-
xové frakce II 0,45 1 419 000
13] Srážení
frakce I 6,5 g 25 000/g
Srážení ,
frakce II 12,3 g 36 000/g
Příklad 10
Pokud se inkubují 2 g přípravku jako je popsán v příkladě 1 v 60 ml 20 mM natriumglycerofosfátového pufru [pH 6,9] a 1 mM chloridu vápenatého s 1 g α-amylázy z Aspergillus spec. (Serva čís. 13 418) za neustálého míchání 120 hodin při 37 °C, potom se zahřívá 5 minut na 100 °C a odstřeďuje při 4000 ot/min. od nerozpustného podílu, tak se po lyofilizaci roztoku získá 1,9 g produktu s 3500 SIE/g a 2.106 AIE/g. Zkouší-li se tento produkt pomocí chromatografie na tenké vrstvě a zbarvení inhibitoru sacharázy jako je popsáno v příkladě 1, tak se ukáže, že sloučeniny s aktivitou potlačování jsou v podstatě sloučeniny podle vynálezu ' s ni -j- nz = 1, 2 a 3.
Příklad 11
Pokud se inhibují 2 g přípravku jako je popsán v příkladě ’ 1 v 30 ml 20 mM acetátového pufru [pH 4,8] s 1,25 mg /Lamylázy z bataty (Boehringer) za neustálého- míFrakce I a II obsahují jako složku s potlačujcím účinkem hlavně sloučeninu podle vynálezu s ni -j- nz = 2, vedle nepatrného podílu sloučeniny s ni -j- П2 = 3.
Následující tabulka uvádí potlačování působené sacharázou u preparátů v po sobě jdoucí řadě:
SIE celkem Výtěžek SIE ' %
1 373 500 100
1 306 500 95
66 600 (4,8 odložen)
519 400 ) 37,8 ] I
296 100 } 883 500 21,6 64,4
68 000 J 5,0 ]
890 400 64,8
645 000
613 200
67 500 (4,9 odložen]
197 780 14,4 ’
' 60,9
638 550 46,5 '
162 500 11,8 ]
1 i (· 44,0
442 800 32,2 J
chání 120 hodin při 37 °C, zahřívá 5 minut na 100 °C a odstředí při 4000 ot/min. od nerozpustného podílu, tak se získá po lyofilizaci roztoku 1,5 g produktu s 1800 SIE/g a 3,8.106 AIE/g. Zkouší-li se tento produkt pomocí chromatografie na tenké vrstvě a zbarvení inhibitoru sacharázy jako je popsáno v příkladě 1, tak se ukáže, že sloučeniny s účinkem potlačování jsou v podstatě sloučeniny podle vynálezu s ni 5 nz = 2 a 3.
Příklad 12
Pokud se naočkuje 200ml Erlenmeyerova baňka s 25 ml živného roztoku s obsahem 0,1 % středního fosforečnanu draselného, 0,2 % síranu amonného, 0,05 % síranu horečnatého, 0,05 % chloridu draselného,
0,01 % síranu železnatého, 2 % přípravku jako je popsán v příkladě 1, se suspenzí spor kmene Asp. niger ATCC 11 3Θ4 a inkubuje při 28 - °C ría zakružovací třepe, čce, tak poklesne po 6 dnech Al^^-^-iiitr z 210 300 AIE/ /ml na 53 000 AIE/ml a po 10 . dnech na
21300 AIE/ml. Současně vzroste obsah SIE/ /ml z 7,0 na 72 SIE/ml.
ml roztoku inkubovaného 10 dní se suspenzí spor se odstřeďuje pro oddělení mycelia 30 minut při 3000 ot/min. 15 ml zbytku (72 000 SIE/litr) se odsolí třicetiminutovým mícháním s 2 g katexu Amberlit IRC 50 H+ a 1 g anexu Amberlit IRA 410 OH“ (vodivost menší než 2 mS.cm1). Ionexy se odfiltrují a filtrát nechá protékat v množství 5 ml/h katexem Dowex H+ ve sloupci (průměr 1 cm, délka 10 cm) ekvilibrovaném 0,001 N kyselinou chlorovodíkovou. Potom se promyje 200 ml 0,001 N kyseliny chlorovodíkové. К desorpci se čerpá 10 ml/h 0,6% roztoku amoniaku sloupcem a jímají se 5ml frakce. Frakce vykazující aktivitu potlačování působení sacharázy se spojí, odpaří na rotační odparce na 2 ml a přidají se 2 ml methanolu. Roztok se upraví na pH 3 až 4 a vysráží přikapáním 100 ml acetonu. Sraženina se oddělí na nuči, promyje acetonem a etherem a suší se ve vakuu. Výtěžek činí 26 mg s 28 000 SIE/g, kde látka sestává ze sloučenin s ni ψ П2 = = 2 a 3. Získání čisté sloučeniny s ni + + П2 = 2 z tohoto produktu se provádí jako je popsáno v příkladě 8 gelovou filtrací na sloupci gelu Bio-Gel P-2. Získá se 7 mg sloučeniny s ni + пг = 2 o 60 000 SIE/g.
