CN87107205A - 转氨酶基因ilve的克隆和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种复制性“染色体外”的含ilvE基因的结构基因的制备方法，包括自大肠杆菌ATCC11303中分离ilvE基因并克隆到质粒中。还涉及将该质粒插入到微生物中通过表达产生活性脂族转氨酶，由转氨酶完成相关酮前体的胺化作用，从而大量地产生氨基酸。

Description

体内合成脂肪族氨基酸的最后步骤包括借助氨基转移酶使相应的酮前体产生胺化。虽然各种转氨酶均可完成转氨基反应，生成脂族氨基酸，但这种作用在细胞内主要是靠脂族转氨酶完成的。遗传学中所用的脂族转氨酶基因的缩写符号是iLvE（Umbarger，Ann.Rev.Biochemistry    47（1978），533-606）。对于大肠杆菌K12来说，已确切知道了该基因在“细菌染色体”上的定位，其基因产物为E.C.2.6.1.42号（Bachmann等，Microbiological    Reviews    44（1980），1-56）。

欧洲专利申请（EP-A）0116860号描述了分离大肠杆菌K12中iLvE基因及将这种氨基转移酶基因克隆到一个多拷贝质粒上的方法，没有说明被克隆的iLvE基因产物的生物活性。EP-A    0152275号中提到通过克隆iLvE基因来提高酶的活性，但没有关于增加脂族氨基酸产率的资料。

现已发现，分离大肠杆菌ATCC11303中的iLvE基因，並将其克隆到一个多拷贝质粒中，再用这一质粒转化始发菌株之后，可使该氨基酸的产率至少增加3到5倍。

因此，本发明涉及：

1、一个染色体外的复制成分，其含有自大肠杆菌ATCC11303分离的iLvE基因。

2、由（1）指出的“染色体外”复制成分，在脂族氨基转移酶合成中的应用。

3、由（1）所规定的“染色体外”复制成分在微生物体内过量产生分枝链氨基酸中的应用，包括

a）将“染色体外”复制成分引入微生物内;

b）在该微生物内表达iLvE基因並合成有活性的脂族转氨酶;

c）由转氨基酶与相应的酮前体产生胺化作用。

本发明在说明书的详述部分及权利要求书中给以更充分的说明。

该基因不仅可用于野生型大肠杆菌ATCC    11303，而且还可用于其变种和突变体。例如，它可用于由已知方法（E.Adelberg等Biochem.Biophys.Res.Comm.18，788（1965））致突变的菌株以及根据过量产生分枝链氨基酸而选择的菌株。大肠杆菌ATCC    11303中iLvE基因编码的脂族氨基转移酶，可借助这种酶自谷氨酸盐转移氨基，由相关酮前体合成缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸。此外，亦可使用脂族转氨酶合成苯丙氨酸和谷氨酸。除iLvE基因产物外，还发现了大肠杆菌细胞中的其他转氨酶基因的产物。

例如，芳族转氨酶是tyrB基因的产物，可催化苯丙氨酸、酪氨酸、天冬氨酸和亮氨酸的合成，aspC基因的产物催化天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的合成。然而，上述的转氨酶也在其它族的氨基酸合成中显示微弱的活性。

