NO874490L - Kloning og anvendelse av transaminasegenet ilv-e. - Google Patents

Description

Siste trinn av de nova-syntesen av alifatiske aminosyrer består i aminering av de tilsvarende ketoforstadier ved hjelp av en transaminase. Enskjønt forskjellige transaminaser er istand til å gjennomføre transamineringsreaksjoner som fører til alifatiske aminosyrer oppfylles denne funksjon i cellen hovedsakelig av den såkalte alifatiske transaminase. Den genetiske forkortelse for genet av den alifatiske transaminase er ilv-E (Umbarger, Ann. Rev. Biochemistry 47 (1978), 533-606). I tilfelle av E.coli K12 er stillingen av genet på "bakteriekromosomet" nøyaktig kjent, og genproduktet har fått E.C.-nummer 2.6.1.42 (Bachmann et al., Microbiological Reviews 44 (1980), 1-56).

I den europeiske patentsøknad (EP-A) 0 116 860 beskrives isoleringen av ilvE-genet fra E.coli K12 samt kloneringen av dette aminotransferasegen på et multi-kopy plasmid. Spesi-fike angivelser til aktiviteten hadde klonerte ilvE genpro-dukt gjøres imidlertid ikke. I EP-A 0 152 275 nevnes at ved kloneringen av ilvE-genet kan det oppnås en økning av enzymaktiviteten. Angivelser over en utbytteøkning av alifatiske aminosyrer finnes imidlertid ikke.

Det ble nu overraskende funnet at isoleringen i E.coli ATCC 11303 tilstedeværende ilvE-gen og dets klonering på et multi-kopy-plasmid etter transformering av utgangsstammen med dette plasmid, resulterer i en minst 3-5 gangers økning av utbyttet av den respektive aminosyren.

Oppfinnelsen vedrører følgelig:

1. Et repliserende ekstra kromosomalt element som inneholder det fra E.coli ATCC 11303 isolerte ilvE-gen. 2. Anvendelsen av det under punkt 1 nevnte ekstra kromosos-male element til syntese av alifatiske aminotransferaser. 3. Anvendelsen av det under punkt 1 nevnte ekstra kromosomale element til overproduksjon av forgrenede aminosyrer i mikroorganismer som erkarakterisert vedat a) det ekstra kromosomale element innbringes i en mikroorganisme , b) ilvE-genet i denne mikroorganisme eksprimeres og en aktiv alifatisk transaminase syntetiseres og c) transaminasen bevirker aminering av de tilsvarende keto-forstadier.

Oppfinnelsen forklares nærmere i den følgende beskrivelse respektivt defineres i patentkravene.

Foruten villtypen E.voli ATCC 11303 kan det også anvendes dets varianter og mutanter. Eksempelvis kan det også anvendes en etter kjente metoder mutert stamme [E. Adelberg et al., Biochem, Biophys., Res. Comm. 18, 788 (1965)], som ble seleksjonert på overproduksjon av forgrendede aminosyrer. Den alifatiske aminotransferase fra E.coli ATCC 11303 for hvilke ilvE-genet koderer, syntetiserer bl.a. valin, leucin, isoleucin, fra de respektive keto-forstadier, idet en aminogruppe transfereres fra glutamat. Dertil kan det ved hjelp av den alifatiske transaminase også syntetiseres fenylalanin og glutaminsyre. Ved siden av produktet av ilvE-genet finner det seg som produkter av andre gener ytterligere transaminaser i E.coli-cellen.

Eksempelvis katalyserer den aromatiske transaminase produkter av tyrB-genet, syntesen av fenylalanin, thyrosin, aspartat og leucin, og produktet aspC-genet syntesen av aspartat, glutamat, fenylalanin og tyrsosin. Riktignok viser hver av de nevnte transaminaser også en svak aktivitet ved syntesen av aminosyrer, som egentlig mere spesifikt er å tilordne en av de to andre transaminaser.