Příklad 13 litry filtrátu kultury, který se získal z fermentační násady jako je popsáno v příkladě 5 odstraněním mycelia při 13 000 ot/ /min. a který má aktivitu 13 000 SIE/g se míchá pro redukci obsahu solí (vodivost filtrátu kultury asi 10 mS.cnr1) s 500 g směsi ionexů z 2,5 dílu Amberlitu IRC-50 (HMorma) a 1 dílu Amberlitu IRA-410 (OH~-forma) 1 hodinu. Ionexy se oddělí, roztok odpaří na poněkud menší objem než 100 ml a pro odstranění nerozpustného podílu při 20 000 ot/min. odstreďuje 15 minut. Zbytek se doplní na 100 ml, (má skoro vodivost 3,5 mS.cnr1) P-celulózy (Serva č. 45 130, připraven podle známých metod a v 5 mM amoniumfosfátovém pufru [pH 5,5] ekvilibruje). Jako eluční činidlo slouží uvedený pufr. Rychlost toku je 90 ml/h a jímají se frakce o objemu 18 ml.
Frakce eluátu se potom zkoušejí na jejich obsah uhlohydrátů [pomocí anthronového testu) a sloužek potlačujících působení sacharázy (pomocí testu inhibice sacharázy). Spojí se frakce, které jsou podle anthronového testu takřka prosté uhlohydrátů a současně mají při testu inhibice sacharázy zvláštní účinek (frakce 60 až 170), odpaří na 150 ml a filtrují přes sloupec (50 X X 300 mm) anexu Amberlit IRA-410 (HCO3_-forma). Pro lepší kontrolu desionizace se zachycuje eluát ve frakcích (10 ml frakce za 20 minut) a zkouší na uhlohydrát (pomocí anthronového testu: pořád skoro negativní), na fosfát (pomocí reagencie ky selina askorbová-molybdát: zcela negativní) a na potlačování působení sachrázy (pomocí testu inhibice enzymu). Frakce s potlačujícím účinkem (3 až 30) se spojí, odpaří, lyofilizují, znovu rozpustí a lyofilizují. Dostane se 280 mg surového inhibitoru.
Další čištění surového inhibitoru na gelu Bio-Gel P-2 se provádí jako je popsáno v příkladě 6 frakcionizací. Z frakcí, které obsahují čistou sloučeninu s ni П2 = 1 se po lyofilizaci izoluje 30 mg produktu s 0,3. .106 AIE/g a 35 000 SIE/g.
P ř í к 1 a d 1 4
Pro získání aminocLikrových derivátů s 5 až 7 glukózovými jednotkami se například vychází z přípravku, jako byl popsán v příkladě 1.
g přípravku podle příkladu 1 se rozpustí ve 250 ml vody. Vodivost tohoto roztoku činí 10 mS.cm4 a pH 5,5. Pro odsolení se к roztoku přidá 60 g slabě kyselého katexu Amberlit IRC 50 H+ (katex, který aminocukrové deriváty váže jen ve stopách z vodného roztoku) a 20 g anexu Amberlit IRA 410 OH a míchá 20 minut. Flitrát, (ó vodivosti 0,5 mS.cm1, pH 3,5) se upraví 1 N kyselinou chlorovodíkovou na pH 3,0 (vodivost 0,6 mScm1). Tento roztok se čerpá rychlosti 42 ml/h katexem Dowex 50 W (H + -forma) naplněným ve sloupci o průměru 2,5 cm a výšce 40 cm (ekvilibrace v 0,001 N kyselině chlorovodíkové a nakonec se promyje 2 litry 0,001 N kyseliny chlorovodíkové. Po promytí sloupce se eluuje 1,2% vodným amoniakem a jímají se 10 ml frakce. Frakce s potlačujícím účinkem se spojí, amoniak odtáhne ve vakuu a roztok potom odpaří ve vakuu na 30 ml. Nakapáním do 600 ml suchého ethanolu se provede srážení, sraženina oddělí na nuči a suší ve vakuu po promytí ethanolem a etherem. Výtěžek činí 4,4 g s 26,5.105 AIE/g.
