CN86107118A - 水凝胶封装的线虫 - Google Patents

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Abstract

一种杀虫剂的制备方法及其组合物，包括水合的水凝胶胶囊，所述胶囊包含至少一个有效杀虫量的、能传染一个昆虫宿主的线虫。所述胶囊具有充分的水合作用以便维持所述线虫的生活力及传染性。同时也公开了制备所述杀虫剂组合物的方法。

Description

本发明通常涉及应用线虫作杀虫剂，更具体涉及在水凝胶囊中固定并保存线虫以便输送到昆虫宿主中，也涉及装载线虫的胶囊。
在农业区域内应用活的机体去控制有害昆虫的蔓延，给人们带来增长着的利益。为避免使用化学杀虫剂相关联的缺点，如它们缺少专一性、残留的毒性反应及目标昆虫的抗药性的迅速发展，使上述那种应用活的机体的杀虫制剂成为理想的杀虫剂。输送在控制条件下的活的杀虫制剂具有狭窄的宿主类型范围，能控制特定宿主的蔓延而又不影响天然的捕食者或有益的昆虫。被称为生物一合理的杀虫剂的实例中包括thuringiensis杆菌;杆状病毒科（Baculovindae）如苜蓿银纹夜蛾核多面体病病毒;及各种真菌病原体。
长期以来线虫被认为是理想的杀虫制剂，部分是由于它们的目标或宿主机体是广泛的。例如斯氏线虫（steinernematids）及异小杆目（heterorhabditid）线虫在实验室条件下显示了很广泛的宿主范围，所述实验室条件排除了对线虫传染的行为或生态屏障，佛罗里达、博卡拉坦、CRC出版社有限公司1979年出版的波埃纳（Poiner.G.O.）“昆虫的生物控制中的线虫”“线虫”杂志13∶241-249（1981）戈格勒（Gaugler.R.）著文。杀虫作用通常是由于线虫本身对昆虫的致病性以及它与某些昆虫的细菌的关联造成的结果。例如，DD-136线虫的传染性的幼虫有一个关联细菌即嗜线幼虫无色杆菌，所述杆菌通常发现于幼虫的肠胃中。经昆虫摄食或昆虫的侵犯后，线虫通常会穿过肠壁而进入血腔，在此处细菌会被释放出来并增生，而改造成宿主中致死的败血病。
应用线虫作为杀虫剂的主要障碍在于它们对于干燥的敏感性。在线虫所需要的湿度的场合下，有效宿主的范围限制于居住于泥土及隐藏的栖息地的昆虫，所述隐藏的栖息地包括暖房、蘑菇床及动物的粪便。曾在野外做过大量的尝试通过避免日间应用或使用抗-干燥剂或增湿剂来增加其田间持久性和应用线虫来控制昆虫。
这种对水份的要求曾导致各种包含线虫带水制剂的生产，但这种制剂的有效性通常是受到水载-载体的早期蒸发的限制。为减少蒸发速度，水载体中包括着蒸发-阻滞水增稠剂，矿物油，胶凝剂或表面活性剂。例如可参见美国专利第4，178，366号。
已经利用水凝胶对多种微生物或细胞培养物、甚至有机及生物-活性化学药品进行封装。这种封装法的典型代表叙述于美国专利第4，450，233;4，352，883;4，434，231号。
能将多细胞有机体如线虫封装于一基质中将是很理想的，这种基质能供应促够的水份以便防止干燥，并允许线虫的传染期幼虫被广范围的昆虫宿主所摄食或者浸犯广范围的昆虫宿主。
本发明的重要目的在于提供一种杀虫剂组合物，所述组合物可含有足够的水份的情况下输送到固定区域，以便提供封装在其中的供长时间用的有效杀虫量的线虫。
本发明通过提供在水合的凝胶胶囊中封装传染性线虫的方法和材料达到这个或其他目的，该胶囊在一个较长的时间内在没有损害它们对昆虫宿主的传染能力支持着线虫的生活力及传染性。
按照本发明的一个方面，提供一种杀虫剂组合物，该组合物包括一种水合的水凝胶胶囊，所述胶囊中包含有效杀虫量至少为一个能使一个昆虫宿主传染的线虫，所述胶囊具足够水合作用以便维持所述线虫的生活力及传染性。