For ytterligere å øke syntesen av forgrenetkjedede aminosyrer, kloneres ilvE-genet som koderer for den alifatiske aminotransferase. Man oppnår dette ved isolering av DNA fra E.coli ATCC 11303. Etter partiell fordøying av DNA, blir de dannede fragmenter som beveger seg i størrelsesområdet på 20- 30 kb, ligert i et kosmid med en replikon som formidler et vidt vertsområde og pakkes i hodet av X-fagen. Fortrinnsvis anvendes kosmidet pIMS 6026. Kosmidet pIMS 6026 avleder seg fra kosmidet pLAFR 1 (ATCC 37167) ved at i det eneste EcoRI-snittstedet av kosmidet pLAFR 1 ble det klonert det handels-vanlige EcoRI fragment (Phaarmacia, Upsala, Sverige), hvorpå kanamycin-resistensgenet av transposons Tn 903 ligger. Ved fordøyning med BamHI og etterfølgende religasjon, kan den største del av kanamycin-genet deleteres således at det blir tilbake et kort stykke DNA som insesjon, hvori blankeres et BamHI snittsted av 2 EcoRI snittsteder. Dette BamHI snittsted som ikke er tilstede på kosmidet pLAFR 1 kan anvendes for kloneringen. Ved inkubasjon av det pakkede kosmid med en tilsvarende form beredt E.coli DG 30-suspensJon, innsluses kosmidet i mikroorganismen. E.coli DG 30 har en defisiens i de tre transaminaser aspC, ilvE og tyrB. Stammen vokser derfor riktignok problemløst på fullmedium, må imidlertid ved vekst for minimalmedium forsørges med forskjellige aminosyrer utenifra, da det selv ikke kan syntetisere dem. Ved egnet valg av medium, kan det ved hjelp av stammen undersøkes om en utenifra opptatt DNA kan komplementere den kromosomale defekt for en bestemt transaminase. Innslusingen av ilvE-genet detekterer man ved vekst av E.coli DG 30 på et thyrosinfritt minimalmedium. På dette medium kan det bare vokse kloner som ved opptak av aspC-, tyrB- eller ilvE-holdig DNA som opprinnelig stammer fra stammen E.coli ATCC 11303, kan komplementere deres kromosomale defekt for syntesen av thyrosin. De tre transaminaser som koderes fra genene aspC, tyrB og ilvE adskiller seg i deres substratspesifitet, enskjønt de alle tre er istand til å danne thyrosin.

Den aromatiske transaminase som koderes fra genet tyrB kan eksempelvis ikke danne isoleucin fra keto-forstadiet, men imidlertid syntesiere leucin i gode utbytter fra de tilsvarende keto-forstadier. Transaminasen som koderes fra genet aspC kan hverken danne isoleucin eller det er effesient i omsetningen til leucin. ilvE genproduktet bevirker imidlertid et godt utbytte av isoleucin.

Følgelig kan de enkelte kloner ved vekst på et minimalmedium som inntil en for de respektive gen karakteristiske aminosyre er supplementert med for stoffskiftet essensielle aminosyrer, adkilles med hensyn til den dannede transaminase. På denne måte seleksjoneres herav kloner av DG 30 stammen som inneholder ilvE-genet.

Det må nå undersøkes om klonen også virkelig har ilvE-genet. Hertil må plasmid-DNA isoleres fra klonen. Isoleringen fra stammen DG 30 lykkes imidlertid bare med vanskeligheter. Det kan riktignok fåes plasmid-DNA, imidlertid bare i små utbytter. Etter minilyse transformeres derfor en E.coli stamme med kosmid-DNAs fra de interessante kloner hvorav det deretter kan reisoleres det innslusede DNA i gode utbytter. E.coli DH1 (ATCC 33849) er spesielt egnet hertil.

I neste trinn ligeres det reisolerte kosmid DNA med en vektor av høyt kopitall. Fra det kromosomale genkart av stammen E.coli K12 er det kjent at ilvE-genet er lokalisert på et Sall-Smal-fragment. Dette fragment inneholder bare struktur-genet av IlvE, imidlertid ikke den naturlige promotor. Nu består den mulighet at dette også er tilfelle ved E.coli ATCC 11303. Av denne grunn anvendes som vektor fortrinnsvis et multi-kopy-plasmid som muliggjør en klonering av Sall-Saml-fragmentet således at den klonerte sekvens kommer under kontroll av en på plasmidet tilstedeværende promotor. Spesielt foretrukket er det i sin sekvens kjente handelsvan-lige pBR322.

