CN87106856A - 甘油醛-3-磷酸脱氢酶的生产 - Google Patents

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Abstract

本发明揭示了从重组DNA中生成植物甘油醛磷酸脱氢酶的方法。还揭示了用重组DNA分子转化的宿主，该重组DNA分子含有一植物衍生的甘油醛磷酸脱氢酶顺序。

Description

本发明涉及用重组DNA技术生产甘油醛-3-磷酸脱氢酶。
甘油醛-3-磷酸脱氢酶是在糖酵解过程、糖元异生作用及碳固定过程中起作用的一种酶。人们发现，在植物，动物和细菌的胞液中，该酶催化甘油醛-3-磷酸转化为1，3-二磷酸甘油酸，在叶绿体中它催化此反应逆向进行，作为开尔文循环的一部分。
已确定了三种细菌的GAPDH序列：一种是从嗜常温细菌大肠杆菌中得到（Branlant    and    Branlant，Eur，J.Biochem.，150：61    1985），另外两种来自嗜热细菌即嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus    stearo    thermophilus）（Walker    et    al.，Eur.J.Biochem.，108：549    1980a）及水生栖热菌（Thermus    aguaticus）（Walker    et    al.，Eur.J.Biochem.，108：581，1980b）从大肠杆菌中得到的该酶与真核细胞胞液GAPDHs的同源性要大于从嗜热菌中得到的GAPDHs的同源性（Branlant    and    Branlant，1985）。基于序列对比分析和S环的疏水性质（残基178-201;见Walker    et    al.，1980a/b;Branlant    and    Branlant，1985），可以得出下述结论：GAPDH根据其热稳定性沿两条独立直线演化，因为曾有人建议，形成四聚体核心的S环的疏水性，决定全酶的热稳定性（Walker    et    al.，1980b）。因此，所观察到的真核细胞和嗜热菌GAPDHs氨基酸顺序的区别反映了嗜常温和嗜热生物之间的差别。
高等植物中具有两套糖酵解酶;胞液中的糖酵解酶在糖酵解过程中起作用，而叶绿体中的糖酵解酶在光合成固定碳过程中起作用（Gottlieb，Science，216：373，1982）。胞液的和叶绿体的糖酵解酶都由核基因组编码（Weeden    and    Gottlieb，J.Hered.，71：392，1980;Gottlieb，1982;Cerff    and    Kloppstech，Proc.Natl    Acad.Sci.（USA），79：7624，1982）。
高等植物中有两种叶绿体GAPDH同功酶（综述见Cerff，Methods in Chloroplast Molecular Biology，eds，Edelman et al.，Elsevier/North Holland，Amsterdam，683，1982），同功酶Ⅰ和Ⅱ，亚基结构分别为A2B2和A4，另外还有唯一的胞液GAPDH，亚基结构为C4。胞液GAPDHs结构为种间高度保守，跨越很大进化区间（Tso et al.，Nuc.Acid Res.，7：2485，1985a）。
叶绿体是植物的一种半自主细胞器，它的大多数功能需要由叶绿体和细胞核基因编码的基因产物参与。能得到并提供为植物GAPDHs，特别是为叶绿体衍生的GAPDHs编码的基因顺序是很有意义的。
本发明的目的在于提供一种从可以无限供给的植物叶绿体和胞液中，用遗传工程方法获得基本上纯的甘油醛-3-磷酸脱氢酶的新来源。
据本发明，编码从烟草（Nicotiana    tabacum）得到的叶绿体GAPDH（GapA和GapB）和胞液GAPDHs（GapC）的细胞核基因的cDNAs已被克隆并鉴定。
因此，本发明提供编码这些酶的遗传序列，含有这些序列的载体，以这些序列转化得到的宿主生产这些酶的重组DNA技术。
图1示出用自动Edman降解法测定的烟草叶绿体GAPDHs、A4及A2B2各亚基N-末端氨基酸顺序。
图2表示基于GAPDHs氨基酸顺序得到的GAPDHs寡核苷酸探针（见正文）。上面的一条表示蛋白质中该探针的相对位置及用于合成寡核苷酸探针的相应氨基酸顺序。下面的四条表示4个寡核苷酸探针的顺序。在寡核苷酸中具有4倍简并度处用“N”代表。
图3表示cDNA克隆从烟草叶至该4种合成寡核苷酸的杂交形式。