本发明的另一方面，包括一种所述杀虫剂组合物与在一起的为至少一种能吸引预料的昆虫宿主的试剂。
本发明还有另一个方面，包括一种包含在水合的水凝胶胶囊中的有效杀虫量至少为一个能使一个昆虫宿主传染的线虫的杀虫剂组合物，与在一起的为至少一种能激发所述昆虫宿主摄食所述胶囊的试剂。也提供制备所述杀虫剂组合物的方法。
先有技术中已知多种致病线虫具有范围的昆虫宿主，因而给本发明的实施提供了理想的杀虫剂。
大概作为最有用的杀虫剂的最著名的线虫是DD-136线虫（褐夜蛾）斯氏线虫steinernema    feltiae    Filipjeu）。其能起杀虫作用的已知线虫包括：
斯氏线虫属
格氏新线虫
Neoapleetaua    menozzii（＝锯蜂斯氏线虫）
毛蚊新线虫
金龟新线虫（＝格氏斯线虫）
养治亚新线虫（＝毛蚊斯系线虫）
Neoapleetaua    dutkui
异小杆目线虫属
Heterorhabditis    bacterioplcora
Heterorhabditis    heliotlindis
Heterorhabditis    hoptha
Helerorabditis    harubletoni
索线虫属
菲氏索线虫
食蚊罗马索线虫
Diximermis    petersoni
Hexamermis    arvalis
暗黑索线虫
Pheromermis    pachysoma
其他可包含能致昆虫于死亡的品种的属有
步甲线虫属（carabomematidae）
双胃线虫属
小杆线虫属
圆线虫属
四线虫属
除此还有许多昆虫的线虫也可使昆虫不育及在昆虫宿主的群体中造成成员数目降低
上述公开的许多线虫可在控制条件下进行饲养。一种方法是通过将经选择的昆虫宿主传染并把生成的昆虫躯壳悬浮在一个水的环境中。经一段时间后可把线虫从水中收集起来。参看前述波埃纳著文。
另外，如美国专利4，334，498号中所公开的，也可将线虫饲养于生长室之中，该专利中的有关部分作为参考资料结合到本发明中。
可使用各种水凝胶试剂提供按照本发明生产的杀虫剂组合物的适当封装基质。通常，水凝胶囊可让气体扩散以便线虫呼吸。所选择的水凝胶试剂提供能足于抵抗外部摩擦及反向力的胶囊，但柔软到可以在适当的时间最后释放线虫或为昆虫摄食。为满足这些目的，在特定实施方安中可能需要使用各种凝胶的混合物或分层使用不同的凝胶，以便达到要求的结果。
供制备封装线虫的水合的水凝胶胶囊的有用的水凝胶试剂包括藻酸钠、瓜尔树胶、含刺槐豆胶的鹿角菜及含白明胶的藻酸钠。其他还包括但不限于：
表1    水凝胶试剂
Ⅰ.天然聚合物
甲    离子键（需要络合试剂）
含多果胶酸酯的藻酸盐
果胶酸钠
红藻胶
果胶
沙菜胶
葡萄糖
罗晃子果
瓜尔豆胶
吉蓝树胶
乙    疏水性相互作用
链淀粉
琼脂
琼脂糖
含有白明胶的琼脂
白明胶
淀粉
枝链淀粉
玉米皮胶
淀粉阿接伯半乳聚糖
达瓦树胶
梧桐树胶
Ti胶
黄蓍胶
小麦胶
壳多糖
糊精
Ⅱ.稳定性化合物
A    商品名
Gelrite（Kelco）
其他具有相同特性的水凝胶亦可作为上述公开的水凝胶的等效物而使用。
选作封装线虫的水凝胶试剂通常须包含下列特征（虽然可用其他方式实施本发明）：
1.一种水凝胶胶囊顺从适宜于作保护和衬垫线虫之用;
2.水凝胶胶囊的内部须具有可溶性或形成乳胶的特性，以使它能接受及包含添加物，包括但不限于水、不可溶、或疏水物质，所述物质具有能吸引昆虫到胶囊的能力或刺激昆虫摄食胶囊;
3.一个外表面，所述外表面对机械应力提供保护屏障，便于处理，及维持胶囊的水合作用并伴随维持线虫的生活力及传染性。
4.足够的机械胶粘强度以维持胶囊的完整性，同时允许线虫从其中迁移至昆虫宿主，并释放所含的任何引诱剂的添加物。