Kosmidet DNA fordøyes fullstendig med enzymet Sali og Saml, vektoren med restriksjonsenzymene Sali og PvuII. De to DNA hører sammen, ligeres med hverandre og kompetente celler av en vertsorganisme, hvori produksjonen av forgrenetkjedede aminosyrer skal økes, transformeres dermed. Fortrinnsvis anvendes enterobakter, spesielt E.coli, Idet E.coli ATCC 11303 samt dets mutanter og varianter er spesielt foretrukket. Resistente kolonier seleksjoneres over ampicillin, fra de tilsvarende kolonier isoleres ved minilyse plasmidet DNA, og ved fullstendig fordøyning med restriksjonsenzymet Sali undersøkes vektor DNA på størrelsesendring. Ved restrik-sjonsanalyse sikres at alle i det opprinnelige DNA avsnitt inneholdte Sall-Smal fragmentet på denne måte er blitt subklonert. Kloner som respektivt inneholder et av disse Sall-Smal fragmentet undersøkes endelig ved hjelp av en litteraturkjent prøve (Duggan et al., Anal. Biochem. 51

(1973) 67-69) på aktiviteten av den alifatiske transaminase, altså genproduktet av IlvE. På denne måte lar det seg oppnå en økning av ilvE-aktivteten rundt en faktor på mer enn 10. Ved agarose-gelelektroforese kan det vises at i vektoren av vertstammen er det inneholdt ca. 1 MD stort fragment fra ATCC 11303.

Oppfinnelsen skal forklares ved hjelpav noen eksempler, hvor prosentangivelsene hvis intet annet er angitt refererer seg til vekt.

Eksempel 1.

Isolering og fordøyning av kosmidet pIMS 6026 fra E.coli).

For isolering av kosmidet pIMS 6026 fra E.coli ble det enten gått frem ifølge Humphreys et al., (Biochem. Biophys. Acta 383, 457-63) (1975)) eller i gjennomført en alkalisk lyse ifølge Birnboim og Doly [Nucleic Acids Res. 7: 151] i 10 ganger større målestokk. I hvert tilfelle ble plasmidet DNA minst renset 1 gang ved hjelp av CsCl/EtBr-tettgradientsen-trifugering.

Kosmidet pIMS 6026 ble fordøyd fullstendig med restriksjonsenzymet BamHI, idet det ble gått frem etter angivelser fra fremstilleren New England Biolabs. Til undersøkelse av fullstendigheten av denne fordøyning, ble en alikvot av restriksjonsblandingen påført fra en 0,8#-ig agarosegel og underkastet elektroforesen. Fremtreden bare av ett bånd etter fargning med et til etidlumbromid og bestråling med kortbølget UV-lys (254 nm) tjente som henvisning på en fullstendig fordøyning. Fra det fordøyede kosmid DNA ble restriksjonsenzymet fjernet ved fenolisering, DNA utfelt ved hjelp av etanol, vasket med 70#-ig etanol og etter tørkning under vakuum opptatt i et egnet volum av TE-puffer (lOmM tris; 1 mM EDTA, pH 8,0). Etter valg ble det dessuten gjennomført en behandling med alkalisk fosfatase etter fremstillerens angivelser, Boehringer Mannheim. Etter tilsetning av 1 pl av alkalifosfatse (CIP) ble det inkubert 30 minutter ved 37°C, enzymet ble fjernet ved fenolisering fra reaksjonsblandingen, og DNA renset som angitt ovenfor. Endelig ble det resuspendert i TE-puffer.

Eksempel 2.

Partiell fordøyning av DNA fra E.coli ATCC 11303.

Isoleringen av det samlede DNA fra E.coli ATCC 11303 ble gjennomført etter metoden av Marmur i J.Moi.Biol. 53, 155-162, (1961). Isolerte samlede DNA ble fordøyet partielt med restriksjonsenzymet Sau3A således at det hovedsakelig oppsto fragmenter i et størrelsesområde på 20-30 kb. Dertil ble det i forforsøk fastslått det hertil optimale forhold mellom DNA og enzym, som den optimale innvirkningsvarighet av enzymet på DNA. Den tilsvarende fremgangsmåte er omtalt idet av firma BRL utgitte hefte "focus", vol. 7, nr. 2 (1985 ) på side 3. Etter utløp av den optimale bestemte reaksjonstid ble enzymet ødelagt ved oppvarmning ved 65° C over et tidsrom på 10 minutter, og dannelsen av DNA-fragmeriter I det ønskede størrelsesområdet undersøkt ved agarosegel elektroforese med egnede DNA-markerere f.eks. med EcoRI fordøyd DNA av fagen X.