为了进一步增加分枝链氨基酸的合成，而克隆了编码脂族氨基转移酶的iLvE基因。先分离大肠杆菌ATCC11303的DNA，部分消化该DNA之后，将所得的20-30Kb的片段连接到有复制子的装配型质粒中（该质粒具有广泛的宿主），並包裹在λ噬菌体的头部。装配型质粒最好选用pIMS    6026。该质粒是由装配型质粒pLAFR    1（ATCC37167）衍生来的就是将编码有转座子Tn    903的卡那霉素抗性基因的商品EcoR1片段（Pharmacia，Uppsala，Sweden）克隆到pLAFR1的单一EcoR1切点中。因BamHJ切点两侧邻接2个EcoR1切点，用BamH1酶切删去EcoR1片段的大部分，保留作为插入部分的短DNA片断。这个不存在于装配型质粒pLAFR    1上的BamHI切点可用于克隆。将适当配制的大肠杆菌DG    30悬液与已包装的装配型质粒保温，将装配型质粒引入微生物体内。大肠杆菌DG30缺少三种转氨酶aspC、iLvE和tyrB。因此，尽管该菌株能在完全培养基上生长，但在基础培养基上生长须添加它们不能合成的各种氨基酸。由于适当地选择培养基，有助于检测该菌株是否已由外界摄入的DNA来弥补其染色体合成特殊转氨酶的缺陷。iLvE基因的引入是由大肠杆菌DG    30在无酪氨酸基础培养基上生长而确定的。只有能通过摄入含有aspC、tyrB或iLvE的DNA以补足其染色体合成酪氨酸的缺陷，且来源于大肠杆菌菌株ATCC    11303的克隆才能在这种培养基上生长。由基因aspC、tyrB和iLvE编码的三种转氨酶的区别在于它们的底物不同-尽管所有这三种转氨酶都能催化酪氨酸的生成。

由基因tyrB编码的芳族转氨酶，不能由酮前体生成异亮氨酸，但能够由相应的酮前体中以较高的产率合成亮氨酸。由基因aspC编码的转氨酶不能合成异亮氨酸，也不能使异亮氨酸转化为亮氨酸。但iLvE基因产物能以转较高产率产生异亮氨酸。

因此，可根据在添加了除特定基因之特异氨基酸以外的代谢所必需的氨基酸的基础培养基上生长情况，来区分含不同转氨酶的各个克隆。含有iLvE基因的DG30克隆菌株就是用这种方法选择出来的。

鉴定这些克隆是否具有iLvE基因，须自克隆中分离质粒DNA。然而，从菌株DG    30中分离质粒DNA可能有一些困难，虽然有可能得到质粒DNA，但产率较低。因此，在微溶解（minilysis）后，用含有插入外源基因的装配型质粒DNA转化大肠杆菌菌株之后，便可能以较好产率自该菌株重新分离所引入的DNA。大肠杆菌DH1（ATCC    33849）特别适用于这一目的。

下一步是，将重新分离的装配型质粒DNA与一高拷贝数的载体相连。由大肠杆菌K12菌株的染色体基因图可知，iLvE基因位于Sal    Ⅰ-SmaⅠ片段上。该片段只含有iLvE的结构基因，而不含天然启动子。这有可能与大肠杆菌ATCC    11303情况相似。为此，最好使用一种多拷贝质粒作载体，使其Sal-Ⅰ-SmaⅠ片段在质粒启动子的控制之下被克隆。特别优选的载体是质粒pBR322，其序列是已知的並可由市场上购买。

用SalⅠ和SmaⅠ确完全切断装配型质粒DNA，並用限制性内切酶SalⅠ和PvuⅡ完全切断载体。将两种DNA混合並连接在一起，用所得产物转化宿主菌的感受态细胞，可望在其中提高分枝链氨基酸的产量。这种宿主菌最好使用肠道细菌，特别是大肠杆菌和大肠杆菌ATCC11303菌株及其突变株和变种。用氨苄青霉素选择抗性菌落，用微溶解法自适当的菌落分离质粒DNA，並用限制性内切酶SalⅠ完全切断以鉴定载体DNA大小的改变。进行限制性分析以确保所有原来DNA部分中的片段均以这种方式再克隆。然后使用文献（Duggan等，Anal，Biochem.51（1973）67-79）中报导的方法检验各含有SalⅠ-SmaⅠ片段之克隆的脂族转氨酶（即iLvE的基因产物）活性。有可能以这种方法使iLvE活性提高10倍以上。琼脂凝胶电泳的结果表明，宿主菌株的载体含有ATCC    11303片段大小约1MD。