图4表示cDNA克隆的核苷酸顺序及推断出的烟草GAPDHs的氨基酸顺序。图中示出了用双脱氧核苷酸链终止法确定的cDNA克隆PG49（GapA），PG60（GapB），及PNDA1（GapC）的编码股的核苷酸顺序（a）以及相应推断出的烟草GAPDHs的氨基酸顺序（b）。a部分顺序后加了省略符号（……）以相应于最大同源性，编码顺序位于上方，3′未转译区域位于下方，过渡肽顺序用线分开以便与b部分比较。b部分示出了以单字母密码形式表示的推断的A多肽氨基酸顺序。加空白（X）是为了与B多肽及C多肽取得最大同源性;只示出了不同之处，即GapB或GapC线上的空白表示与GapA线相同，左侧的数字表示在不存在同源性空白时相应肽的氨基酸残基数。星号＊表示多肽末尾。
在下文中，大量使用了重组DNA技术中所用的许多术语。给出下列定义，以便对于说明书和权利要求书，包括这些术语的限定范围，提供清晰一致的理解。
基因。一段DNA序列，其通过它的模板或信使RNA编码具有某肽特性的氨基酸顺序。术语cDNA包括这样的基因，它们的插入顺序已除去。术语rDNA是一个分子，其在体外由拼接cDNA或基因组DNA顺序重新结合而成。
克隆载体。一段质粒或者噬菌体DNA或其它DNA顺序，该顺序可在宿主细胞中复制，具有一个或少量核酸内切酶识别位点，在这些位点上此DNA顺序可以用确定形式切割而不丧失该DNA的基本生物学功能，该顺序含有一适用于转化细胞鉴定的标记物。例如，四环素抗性或氨苄青霉素抗性标记物。“载体”这个词有时用作“克隆载体”。
表达载体。一种相似于克隆载体的载体，其能在一宿主中表达一已知结构基因，正常情况下受某种控制序列的控制。
表达控制序列。一段核苷酸序列，当其有效地与结构基因连接时能控制或调节结构基因的表达。这些序列包括lac体系（乳搪操纵子体系），trp体系（色氨酸体系），噬菌体λ的主要操纵子和启动子区域，fd覆盖蛋白质的控制区域及其它用来控制真核细胞和原核细胞中基因表达的序列。
操纵子。一段DNA顺序，能与特定阻遏物作用，从而控制邻近基因发挥作用。
启动子。一段DNA顺序，RNA聚合酶结合其上，并启动邻近基因的转录。
宿主。此术语在本发明中不仅包括原核细胞，还包括真核细胞如酵母，丝状真菌，以及植物和动物细胞。
原核细胞。本术语包括所有细菌，这些细菌能被用于表达GAPDH蛋白的GAPDH基因转化。
甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）。本术语贯穿整个说明书和权利要求书，指包括从任何植物中得到的，在体内或体外系统中具有酶活性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶。在本发明中本术语还包括任何天然产生的GAPDH相似物，同系物，突变体，异构体或衍生物。本术语还包括具有少于天然产生物氨基酸数目的片段，如天然GAPDH部分片段，其保持植物胞液或者叶绿体GAPDH的活性。本术语还包括下列任何产物，这些产物含有天然产生的植物GAPDH顺序，或一种类似物，具有一个或多个侧边氨基酸，这些产物显示GAPDH活性。
术语“基本纯化形式”，当用于本发明中的蛋白质时指该蛋白质基本无其它细胞蛋白质，用本发明生产的该酶在天然状态下通常与这些细胞蛋白质相结合。
本发明提供了以重组DNA技术生产植物甘油醛-3-磷酸脱氢酶的生物学方法。
植物GAPDH的遗传序列可从任何一种源组织，从而任何一种植物中得到。所需要的是该蛋白质的遗传序列在宿主生物中得到表达。
包含有编码GAPDH遗传序列的重组DNA分子可采用本领域普通技术人员熟知的任何一种方法用来转化宿主，尤其优选的是采用含GAPDH编码顺序的质粒来达到转化的目的。
制备融合的，有效连接基因并在细菌中表达同一基因的方法已知并示出，例如，在Riggs的美国专利4，366，246号中所示，通过在此引述合并于本文。
通常，含有启动子顺序的表达载体与宿主共用，这些启动子顺序使插入的GAPDH遗传顺序的有效转录变得易于进行。典型地，该表达载体含有一复制起点，启动子，终止区，以及能在转化的细胞中提供表现型选择的特定基因。转化的原核宿主可根据本技术领域已知的方法被发酵并培养以得到最佳细胞生长。能用于本发明的启动子例如：rec    A，trp，lac，tac，噬菌体λp    R或p    L。可用于本发明的质粒列于Maniatis    et    al.，Molecular    Cloning，See    Cold    Spring    Harbor    Laboratories，1982。