0,5 g látky se pro jemné vyčištění nanese na sloupec preparativního gelu Bio-Gel P-2, jako je popsáno v příkladě 8 a vyvíjí. Frakce obsahující podle chřomatografie na tenké vrstvě (vybarvené inhibitorem amylázy) sloučeniny s ni + 112 == 5 až 7 se spojí, odpaří ve vakuu a vysráží suchým ethanolem jako bylo popsáno shora. Výtěžek z 0,5 g surového produktu činí 0,2 g aminocukrového derivátu s ni + 112 = 5 až 7, s 30.106 AIE/g a 2500 SIE/g.
P ř í к 1 a d 1 5
Tento příklad ukazuje jak se mohou eluovat sloučeniny z katexů za kyselých podmínek.
Sloupec o průměru 1,5 cm se naplní 30 g (hmotnost za vlhka) katexu DowexR 50 W X X 4 (H+-forma), 200 až 400 mesh v 0,001 N kyselině chlorovodíkové. Potom se čerpá 500 mililitrů smíšeného desorbátu (400 000 SIE/ /litr, pH 2,5, 60% aceton), získaného podle příkladu 9 (tabulka, průběh č. 7) asi 1 hodinu sloupcem a potom se promyje 500 ml 0,001 N kyseliny chlorovodíkové. Za těchto podmínek se eluuje sloučenina pouze se stopami účinku. Potom se desorbuje 0,0125 N kyselinou chlorovodíkovou, přičemž se registruje vodivost nebo index lomu eluátu vytékajícího z kolony. Mimoto se eluát testuje na obsah SIE. Účinné frakce 74 až 100 se spojí a po přidání enexu Amberlit IRA 410 OH se neutralizují, potom odpaří - na 5 ml, nechají reagovat s 5-ml methanolu a vysráží přidáním do 200 ml acetonu. Po promytí acetonem a etherem se suší ve vakuu.
Výtěžek činí 1 g sloučeniny s ni + П2 = 2 s 65 000 SIE/g.
Z účinných předních frakcí se mohou získat sloučeniny s ni -- 112 — 3 a 4 glukózovými jednotkami.
Tento způsob kyselé desorpce 'umožňuje také naopak vzhledem k alkalické . desorpci frakcionování pro získání jednotlivých anrnocukrů této řady.
Když se přípravek se 4 až 8 glukózovými jednotkami jako je popsáno shora podrobí tomuto postupu, přičemž se neutralizovaný eluát lyofilizuje, získají se následující jednotPvé větší frakce:
ni + nn = 4 = 67 000 AIE/m.g ni + П2 = 5 = 57 000 AIE/mg ni -j-· nn = 6 = 42 000 AIE/mg ni -j- П2 = 7 = 24 000 AIE/mg ni + nn = 8 = 5 000 AIE/injg
Příklad 16
Shora popsaný způsob odbourávání β-amylázy se provádí takto:
100 mg sloučeniny se rozpustí v 1,9 ml 20 mM natriumacetátového pufru (pH 4,75) a přidá 0,1 ml ^-amylázy z butaty (Boehringer, 5 mg/ml, 500 jedn./mg). Směs se udržuje 48 hodin při 37 °C a zahřívá 5 minut na 100 °C a nakonec odstředí při 4500 ot/min., aby se vysrážená bílkovina a jiné nečistoty odstranily. Celá směs se potom vnese na sloupec gelu Bio-Gel P-2 (průměr 22 mm, délka 100 cm, teplota udržována termostatem na 65 °C) a eluuje vodou při rychlosti toku 25 rnl/h. Eluát se vede konduktometrem a vysoce citlivým reflektometrem s průtokovými kyvetaml. Jímají se frakce vždy o
2,5 ml. Frakce se mohou zkoušet na účinek potlačující působení amylázy nebo sacharázy nebo pomocí antimonového testu. Elektrolyty pocházející z pufru a enzymový preparát se eluují s vyloučeným objemem a produkty odbourávání podle ubývající molekulové hmotnosti. Úplné oddělení sloučenin, jejichž molekulová hmotnost se jen málo liší se provádí opakovanou chromatografií za shora popsaných podmínek. Frakce obsahující produkt určený k izolování se spojí a lyofilizuJí·
Příklad 17