下列实例将详细描述本发明。除特别指出者外，所用百分数据均为重量百分比。

实施例1

自大肠杆菌分离並用限制性内切酶消化装配型质粒pIMS    6026。

使用Humphreys等人的方法（Biochim.Biophys.Acta383，457-63（1975））或用Birnboim和Doly的方法（Nucleic    Acids    Res.7：1513（1979））在一10倍规模上进行碱溶解，自大肠杆菌分离装配型质粒pIMS    6026。每种方法分离，均至少用CsCL/EtBr密度梯度离心法将质微NDNA纯化一次。

使用制造商（New    England    Biolabs）推荐的方法用限制性内切酶BamHI完全切断质粒pIMS    6062。为检验这一酶切过程的完全程度，将等分的限制性酶切混合物加于0.8%琼脂糖凝胶上进行电泳分离。用溴化3.8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓染色后並用短波紫外光（254nm）照射，只显现一条带，此表明已经完全切断。用苯酚处理，以由已经酶切的装配型质粒DNA除去限制性内切酶，用乙醇沉淀质粒DNA，再用70%乙醇洗DNA，真空下干燥並在适当体积的TE缓冲液（10mM    Tris;1mM    EDTA，PH8.0）中重新溶解。然后可按制造商（Boehringer    Mannheim）推荐的方法用碱性磷酸酶作适当处理。加入1μl碱性磷酸酶（CIP）后，将反应混合物于37℃保温30分钟並用苯酚处理以除去酶，再以上述方法纯化DNA。最后将纯化的质粒DNA重新悬浮于TE缓冲液中。

实施例2

来自于大肠杆菌ATCC    11303的DNA部分消化。

依照Marmur的方法（J.Mol.Biol.53，155-162（1961））自大肠杆菌ATCC    11303分离总DNA。用限制性内切酶Sau3A部分酶切，使所得片段大部分在20-30Kb大小的范围内。为此目的，须进行预试验以确定DNA和酶的最适比例以及酶作用于DNA的最适时间。所用的适当方法已在BRL出版的出版物“focus”第7卷2期（1985）第3页上述及。过了最适反应时间之后，于65℃加热10分钟使酶降解，並使用适当的DNA标志物（如用EcoRI酶切的噬菌体λDNA），经琼脂糖凝胶电泳法检验所得DNA片段是否有预期的长度范围。

实施例3

连接限制性酶切混合物

将预先用Sau3A部分酶切的大肠杆菌ATCC 11303的总DNA与已用BamHI部分酶切並用碱性磷酸酶处理过的pIMS6062装配型质粒DNA，以大约1∶5的摩尔比例混合。按New England Biolabs制造商所介绍的方法将所得混合物以离子浓度最适于T₄DNA连接酶之作用效果的方式与几倍浓缩的缓冲液混合，並将该混合物与1μl连接酶于16℃保温至少14小时。该反应混合物的总体积为50μl，且总DNA浓度为20μg/ml。

实施例4

λ噬菌体的包裹

连接酶反应之后，将实施例3所得DNA于体外包裹到λ噬菌体头部。可用Hohn，B.的方法（in Wu，R.e

itor：Recombinant DNA，Methods in Enzymology，Vol.68，Academic Press，New York，Pages 299-309（1979））制得或由Boehringer Mannheim公司或Amersham Buchl公司（Braunschweig）购得为此目的所必须的两种不同细菌菌株的提取物。

将3μl依实施例3方法制得的混合物，在冰中冷却同时与Amersham公司提供的细菌提取物（已于放前融解）混合。将混合物于20℃保温30-60分钟之后，加入200μl SM缓冲液（100mM NaCl 10mM MgSO₄，50mM tris-HCl（pH7.5）、0.01%明胶）。该混合物可直接用于转导反应或加10μl氯仿后于4℃储存备用。