例如，典型地，用p    BR322，即从一种来自大肠杆菌的质粒（Bolivar，et    al.，Gene，2：95（1977））可将大肠杆菌转化。p    BR322含有氨苄青霉素抗性和四环素抗性基因，以此可方便地鉴定转化后的细胞，这种pBR322质粒或其它微生物质粒必须还含有，或被修饰后含有，能被微生物用来表达其自己蛋白质的启动子。常用于重组DNA构造的其它启动子包括β-内酰胺酶，（即青霉素酶）和乳糖（β-半乳糖苷酶）启动子体系（Chang，et    al.，Nature，275：615（1978）;Itakura，et    al.，Science，198：1056（1977）;Goeddel，et    al.，Nature，281：544（1979））和色氨酸（trp）启动子体系（Goeddel    et    al.，Nucleic    Acids    Res.，8：4057（1980）;EPO申请公开号为0036776）。
在另一实例中，编码GAPDH的遗传顺序与一可诱导启动子相连接，将所得到的遗传构造引入一表达载体。然后该表达载体用来转化一适当宿主，该宿主在正常条件下发酵，此条件下启动子无活性。在一段适当时间之后，例如当细胞处于静止期时，该启动子被外环境因素的改变所诱导，例如盐浓度，光，代谢物的存在与否，金属离子等等，这种改变导致GAPDH遗传顺序转录为mRNA，再从此翻译为GAPDH。可诱导的调节启动子例如λ，pL和pR，lac，gal，trp，ara，hut等等。
例如，GAPDH的遗传构造可置于噬菌体λ（pL）左向启动子的控制之下。这个启动子是已知最强可被控制的启动子之一。控制由λ阻遏物执行，邻近限制位点是已知的。这个基因的一个温度敏感性等位基因可被置于一含有GAPDH全部顺序的载体上。温度升至42℃，阻遏物失活，启动子在最高水平上被表达。在此条件下生产的mRNA的量足够形成一个细胞，该细胞中新合成的RNA约有10%来自pL启动子。在这个方案中，可建立一克隆库，其中一功能性GAPDH融合构造顺序被置于与核糖体结合顺序邻接处，距λpL启动子距离不等。检测这些克隆，筛选出给出最高产量的一个。
细菌宿主具有特殊意义。例如大肠杆菌K12 294菌株（ATCC31446）尤其有用。可以使用的其它微生物菌株包括大肠杆菌X1776（ATCC31537）。除了上面提到的菌株，也可使用大肠杆菌W3110（F-，λ-，原养型（ATCC27325）及其它肠道细菌如枯草杆菌（Bacillus subtilis），鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）或粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens），以及各种假单胞菌属。
此处制备的遗传构造及所采用的方法还可用来在很多不同宿主中表达GAPDH。这些宿主包括酵母和哺乳动物细胞培养物。还可以在体内或体外进行植物细胞中的不均一表达。常用酵母和哺乳类宿主及载体都是本领域普通技术人员熟知的，例如，可参见欧洲专利公开0093619，公布于1983年11月9日。
本发明包括根据这里描述的方法所修饰的任何宿主;或采用本领域普通技术人员已知的任何其它方法修饰所得到的任何宿主，这些常见方法例如用溶原性噬菌体转移遗传物质，得到表达植物GAPDH基因的原核或真核细胞。
用GAPDH基因顺序转化的原核细胞对生产GAPDH特别有用。
任何能够表达GAPDH基因的植物细胞和植物可以用本发明转化。这些植物还能被遗传工程技术进行遗传操作。这里所使用的“植物”一词包括植物细胞，植物原生质体，能被培养并诱导形成植物的植物组织培养物，植物愈伤组织，植物簇，和植物中完整植物细胞或植物一部分。“植物”这个术语还代表能被遗传工程技术转化的花粉。
可用于本发明的GAPDH编码区可能与被转化的植物细胞或植物同源或不同源。但编码GAPDH的遗传顺序应作为功能性酶或多肽被表达并产生于得到的植物细胞中。因此，本发明包括含有与表达GAPDH酶的同源基因或不同源基因的植物。此外，GAPDH可以来自其它植物品种。
来自编码GAPDH基因组DNA和cDNA的DNA可用于本发明。此外，GAPDH基因可构造成部分来自cDNA克隆，部分来自基因组克隆，此外，编码GAPDH基因的DNA可以包含来自不同的植物，微生物，和动物GAPDH酶的部分片段。
本发明此实例有不同方面。一方面，本实例包括嵌合遗传顺序：
（a）第一个遗传顺序对GAPDH活性是功能性的，此顺序在给定植物细胞中依据该基因的表达编码GAPDH多肽;
（b）一个或多个附加遗传顺序有效连接于GAPDH编码区的任一侧。这些附加遗传顺序含有编码植物细胞启动子或终止区的顺序。植物的调节顺序与宿主细胞可能同源也可能不同源。
可用于嵌合遗传顺序的启动子包括nos，ocs，及caMV启动子。