Eksempel 3.

Ligasjon av restriksjonsblandingene.

Med Sau3A partielt fordøyet samlet DNA fra E.coli ATCC 11303 ble bragt sammen med pIMS 6026 kosmid DNA som var blitt fullstendig spaltet med BamHI og behandlet med alkalisk fosfatase i det molart forhold på ca. 1:5. Den resulterende blanding ble blandet med en flere ganger konsentrert buffer ifølge angivelsen av New England Biolabs således at det resulterte i en for enzymet T4-DNA-1igase optimal ionekonsen-trasjon og inkubert med 1 pl av enzymet i minst 14 timer ved 16°C. Blandingen samlede volum utgjorde derved 50 pl med en samlet DNA konsentrasjon på 20 pg/ml.

Eksempel 4.

Forpakning i X-fagen. Etter foretatt ligasereaksjon ble ifølge eksempel 3 dannet DNA forpakket in vitro i hodet av X-fagen. De dertil nødvendige ekstrakter av to forskjellige bakteriestammer kan fremstilles ifølge Hohn.B., i Wu, R., redaktør: Recombinant DNA, Methods in Enzymology, vol. 68, Academic Press, New York, side 299-309 (1979), eller refereres fra Boehringer Mannheim eller Amersham Buchler, Braunschweig. 3 pl av den ifølge eksempel 3 dannede blanding ble grundig blandet med umiddelbart på forhånd opptinede bakterieekstrakter fra firmaet Amersham under Isavkjøling. Blandingen ble inkubert 30-60 minutter ved 20°C og deretter tilsatt 200 pl SM-puffer (100 mM NaCl, 10 mM MgS04, 50 mM tris-HCl (pH 7,5), 0,01* gelatin). Denne blanding ble enten anvendt direkte i en transduksjonsreaksjon eller etter tilsetning av 10 pl kloroform oppbevart til senere anvendelse ved 4°C.

Eksempel 5.

Transduksjon av E.coli DG 30.

5 ml L-buljong bestående av 1# Bacto-trypton, 5* gjærekstrakt og 0,556 NaCl, ble tilsatt 0,456 maltose og podet med 50 pl av en væskekultur av E.coli DG 30 i den stasjonære vekstfase. Det ble inkubert 12 timer ved 37°C inntil det var oppnådd en tidlig stasjonær fase. Bakteriene ble frasentrifugert og forsiktig resuspendert i 2,5 ml av en vandig oppløsning som var 10 M molar på MgCl2. 10 pl av blandingen ifølge eksempel 4 ble blandet med 20 pld av den konsentrerte bakteriesuspen-sjon og inkubert 50 minutter, ved værelsestemperatur.

Deretter ble det tilsatt 200 pl L-buljong og inkubert 1 time ved 37°C, idet blandingen under tiden ble rystet.

Respektivt 50 pl av blandingen ble utplattert på L-buljong agar som inneholdt 20 pg/ml tetracyklin. Platene ble minst dyrket 12 timer ved 37°C. Ved den omtalte fremgangsmåten kunne det av blandingen gjennomsnittlig fåes 1000 kolonier.

Eksempel 6.

Seleksjonering av E.coli DG 30 med et AspC- eller ilvE- eller tyrB-gen.

Rundt 800 kolonier som var blitt dannet etter transduksjon av E.coli DG 30 ved den omtalte fremgangsmåte på L-buljong agar som inneholdt 20 pg/ml tetracyklin, ble "prikket" på minimal agar. Minimal agaren besto av M9-medium med glukose (Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor, 1972), som var blitt supplementert med aminosyrene isoleucin, laucin, valin, asparaginsyre og fenylalanin. Aminosyren til thyrosin som likeledes ikke mere kan syntetisere stammen DG 30, ble imidlertid ikke satt til mediet. Av de 800 "prik-kede" kolonier, kunne 7 vokse opp på minimalmediet.