实施例5

大肠杆菌DG30的转导

将0.4%麦芽糖加到5ml    L培养液（1%    Bacto    Tryptone、0.5%酵母提取物和0.5%NaCl）内，将混合物与50μl处于生长静止期的大肠杆菌DG 30的液体培养物混匀，于37℃保温12小时直至达到早期静止期。离心收集细菌並小心地再悬浮于2.5ml 10mM的MgCl₂水溶液中。将实施例4中制得的10μl混合物与20μl浓缩的细菌悬液混合，並于室温下将混合物保温50分钟。

之后加入200μl    L培养液，並于37℃保温1小时，同时间断摇动。取50μl等份的混合物在含有20μg/ml四环素的LB培养液琼脂上铺板。将琼脂板于37℃保温至少12小时。依所述方法，有可能由混合物获得平均约1000个菌落。

实施例6

携带aspC或iLvE或tyrB基因的大肠杆菌DG    30菌株的选择

按已述方法在含有20μg/ml四环素的L培养基琼脂板上转录大肠杆菌DG    30菌株后得到约800个菌落，並将其采集到基础培养基琼脂板上。基础培养基琼脂板由含葡萄糖的M9培养基配制而成（M：ller，Experiments    in    Molecular    Genetics，Cold    Spring    Harbor，1972）並添加有异亮氨酸、亮氨酸缬氨酸、天冬氨酸和苯丙氨酸等氨基酸。但培养基内没有加菌株DG30现仍不能合成的酪氨酸。800个菌落中，有7个能在基础培养基上生长。

为了区分大肠杆菌DG    30中三个可能的基因aspC、iLvE和tyrB，将这7个菌落再采集到添加了除各种情况中一种以外所列氨基酸的上述基本培养基中，对于每种情况，由上述基因之一编码的每种转氨酶均表现有底物特异性。结果显示于下表中：

含下列一种外补充氨基酸

克隆    的基础培养基    假定的基因

Asp    Leu    Ilu    Tyr

1    +    +    -    +    tyrB

2    +    +    -    +    tyrB

3    -    +-    +    +-    iLvE

4    -    +-    +    +-    iLvE

5    +    +    -    +    tyrB

6    +    +    -    +    tyrB

7    -    +-    +    +-    iLve

+＝满意的生长

+-＝生长差

-＝不生长

实施例7

iLvE基因的定位

按照Maniatis等（Cold    Spring    Harboy，P366-370    1982）的方法，经微溶解由实施例6克隆1-7中，制得装配型质粒DNA，然后将该装配型质粒DNA引入大肠杆菌DH    1（ATCC    33849），其可以由该菌株中以高产率再次进行分离。

从大肠杆菌DH    1菌株中分离质粒DNA，並依照制造商（New    Enghand    Biolabs）介绍的方法用限制性内切酶Sal    1和SmaⅠ完全消化之。同样用SalⅠ、PvuⅡ和AvaⅠ酶完全切断载体pBR322（用AvaⅠ酶切是为了防止原来PBR322的SalⅠ-SmaⅠ片段回复连到载体中）。将两种DNA混合並按实施例4中所述的方法连接在一起，然后用一等份的（如10μl）连接酶混合物转化大肠杆菌ATCC    11303菌株的感受态细胞。在含有50μg/ml氨苄青霉素的L培养基琼脂平板上选择抗性菌落，用微溶解法分离质粒DNA，经用限制性内切酶SalⅠ完全消化並检查载体DNA长度的变化。

实施例8

使用特定试验方法检验例7中所得克隆的脂族转氨酶（即iLvE的基因产物）活性。用未转化的起始菌株ATCC    11303与转化后的起始菌株ATCC    11303进行比较。结果表明，含有iLvE基因的转化菌株的脂族转氨酶的活性比未转化的起始菌株高10倍。

使用适当标志物作琼脂糖凝胶电泳，可以表明增加了iLvE基因活性的菌株有PBR    322载体，而且该载体DNA含有一个来自ATCC    11303菌株，大小约1MD的掺入片段。当用分离的质粒DNA再次转化无质粒菌株大肠杆菌ATCC    11303时，均可观察到iLvE基因活性增加约10倍。