含有GAPDH基因的嵌合遗传顺序可被结合于一适当克隆载体，这段GAPDH基因有效地与一启动子连接，该启动子可在一植物细胞中操作。通常，采用质粒或病毒载体，它们含有复制顺序和控制顺序，这些顺序是从那些与植物宿主细胞相容的品种中衍生得到的。克隆载体典型地携带一复制起点，以及一些特殊的基因，它们能在转化的宿主细胞中提供一些表现型选择标记物，典型的是抗生素抗性或选择性除锈剂抗性。在宿主细胞中转化之后可根据这些表现型标记物选择转化载体。
用该载体转化的克隆载体和宿主细胞用于本发明，主要为了增加该载体的拷贝数目。随着拷贝数目的增加，含有GAPDH基因的载体可被分离，并且，例如，用来将嵌合遗传顺序引入植物细胞。
包含在该载体中的遗传物质可用微量移液管直接微量注射入植物细胞，以机械方法传递重组DNA。遗传物质还可用聚乙二醇转移入植物细胞。聚乙二醇与遗传物质形成一沉淀复合物，被细胞摄入。（Paszkowski    et    al.，EMBOJ.，3：2717-22（1984））。
本发明的另一实例中，GAPDH基因用电穿透法引入植物细胞（Fromm    et    al.，“Expression    of    Genes    Transferred    into    Monocotand    Dicot    Plant    Cells    by    Electroporation.”Proc.Nat′l    Acad.Sci，U.S.A.，82：5824（1985））。在这种技术中，在含有GS遗传构造的质粒的存在下，植物原生质体被电穿透。高场强电脉冲可逆地穿透生物膜，从而使质粒进入。被电穿透后的植物原生质体改变了细胞壁，分裂，形成植物愈伤组织。可以采用上面叙述的表现型标记物来筛选表达GAPDH酶的转化的植物细胞。
花耶菜花叶病毒（CaMV）在本发明中也可用作载体，将GAPDH基因引入植物细胞。（Hohn    et    al.，in“Molecular    Biology    of    Plant    Tumors”Academic    Press，New    York，1982    Pages549-560;Howell，United    States    Patent    No.4，407，956）。整个CaMV病毒DNA基因组插入一亲本细菌质粒，产生一能在细菌中增殖的重组DNA分子。克隆以后，在重组质粒的病毒部分用限制性内切酶于随机切点或唯一切点切割该重组质粒以便将GAPDH遗传顺序插入。也可插入一小的寡核苷酸，称为连接物，其具有一唯一限制性内切点。修饰后的重组质粒可再克隆，通过将GAPDH遗传顺序引入连接物的唯一限制性内切点而达到对重组质粒的再修饰。修饰后的重组质粒的病毒部分从亲本细菌质粒上外切下来，用于接种植物细胞或植物。
将GAPDH基因引入植物细胞的另一方法是用根瘤土壤杆菌（Agrobacterium    tumefaciens）感染植物细胞，该根瘤土壤杆菌是用GAPDH基因转化的。在本专业领域已知的适当条件下，转化的植物细胞形成茎，根，再发育为植物。GAPDH遗传顺序可引入适当植物细胞，例如，借助于根瘤土壤杆菌的Ti质粒。将Ti质粒转移至被根瘤土壤杆菌感染的植物细胞，并稳定地整合至植物基因组。Horsch    et    al，“Inheritance    of    Functional    Foreign    Genes    in    Plants”Science，233：496-498（1984）;Fraley    et    al.，Proc.Nat′l    Acad.Sci.U.S.A.，80：4803（1983）。
Ti质粒含有两个对产生转化细胞必不可少的区域。其中一个称为转移DNA（TDNA），可诱导瘤的形成。另一个称为毒性区，它对瘤的形成是必需的，而对瘤的维持则不是必需的。转移DNA区，其转移至植物基因组，可被GS基因顺序的插入而增大长度，但并不影响它的转移能力。移去瘤-产生基因以使它们不再干扰，修饰后的Ti质粒即可用作转移本发明基因构造至一种适当植物细胞的载体。
据本发明，所有能被土壤杆菌转化的植物细胞及从转化的细胞中产生的完整植物也可被转化以产生含有转移的GAPDH基因的转化的完整植物。
现有两种不同方法用土壤杆菌转化植物细胞：
（1）将土壤杆菌与隔离培养的原生质体共培养，或
（2）用土壤杆菌转化细胞或组织。
方法（1）需建立培养体系，能培养原生质体及从中产生的植物。
方法（2）需要，（a）能被土壤杆菌转化的植物细胞或组织;（b）转化的细胞或组织能被诱导产生完整植物。在二元体系中需二种质粒以便产生感染：一个是含T-DNA质粒，另一个是vir质粒。可采用众多含T-DNA质粒中的任何一个。唯一的要求是对这两种质粒中的每一种能独立选择。