Til adskillelse av de tre mulige gener aspC, IlvE og tyrB i E.coli DG 30, ble disse 7 kolonier igjen "prikket" på ovennevnte minimalmedium, som var supplementert med de oppførte aminosyrer inntil respektivt en, for hvilke en av transaminasene som koderes fra et av genene, viser substratspesifitet. Resultatet er oppført i følgende tabell:

Eksempel 7.

Lokalisering av ilvE-genet.

Ved en minilyse ifølge Maniatis et al., Cold Springs Harbor, side 366-370 (1982), ble det fremstilt kosmid-DNA av klone 1-7, som ble dannet ifølge eksempel 6. Deretter ble dette kosmid-DNA Innsluset i E-coli DH1 (ATCC 33849) hvorav det igjen kunne reisoleres i gode utbytter.

Det ble ble Isolert plasmid-DNA som opprinnelig ble fremstil-let fra klonet e av E.coli DG 30 (eksesmpel 6) fra dette DNA transformert stamme E.coli DH 1 ble Isolert, og fullstendig fordøyet med restriksjonsenzymene Sali og Smal idet det ble fulgt angivelser fra fremstilleren New England Biolabs. Likeledes fullstendig fordøyet med enzymene Sali, pvull og Aval ble vektoren pBR322. Fordøyningen med Aval skal hindre tilbakelegering av det fra pBR322 stammende Sali, Saml fragmentet i vektoren. De to DNA ble ført sammen, ligert med hverandre i den i eksempel 4 allerede omtalte alikvote, og kompetente celler av stammen E.coli ATCC 11303 transformert med en alikvot av ligaseblandingen f.eks. 10 pl. Resisitente kolonier ble seleksjonert på L-buljongplater som inneholdt 50 pg/ml ampicillin ved minilyse isolert plasmid-DNA, og ved fullstendig fordøyning med restriksjonsenzymet Sali undersøkt vektoren DNA på størrelsesendring.

Eksempel 8.

Undersøkelse av transaminaseaktivitet.

De ifølge eksempel 7 dannede kloner ble undersøkt ved hjelp av nevnte prøve på aktiviteten av den alifatiske transaminase, altså genproduktet av ilvE. Som sammenligning tjente den ikke-transformerte utgangsstamme E.coli ATCC 11303. Derved kunne det i et tilfelle måles en tydelig økning av ilvE-aktiviteten, nemlig rundt faktoren større enn 10 i forhold til utgangsstammen E.coli ATCC 11303.

Ved hjelp av agarose gelelektroforese under anvendelse av egnede markører kunne det vises at i stammen som har øket ilvE genaktivitet, var det inneholdt en pBR322-vektor, som inneholder et rundt 1 MD stort fragment av ATCC 11303. Ble med den isolerte plasmid-DNA igjen transformert den plasmid-løse stamme E.coli ATCC 11303, så kunne det i ethvert tilfelle iakttas en økning av ilvE genaktiviteten rundt en faktor på større enn 10.

Eksempel 9.

Temperaturinduserbar ekspresjon av ilvE-genet.