Pro oddělení isomerních sloučenin se třemi glukózovými jednotkami se vnese 10 g isomerní směsi rozpuštěné ve vodě na sloupec naplněný katexem DowexR 50 W X 4 (H + -forma). Sloupec se nejprve promývá vodou až je eluát neutrální a potom eluuje 0,025 N kyselinou chlorovodíkovou. Frakce se jímají vždy po 3 ml a zkouši chromatografií na tenké vrstvě. Chromatografie na tenké vrstvě se provádí na silanizovaných deskách silikagelu se směsí ethylacetátu, methanolu, vody a 25% amoniaku v poměru . 100:60:40:2 s trojnásobným vyvíjením. Sloučenina vzorce IV, probíhá větší vzdáleností od výchozího místa než . sloučenina vzorce V. Frakce 215 až 272 obsahující 6 g isomeru vzorce V a frakce 288 až 294 obsahující 600 miligramů isomeru vzorce IV se spojí, neutralizují anexem Amberlit IRA-410 (OH~-forma) a odpaří.
Potlačení působení sacharázy in ' vitro u isomeru vzorce IV izolovaného . tímto postupem je 19 000 SIE/g.
Příklad 18
Vyčištěné preparáty sloučenin sni-- 112 š y 4 se mohou získat opakovanou gelovou prostupovou chromatografií (recycling gel permeation chromatography) podle tohoto příkladu.
6,0 g surového preparátu - ' sloučeniny s ni +-П2 = 4 a 5 získaného podle příkladu 8 nebo 17 se zbaví příměsí solí rozpuštěním materiálu v 1 nM amoniaku a tento roztok se vnese na kolonu (o průměru 50 mm a délce 100 cm) plněnou Sephadexem G-10R. Sloupec se eluuje 1 nM amoniakem a eluát se sleduje pomocí průtokového refraktometru a konduktometru s průtokovým článkem, Eluát se může také zkoušet chromatograficky na tenké vrstvě na silikagelových deskách s n-butanolem, ethanolem a vodou v poměru 45:35:20. Frakce obsahující čistý materiál se spojí a lyofilizují. Výtěžek činí 4,4 gramu.
2,0 g tohoto materiálu se k dalšímu dělení vnesou na kolonu (průměr 50 mm, délka 100 cm) naplněnou gelem Bio-Gel P-2R, 200 až 400 mesh. V koloně se udržuje teplota termostatem na 65 °C a eluuje se vodou při rychlosti toku 80 ml/h.
Nepoužitelná frakce a frakce obsahující sůl, které ještě mohou být přítomny po chromatografii na Sephadexu se odloží. Systém skládající se z kolony, oběhového čerpadla, průtokového refraktometru a průtokového konduktometru se uzavře a roztok se nechá obíhat přes gel. Jak pokročilo -oddělování se zkouší neustálým sledováním indexu lomu a vodivosti. Dostačujícího oddělení se dosáhne po 5 obězích. Potom se kolona opět připojí na zásobník rozpouštědla a. eluuje, přičemž se jímají frakce vždy s objemem 16 ml. Frakce se zkoušejí chromatografií na tenké vrstvě, jako bylo shora popsáno a frakce, které obsahují čisté sloučeniny a mezifrakce se spojí a lyofilizují. Výtěžek činí 300 mg sloučeniny s m + П2 = 4; 420 mg sloučeniny s ш n2 = 5 a 100 mg méně oddělených látek jako mezifrakce.
Příklad 19 jednolitrové Erlenmeyerovy baňky, které obsahují vždy 200 ml živného roztoku s obsahem 2 % škrobů, 1% glukózy, 0,5 % aminů NZ, 1 % kvasnicového extraktu a 0,4 procenta uhličitanu vápenatého (sterilace po dobu 30 minut při 121 °C, pH před sterilací upraveno na 7,2) se naočkují vždy 2 ml výchozí kultury (získané ve stejném živném rozteku, očkováno s agarem s ovesnými vločkami ze šikmých trubičkových kultur). Tyto baňky se kultivují při teplotě 28 °C na zakružovací třepačce. Po třídenní době kultivace se obsah všech tří baněk spojí a mycelium se oddělí na odstředivce. Získá se 425 mililitrů zbytku, který obsahuje 1100 AIE/ml, 0,17 MIE/mi a 1,0 SIE/ml.