在植物细胞或植物转化后，这些被Ti质粒转化以便表达GAPDH酶的植物细胞或植物可以用一种适当表现型标志所选择。这些表现型标志包括但不限于抗生素抗性或除莠剂抗性。其它表现型标志是本专业领域已知的，也可用于本发明中。
所有植物（从中可分离原生质体，并培养以产生整个再生植物）可用本发明方法转化，以便使含有转移GAPDH基因的整个植物再生。某些适当植物包括，例如，来自下列品系：草莓属（Fragaria），牛角花属（Lotus），苜蓿属（Medicago），驴喜豆属（onobrychis），三叶草属（Trifolium），胡芦巴属（Trigonella），豇豆属（Vigna），柑桔属（Citrus），亚麻属（Linum）， 牛儿苗属（Geranium），木薯属（Manihot），胡萝卜属（Daucus），拟南芥属（Arabidopsis），芥属（Brassica），萝卜属（Raphanus），芸苔属（Sinapis），颠茄属（Atropa），番椒属（Capsicum），曼陀罗属（Datura），莨菪属（Hyoscyamus），番茄属（Lycopersion），烟草属（Nicotiana），茄属（Solanum），矮牵牛属（Petunia），洋地黄属（Digitalis），墨角伦属（Majorana），Ciohorium，向日葵属（Helianthus），莴苣属（Lactuco），雀麦属（Bromus），Asparagus，金鱼草属（Antirrhinum），萱草属（Hemerocallis），龙面花属（Nemesia），天竺葵属（Pelargonium），黍属（Panicum），狼尾草属（Pennisetum），毛莨属（Ranunoulus），刘寄奴草属（Senecio），喇叭舌属（Salpiglossis），黄瓜属（Cucumis），茄属（Browallia），大豆属（Glycine），黑麦草属（Lolium），玉蜀黍属（Zea），小麦属（Triticum），高粱属（Sorghum）及曼陀罗属（Datura）。
已知实际上所有植物可从培养的细胞或组织中再产生，这些植物包括但不限于全部主要谷物品种，甘蔗，甜菜，棉花，水果和其它树木，豆类和蔬菜。关于这些植物能否被土壤杆菌转化的知识目前还很有限。土壤杆菌的天然植物宿主品系可在体外被转化。单子叶植物，特别是谷物和草，不是土壤杆菌的天然宿主。直至最近，用土壤杆菌转化它们的尝试也没有成功。Hooykas-Van    Slogteren    et    al.，Nature，311：763-764（1984）。现在表明某些单子叶植物可被土壤杆菌转化的证据正在加多。用当前已有的新的实验技术可以将谷物和草类转化。
另外一些可被土壤杆菌转化的植物包括：番薯属（Ipomoea），西番蓬属（Passiflora），欧紫罗兰属（Cyclamen），苹果属（Malus），李属（Prunus），蔷薇属（Rosa），悬钩子属（Rubus），杨属（Populus），檀香属（Santalum），葱属（Allium），百合属（Lilium），水仙属（Narcissus），凤梨属（Ananas），落花生属（Arachis），菜豆属（Phaseolus）及豌豆属（Pisum）。
下列文献中描述了从培养原生质体进行的植物再生：Evans    et    al.，“Protoplast    Isolation    and    Culture”in    Handbook    of    Plant    Cell    Culture，1：124-176（MacMillan    Publishing    Co.New    York    1983）;M.R.Davey;“Recent    Developments”Protoplasts，1983-    Lecture    Proceedings，pp.19-29，（Birkhauser，Basel    1983）;P.J.Pale，“Protoplast    Culture    and    Plant    Regeneration    of    Cereals    and    Other    Recalcitrant    Crops”in    Protoplasts    1983-Lecture    Proceedings，pp.31-41，（Birkhauser，Basel    1983）;及H.Binding，”，Regeneration    of    Plants”in    Plant    Protoplasts，pp.21-37，（CRC    Press，Boca    Raton    1985）。