Det som SalI-Smal-fragment av rundt 1 MD klonert DNA-fragment fra E.coli ATCC 11303, har ilvE-genet uten den naturlige promotor. Heller foregikk ekspresjonen av genet etter klonering i Sall-Pvull fordøyet pBR322 ved transkripsjon utgående fra tetracyklinpromotor fra pBR322 og etterfølgende translasjon av det til ilvE korresponderende mRNA. Tetracyk-linpromotoren av pBR322 er riktignok relativt sterk og fører til gode proteinutbytter, kan imidlertid ikke reguleres ved temperaturendring. For å gjøre ekspresjonen av ilvE tempera-turregulerbar, utveksles det tetracyklin promotor-holdige Sall-EcoRI fragment på 5'-enden av ilvE-genet med dets Sall-EcoRI-f ragment, hvorpå Pjj-promotoren av genet X samt det temperatursensitive repressengen clg5y er lokalisert. Som kilde for dette fragment tjener vektoren pCQV2 (Queen, J. Molec. and Applied Genetics 2 (1983) 1-10). Vektoren pCQV2 fordøyes fullstendig med restriksjonsenzymene EcoRI og Sali. Likeledes fullstendig fordøyet med disse enzymer blir vektoren som fremstilles ifølge eksempel 8. Hertil tilsettes de respektive enzymer samtidig til DNA, og blandingen inkuberes i REB-puffer [50 mM NaCl, 10 mM tris-HCl, pH 7,5; 6 mM 2-merkaptoetanol, 6 mM MgCl2, 100 pg/ml storfeserumalbu-min, 0,01* ikke-ionisk tensid ("Triton-X-100")] i 1 time ved 37" C. Blandingens samlede volum utgjør 50 pl ved en DNA- konsentrasjon på 20 pg/ml. Ved agarose gel-elektroforese av en 5 pl alikvot av de to blandinger, undersøkes fordøyningens fullstendighet. De to blandinger oppvarmes 10 minutter ved 65° C, restriksjonsenzymene fjernes ved fenolisering og det snittede plasmid-DNA renses ved etanolutfelling samt etter-følgende vasking med 70#-ig etanol. Etter tørking under vakuum resuspenderes de respektive DNA i 50 pl TE-puffer, og 10 pl av de to blandinger sammenpipetteres. Blandingen innstilles på det av fremstilleren (New England Biolabs) som optimalt for enzymet T4-DNA-ligase anbefalte miljø, og blandes med 10 enheter av enzymet T4-DNA-ligase. Blandingen inkuberes 16 timer ved 16" C og deretter transformeres kompetente celler av E.coli stammen KB 101 med en 10 pl alikvot av ligaseblandlngen. Ampicillinresistente kolonier seleksjoneres og etter minilyse underkastes plasmid DNA fra disse kloner, en dobbeltfordøyning med restriksjonsenzymene Sali og EcoRI. Ved agarosegel elektroforese kan kloner identifieres som inneholder plasmider ved det ventede fragmentmønster.

To av de således identifiserte kloner dyrkes i LB-medium (Miller, se ovenfor), idet inkubasjonstemperaturen utgjør 30" C respektivt 37"C. Undersøkes enzymaktiviteten av ilvE genproduktet fra ved 37°C dyrkede bakterier, så viser det seg en verdi som ligger rundt en faktor på 5-10 over den for en plasmidløs sammenligningsstamme. Undersøkes enzymaktiviteten av den ved 30°C dyrkede klon, så er de målte verdier praktisk talt identiske de av en plasmidløs sammenligningsstamme. Dyrkes bakteriene derimot ved 30°C, økes kulturens temperatur deretter ved rystning i et 65°C varmt vannbad til 45°C, og kulturen deretter videre-inkuberes ved 37°C i 2 timer, så kan det måles minst 10 ganger økede enzymaktiviteter.

Claims (11)

1. Et repliserende ekstra-kromosomalt element, som inneholder det fra E-coli ATCC 11303 isolerte ilvE-gen.

2. Ekstrakromosomalt element ifølge krav 1, karakterisert ved at det er et multi-kopy-plasmid.

3. Ekstrakromosomalta element ifølge krav 2, karakterisert ved at multi-kopy plasmidet avleder seg fra pBR322.

4. Anvendelse av det ekstrakromosomale element ifølge et eller flere av kravene 1-3 til fremstilling av alifatiske transaminaser .

5 . Anvendelse av det ekstra kromosomale element ifølge et eller flere av kravene 1-3 til overproduksjon av forgrenetkjedede aminosyrer i mikroorganismer, karakterisert ved at a) det ekstrakromosomale element innbringes i en mikroorganisme , b) ilvE-genet i mikroorganismen eksprimeres og en aktiv alifatisk transaminase syntetiseres, og c) transaminasen bevirker aminering av de tilsvarende ketofortrinn.

6. Anvendelse ifølge krav 4, karakterisert ved at mikroorganismen er en enterobakterie.

7. Anvendelse ifølge krav 5, karakterisert ved at mikroorganismen er E.coli.

8. Anvendelse Ifølge krav 6, karakterisert ved at mikroorganismen er E.coli ATCC 11303 samt dets varianter og mutanter.

9. E.coli ATCC 11303 samt dets varianter og mutanter, transformert med det ekstrakromosomale element ifølge et eller flere av kravene 1,3.

10. ilvE-gen oppnådd fra E.coli ATCC 11303 samt dets varianter og mutanter.

11. Genstruktur bestående av ilvE-genet ifølge krav 10 under den temperaturregulerbare kontroll av X-P^ -promotoren.