Claims (1)

  1. Způsob výroby aminocukrových derivátů obecného vzorce I kde m znamená číslo 1 až 7 a
    П2 znamená číslo 1 až 7, přičemž součet ni а П2 představuje číslo 2 až 8, vyznačující se tím, že se kultivují kmeny SE 50 (ATCC 31 042), SB 18 (ATCC 31 041), SE 82 (ATCC 31 045), SE 50/13 (ATCC 31 043) a
    SE 50/110 (ATCC 31 044) rodu Actinoplanaceae aerob v pevném nebo tekutém živném prostředí, které obsahuje zdroj uhlíku a dusíku, stejně jako soli a prostředek zabraňující pěnění, při teplotě 15 až 45 ЭС a pH 5,0 až 8,5 a požadované sloučeniny se o sobě známým způsobem izolují.
CS215177A 1976-04-02 1977-03-31 Process for preparing aminoderivatives of sugar CS197288B2 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE2614393A DE2614393C3 (de) 1976-04-02 1976-04-02 Aminozucker-Derivate und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CS197288B2 true CS197288B2 (en) 1980-04-30

Family

ID=5974340

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS215177A CS197288B2 (en) 1976-04-02 1977-03-31 Process for preparing aminoderivatives of sugar

Country Status (10)

Country Link
CS (1) CS197288B2 (cs)
DK (1) DK144477A (cs)
ES (1) ES457386A1 (cs)
FI (1) FI63964C (cs)
IL (1) IL51785A (cs)
NO (1) NO770915L (cs)
NZ (1) NZ183737A (cs)
PL (1) PL197139A1 (cs)
RO (1) RO71905A (cs)
ZA (1) ZA772009B (cs)

Also Published As

Publication number Publication date
PL197139A1 (pl) 1978-01-16
ZA772009B (en) 1978-03-29
NO770915L (no) 1977-10-04
NZ183737A (en) 1978-07-28
IL51785A (en) 1980-01-31
FI63964C (fi) 1983-09-12
FI770998A7 (cs) 1977-10-03
IL51785A0 (en) 1977-05-31
DK144477A (da) 1977-10-03
ES457386A1 (es) 1978-02-16
FI63964B (fi) 1983-05-31
RO71905A (ro) 1982-07-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4062950A (en) Amino sugar derivatives
CA1044164A (en) Glycoside hydrolase inhibiting amino sugar derivatives
CA1121290A (en) Amino sugar derivatives
US7491518B2 (en) Method of elevating yield of oligosaccharides containing α-galactosyl and anti-candida compositions
US4019960A (en) Process for the production of a saccharase inhibitor
US20240376142A1 (en) A-salidroside, method for preparing same, and application thereof
US4065557A (en) Amino sugars and their use in improving the meat:fat ratio in animals
US4316894A (en) Antibiotic SF-1130-x3 3 substance and production and use thereof
DK148798B (da) Fremgangsmaade til fremstilling af 1-desoxynojirimycin ud fra organismer af slaegten bacillus, samt en kultur af en bacillus-stamme til anvendelse herved
US3937817A (en) Pharmaceutical compositions containing a saccharase inhibitor
JPS603319B2 (ja) アミノ糖誘導体
CS197288B2 (en) Process for preparing aminoderivatives of sugar
JPS6178396A (ja) 新規α‐グルコシダーゼ抑制剤およびその製法
US4990500A (en) Oxirane pseudooligosaccharides, a process for their preparation, their use and pharmaceutical preparations
KR800001434B1 (ko) 아미노-당 유도체의 제조방법
KR790001709B1 (ko) 아미노-슈가 화합물의 제조방법
US3934006A (en) Pharmaceutical compositions comprising saccharase inhibitors
NO853460L (no) Nye pseudooligosakkarider med alfa-glukosidasehemmende virkning, fremgangsmaate til deres fremstilling og deres anvendelse samt farmasoeytiske preparater.
JP2860489B2 (ja) 食品素材、ビフイズス菌増殖促進剤およびそれらの製造方法
IE44803B1 (en) Amino-sugar derivatives
EP0263955A2 (en) Process for the production of panosyl derivatives
US3995026A (en) Amylase inhibitor
JPH05244975A (ja) アルキルグリコシドの製造方法
FI58158B (fi) Foerfarande foer separering och rengoering av mikrobiologiskt framstaellda aminosockerderivat
JP3045509B2 (ja) マンノース含有オリゴ糖の製造法