再生依植物品系不同而有区别，但通常都首先制备一含有GAPDH基因拷贝的转化的原生质体悬浮液。然后从原生质体悬浮液中诱导形成胚胎，成熟，且象天然胚胎一样发芽。培养基通常含有多种氨基酸和激素，如生长素和细胞分裂素。加入谷氨酸和脯氨酸至培养基也较有利，特别是对于玉米和苜宿。通常茎和根一起发育。有效再生依赖于培养基，基因型和培养历史。如果这三个变量控制好，再生是完全可再现和重复的。
成熟的从转化的植物细胞中生长起来的植物，被同种繁殖产生纯系植物。该纯系植物产生含有具有GAPDH酶活性水平的基因的种子。
本发明的DNA分子或其部分可用可检测基团标记，并用作杂交检验时的探针。这种可检测基团可以是任何一种具有可检测化学或物理性质的物质。免疫检测领域已发展了许多这种物质，通常，几乎任何一种能用于免疫检测的标志物均可应用于本发明。特别有用的是具有酶活力的基团，如酶（见Clin Chem，22：1243，（1976）），酶底物（见英国专利说明书1，548，741），辅酶（见美国专利4，230，797及4，238，565）和酶抑制剂（见美国专利4，134，792）;荧光物（见Clin.Chem，25：353，1979）;生色团;发光团，如化学发光团和生物发光团（见Clin Chem，25：512，（1979））;可特异性结合的配基;近端作用对;放射性同位素如3H，35S，32P，125I，14C。检测这些标志物和标志对是基于它们自身的物理性质（如，荧光物，生色团和放射性同位素）或它们的反应性或结合性（如，酶，底物，辅酶和抑制剂）。例如，加入一种酶可检测辅助因子-标志探针，其中标志物是该酶的一个辅助因子和底物。例如，可采用这样一种酶，其与某一底物作用产生一具有可测物理性质的产物。这样的酶例如，但不限于，β-半乳糖苷酶，碱性磷酸酯酶和过氧化物酶。
本发明中具有特殊意义的是叶绿体GAPDH基因的克隆和表达。因此，优选实例为克隆基因，含同样基因的质粒和表达宿主。
用本发明的重组DNA分子转化的植物宿主可对除莠剂具有抗性或低感受性，除莠剂能阻断GAPDH的合成活性。
下列实例只为说明本发明，并不限制本发明的范围。
实施例1
GAPDHs的纯化
修改Cerff（1982）采用的方法，用来分离得到烟草叶绿体和胞液GAPDHs。如Cerff（1982）所述，将100克烟草叶匀浆，并进行硫酸铵分级分离。为纯化叶绿体同功酶Ⅰ（Iso Ⅰ），将55-70%饱和的硫酸铵馏分再用丙酮沉淀分级分离。将0～50%丙酮沉淀的蛋白质溶于19mlTEM缓冲液（10mM Tris，pH7.8，1mM EDTA，14mM2-巯基乙醇），并对41同样缓冲液透析过夜。透析物上DEAE Sephacel柱（2.5×10cm），预先用TEM缓冲液平衡。用400ml 0～0.3M NaCl梯度的TEM缓冲液洗脱GAPDH活性物。收集活性馏分，用一个MilliporeCX-30密封分子分离器浓集。GAPDH再用两个连续的Bio-RadA0.5M凝胶过滤柱（1.5×100cm），分别在0.2mM NDA+和0.1mMNADP+存在下进行进一步纯化（详见Cerff，1982）。为纯化叶绿体同功酶Ⅱ，将70～95%饱和硫酸铵馏分通过一个Sephadex G50柱（2.5×20cm）脱盐，然后用超滤法浓集（Amicon CFA25）。此馏分在0.2mMNDA+存在下进行凝胶过滤。大多数IsoⅡ活性（用NADPH和NADH作为底物）被以排除体积洗脱，而胞液GAPDH（只能用NADH作为底物）主峰在馏分Ve/Vo＝1.6处洗脱，浓集含有IsoⅡ的馏分并用NADP+凝胶过滤进一步纯化。收集含有胞液该酶的馏分，对HA缓冲液（其中含20mM KH2PO4，pH7.4，1mM EDTA，5mM2-巯基乙醇）透析，上羟基磷灰石柱（1.5×25cm），该柱预先以HA缓冲液平衡。然后用盐梯度为20mM至0.2M的KH2PO4洗脱GAPDH。
抗-A2B2和抗C4抗体
两只新西兰白兔各被注射200μg纯化的A2B2或C4GAPDH福氏完全佐剂。初次注射后四星期加强注射。加强后一星期将兔放血。然后，抗血清用硫酸铵沉淀（0～50%饱和度）法纯化，对含0.9%NaCl，10mM磷酸钠，pH7.2的缓冲液透析，冰冻保存。
N-末端氨基酸顺序分析
来自每种纯化的同功酶的蛋白质200μg，加入4体积甲醇/丙酮（v/v＝1∶1）沉淀之。将片状沉淀物干燥并重新悬浮于100μl1.5%三乙胺（HPLC级）。然后在自动的Applied    Biosystem    470A蛋白序列分析仪上对样品进行顺序分析。
实施例2
根据Miller    et    al.，Methods    in    Enzymology，101：650（1983）的程序进行杂交选择，增加于70℃，0.1×SSC，0.5%SDS的洗涤次数，以此修饰该方法关于丰富mRNA的部分。