实施例9

iLvE基因的温度诱导性表达

得自大肠杆菌ATCC 11303的DNA片段是作为约1MD的SalⅠ-SmaⅠ片段被克隆的，其载带iLvE基因但没有天然启动子。更确切地说，基因的表达是在已用SalⅠ和PvuⅡ酶切的PBR 322中克隆后，经过由PBR322的四环素启动子转录开始之后，再翻译相应于iLvE的mRNA而完成的。虽然来自PBR322的四环素启动子的功能相当强並能得到理想的蛋白产量，但它不能通过温度的变化而进行调节。为了利用温度的变化来调节iLvE的表达，用其上有λ噬菌体的PR启动子和温度敏感性阻遏物基因CI 857的SalⅠ-EcoRI片段取代在iLvE的5′末端携带四环素启动子的SalⅠ-EcoRI片段。载体pCQV₂被用作这个片段的来源（Queen，J.Molec and Applied Genetics，2（1983）1-10）。用限制性内切酶EcoRI和SalⅠ完全消化载体PCQV2。同样用这些酶完全消化实施例8中制得的载体。这就必需将特定的酶同时加到DNA中，並在REB缓冲液〔50mM NaCl、10mM tris-HCl、PH7.5;6mM 2-巯基乙醇、6mM MgCl₂、100μg/ml小牛血清白蛋白、0.01%非离子表面活性剂（^RTriton X-100）〕中于37℃将混合物保温1小时。混合物的总体积为50μl，DNA浓度为20μg/ml。对各5μl等分的混合物作琼脂糖凝胶电泳，以检验酶消化的完全性。于65℃将两种混合物加热10分钟，经用苯酚处理除去限制性内切酶，用乙醇沉淀之后用70%强度乙醇洗，以纯化切断的质粒DNA。真空干燥后，将DNA分别再悬浮于50μl TE缓冲液中，並将各10μl混合物吸入同一容器内。调整混合物使适合于制造商（New England Biolabs）推荐的T₄DNA连接酶反应的培养基，並加入10单位T₄DNA连接酶。将混合物于16℃保温16小时之后，用10μl等分的连接酶混合物转化大肠杆菌菌株HB    101的感受态细胞。选择氨苄青霉素抗性菌落，微溶解之后，用限制性内切酶SalⅠ和EcoRI对得自这些克隆的质粒DNA作双酶消化。作琼脂糖凝胶电泳有可能鉴定出含有预期基因片段的克隆。

将用这种方法鉴定的两个克隆于30℃或37℃培养于LB培养基（Miller，Loc.cit）中。分析结果表明，由37℃培养的细菌所得iLvE基因产物之酶活性的数值为无质粒对照菌株的5-10倍。而30℃培养的菌株酶的活性实际上与无质粒对照菌株完全相同。反之，如果将细菌培养于30℃，然后于65℃水浴中摇动使培养物的温度提高到45℃，再将培养物于37℃保温2小时，酶的活性至少增加10倍。

Claims (7)

1、一种复制性的、含“染色体外”的含iLvE基因的结构基因的制备方法，其包括自大肠杆菌ATCC11303中分离iLvE基因，並克隆到质粒中。

2、根据权利要求1的方法，其中所使用的质粒为多拷贝质粒。

3、根据权利要求2的方法，其中所用的质粒为PBR322。

4、一种在微生物体内过量产生分支链氨基酸的方法，其包括

a）将按权利要求1的方法制得的染色体外结构元件插入到微生物体内;

b）在微生物体内表达iLvE基因，並合成活性脂族转氨酶，以及

c）借助转氨酶完成相关酮前体的胺化作用。

5、根据权利要求4的方法，其中微生物是肠道菌。

6、根据权利要求5的方法，其中微生物是大肠杆菌。

7、根据权利要求6的方法，其中微生物是大肠杆菌ATCC11303及其变种。