实施例3
体外转译和免疫沉淀
根据供应者的说明，兔网织红细胞溶胞物（Bethesda Research Laboratories）可用于体外转译。抗血清在50mM KH2PO4，pH7.4，0.5M NaCl存在下，4℃，2小时，与蛋白质-A琼脂糖CL-4B（Pharmacia Inc）偶联，以进行免疫沉淀。该凝胶用含25mM Tris，pH7.6，0.15M NaCl，1mM EDTA，0.1%SDS的缓冲液冲洗三次。然后将体外转译产物与抗血清蛋白质-A琼脂糖复合物于4℃共同温育2小时，用同种缓冲液冲洗4次。将煮沸洗脱的免疫沉淀蛋白质直接加到10%SDS聚丙烯酰胺凝胶上。
实施例4
cDNA库的筛选
cDNAs是根据Gubler和Hoffman，Gene，25：626（1983）所述方法合成的。将cDNAs加以C-尾，与具有G-尾的pUC12载体连接，转化至大肠杆菌MC1061菌株。cDNA库的筛选是根据Hannahan及Meselson，Gene，10：63（1980）所述方法。用T4聚核苷酸激酶标志〔γ-P32〕ATP（＞3000Ci/mmol）于该寡核苷酸末端，用来作为探针。于低于Tm（Wallace et al.，1981）5℃下进行杂交，条件如下：6×NET（1×NET＝0.15M NaCl/1mM EDTA/15mMTris-HCl，pH7.5），5×Denhardt′s溶液，0.5%SDS，100μg/ml tRNA，10%葡聚糖硫酸酯，16至24小时。室温下冲洗滤器2次，6×SSC，每次15分钟，并在低于Tm3℃至5℃下洗4次。
确定DNA顺序
cDNA片段再次克隆入M13和mp18或19，用双脱氧核苷酸链终止法使之序列化（Sanger，et    al.，Proc.Natl    Acad.Sci.USA，74：5468    1977）。
用碱性方法（Birnboim    and    Doly，Nuc.Acid    Res.，7：1513    1979）制备质粒DNA，通过用Cs    Cl梯度离心2次来纯化。用修饰的苯酚萃取法（Maniatis    et    al.，1982）分离烟草RNA。
实施例5
从烟草中纯化GAPDH
胞液（C4）和叶绿体（A4和A2B2）的GAPDH全酶从烟草（Nicotiana tabacum）W38中纯化到高于90%的纯度（如例1所述）。用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳确定的亚基结构分子量分别为A：37，000d;B：41，000d，及C：36，000d。所有这三种全酶均进行N-末端顺序分析。C4酶的N-末端是被封闭的，而17和30氨基酸的N-末端顺序是分别从A4和A2B2中得到的（见图la），意外的是A2B2酶给出一唯一顺序，头17个残基与A4蛋白质的相应部分相同。此结果表明B亚基的N-末端被封闭，或者，A和B亚基具有同样N-末端顺序。经历测定顺序反应的第一周期后，赖氨酸重获率为65%，这意味着第二个可能性，因为一条单肽链的赖氨酸重获率极少超过50%（参见下面的核苷酸顺序数据。）接近叶绿体酶的N-末端也出现了7个氨基酸的集团（见图1），它们是Gly- Phe- Gly- Arg- Ile- Gly- Arg，它们在所有胞液GAPDHS中保持不变（Tso et al.，1985a）。
实施例6
在烟草cDNA库中筛选GAPDH
基于来自烟草的N-末端氨基酸顺序（图1）及其从其它品种得到的胞液GAPDHS保守顺序（Tso et al.，1985a）的分析，合成了4条寡核苷酸（图2）。从保守于所有GAPDHS的氨基酸顺序中推断出15mer（15.1）和23mer（23.1），这些GAPDHS的肽链顺序是已知的，而从烟草叶绿体酶的N-末端顺序的一个区域推断出2个18mers（18.1和18.2），这个烟草叶绿体酶与已知胞液GAPDH顺序（图2）无同源性。因此，预料到编码A和B亚基（Gap A和Gap B）的基因的潜在全长cDNA克隆将与三条寡核苷酸杂交（15.1;18.1或18.2;及23.1），而胞液GAPDH基因的cDNAS（Gap C）将与15.1和23.1杂交，而不与18.1或18.2杂交。的确，当这些寡核苷酸被用作探针筛选来自烟草植物叶子RNA的cDNA库时得到三类cDNA克隆（图3），其中烟草植物生长于正常温室条件，叶子愈伤组织悬浮培养物生长于完全黑暗条件（这种条件下叶绿体处于未分化状态）。这三类克隆中，具有插入长度大于1.2kb的克隆与15.1和23.1都可杂交。Ⅰ类克隆与18.1杂交，Ⅱ类克隆与18.2杂交，而Ⅲ类克隆既不与18.1也不与18.2杂交。Ⅰ类和Ⅱ类只存在于来自光生长烟草的cDNA库，而Ⅲ类既可得自光生长也可得自暗生长的烟草cDNA库。这些结果表明，Ⅰ类和Ⅱ类含有编码Gap A和Gap B基因的cDNAS，而Ⅲ类含有编码Gap C基因的cDNA。根据与美国典型培养物保藏中心（ATCC）的布达佩斯条约，含有Gap A，Gap B和Gap C基因的质粒已储存，储存号码分别为67225，67226和67224。
实施例7
cDNA克隆的鉴定
杂交选择用于进一步检测这些cDNA克隆;从烟草叶中分离的聚A+RNA被杂交选择，在体外转译后，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳将产物分离。当pND32（一个Ⅲ类克隆）用于杂交选择RNA时，体外转译产物是一种与纯化的胞液GAPDH具有同样分子量（36，000d）的多肽。这种蛋白质用抗胞液GAPDH的抗血清进行免疫沉淀，因此，Ⅲ类克隆含有编码胞液肽Gap C的cDNA克隆。对比之下，当pG49（一种Ⅰ类克隆）和pG60（一种Ⅱ类克隆）用于杂交选择RNA时，体外转译产物是具有分子量分别为43，000和47，000d的肽段。这些肽可以被抗全酶A2B2的抗血清免疫沉淀，进一步证实Ⅰ类和Ⅱ类是Gap A和Gap B克隆。
体外转译产物的分子量比纯化的叶绿体GAPDH的A和B亚基大6，000d。这表明，与其它核编码的叶绿体蛋白质相比的话，每个A和B亚基含有60个氨基酸的N-末端过渡肽。此外，体外转译产物和全酶亚基的分子量之差表明Ⅰ类编码Gap    A肽，而Ⅱ类编码Gap    B肽。
在不存在聚A+RNA时有一种体外转译产物与A肽前体共同迁移。然而免疫沉淀结果表明43，000d蛋白质带的大部分是克隆pG49杂交选择的RNA的转译产物。
确定了三种克隆（p    G49，pG60，pNDA1）的完全核苷酸顺序，这三种克隆是分别从Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ类中得到的最长的顺序（图4a）。所有这三种克隆含有进化过程中保守的GAPDH特性（Tso，el    al.，1985a）。推断的pG49和pG60的肽顺序的N-末端亚域含一段30个氨基酸顺序（位置1～30，图4b），这与从纯化的叶绿体GAPDH中确定的顺序完全相同（图1）。在由pG49和pG60得到的成熟肽的N-末端密码子之前分别有58和53个氨基酸为明读密码。这些数据与pG49和pG60对应于叶绿体克隆的结论相一致;在成熟肽的第一个密码子之前的明读密码编码过渡肽。
由pG49和pG60编码的成熟肽的计算分子量分别为36，000和41，000d，这些值与从SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳确定的A、B亚基分子量A（MW＝37，000d），B（MW＝41，000d）吻合，推断的Gap    C克隆，NDA1，的氨基酸顺序表明它缺失了C亚基的头9个氨基酸（见图4）。

Claims (17)

1、一重组DNA(rDNA)分子，其含有一植物衍生的甘油醛磷酸脱氢酶的遗传顺序。
2、权利要求1的rDNA分子，其中所述的遗传顺序编码叶绿体甘油醛磷酸脱氢酶。
3、权利要求1的rDNA分子，其中所述的遗传顺序编码胞液GAPDH。
4、权利要求1～3中任一项的rDNA分子，其中所述的遗传顺序为cDNA形式。
5、权利要求1～3中任一项的rDNA分子，其中所述的植物为烟草。
6、权利要求1～3中任一项的rDNA分子，其中所述的分子为载体。
7、权利要求6的rDNA分子，其中所述的载体为质粒。
8、一种用权利要求1～3中任一项的rDNA转化的宿主。
9、一种权利要求8的宿主，该宿主是细菌。
10、一种权利要求8的宿主，该宿主是酵母。
11、一种权利要求8的宿主，该宿主是哺乳动物细胞。
12、一种权利要求8的宿主，该宿主是植物细胞。
13、一种产生植物甘油醛磷酸脱氢酶的方法，该方法包括：
（a）制备权利要求1，2或3中任一项的DNA分子;
（b）将所述分子插入载体;
（c）用该载体转化宿主系统;
（d）在该宿主中表达该DNA分子的该GAPDH  DNA顺序;及
（e）分离用该种表达生产的植物甘油醛磷酸脱氢酶。
14、一种生产权利要求13所述的植物甘油醛磷酸脱氢酶的方法，其中甘油醛磷酸脱氢酶来自叶绿体。
15、一种生产权利要求13所述的植物甘油醛磷酸脱氢酶的方法，其中甘油醛磷酸脱氢酶来自细胞液。
16、权利要求1的重组DNA分子，其含有一可测标志。
17、权利要求16的重组分子，其中可测标志选自：放射性标志，荧光标志，化学发光标志，酶标志及自由基标志。
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