5.所选择试剂须可形成在温度和条件可为线虫所承受的胶囊基质，并须不要求应用或产生任何对线虫的寿命或传染性有害的组分。然而必须理解线虫是可以暂时承受那样的条件而没有永久性损害。
上面叙述的水凝胶胶囊的特性通常是由所使用的水凝胶试剂的浓度参数及化学性质决定的，以及须认识到所述这些特点可在特殊的应用中达到广范围而没有偏离本发明的领域。
本发明最新近的优选实施方案中应用了藻酸钠水凝胶试剂如LF-60（新泽西、里奇菲尔德，Multi-Kem供应。这种水凝胶试剂可以不同的浓度溶解于水中以形成藻酸盐溶液，并可把线虫加入到生成的溶液，其浓度为以能足于在每个生成的胶囊中提供足够的有效杀虫量的线虫为准。
这种藻酸盐溶液，如：当加上络合试剂后可形成水凝胶胶囊。通常使用氯化钙（CaCl2），然而氯化镧，氯化铁，氯化钴，硝酸钙及氢氧化钙也可使用，同样通常其他含多价阳离子如（Ca++）、铜（Cu++）及其同类的化合物也可用。
在实施本发明时一个选择出的水凝胶试剂会有一个可用的浓度范围。通常所选择的浓度须使之在易于处理、胶凝时间、水凝胶胶囊的强度及涂敷在线虫周围的涂层厚度等方面成为最佳。例如，可制备在水中的浓度为1至10%的重量（克）/体积（毫升），更常用为1.5至5%而理想的为约1.5至3%的藻酸盐溶液。然而，如果水凝胶试剂的浓度是过高，所述溶液将会过粘，以致于会阻碍线虫在水凝胶溶液中的沉浸及混合，或由于粘性剪切力的作用造成线虫的损坏。
可从含有线虫的藻酸盐溶液通过例如在溶液中滴加选择的络合试剂而制成水凝胶胶囊。另外，也可用多种本技术领域中已知的技术把水凝胶溶液与络合试剂混合。这些可包括小滴形成与试剂添加通过震动喷作为一步法完成的，其中所述喷咀从一个源点喷射水凝胶小滴并从另一个源点把喷射络合试剂涂敷在小滴上。
所用的氯化钙（或其他络合试剂）可制成浓度为1至1000毫摩尔，更常用为20至500毫摩尔，理想的为50至100毫摩尔的溶液。其他络合试剂会有不同理想的浓度范围。然后，可将含有线虫的藻酸盐小滴用氯化钙（或其他络合试剂）溶液用浸泡法、喷洒法、浸渍法、倾浇法或任何一些其他能将一定数量的络合试剂沉积在小滴上的方法处理。当将那些小滴浸泡在氯化钙溶液中时，其浸泡时间可由1秒至24小时，更常用为1分至1小时，理想的为10至30分。
对选择的水凝胶试剂和络合试剂的浓度而言，水凝胶形成时间及凝胶溶液的温度虽然理解成相关的参数。所选择的温度须可避免线虫遭受损害，通常是在1至50℃范围内，更常用的温度为10至40℃，而理想的温度为15至30℃。
在可以接受的温度范围内，选择一特定值以给出尽可能短的、与完全形成水凝胶相一致的胶凝时间。通常，水凝胶基质可瞬即形成，但完全络合化需取较长的时间。对于浓度为每100毫升水2.0克的藻酸钠溶液，浓度为100毫摩尔的氯化钙，在25℃反应温度时，在5至120分内即可获得优良的胶凝作用，多时是在10至90分内，而通常在15至30分内已足够完全胶凝。
这种水凝胶封装工序其设计的目的是为了在胶囊中维持高度的游离水份。胶囊的外表面是通过凝胶与络合试剂间进行化学反应而形成的。胶囊的内部保持湿润，其水含量超过50%，最好在70与98%之间。胶囊中的水可瞬即为其中的线虫所获取，因此提供了抗干燥所必需的水份，这种必需的水份构成了维持线虫的生活力及传染性的基本要素。水合胶囊的水含量在形成胶囊后可通过部份干燥法进行调节，例如用适当的渗压剂如聚乙二醇。
包含着按本发明制备的线虫有效杀虫量的水合的水凝胶胶囊其直径的尺寸范围从约0.4至5毫米，且每毫升包含约250-50，000个线虫。每单位体积中使之具有有效的杀虫作用所需的线虫的量值随着所选择的线虫及特定的昆虫宿主而异。此量值一旦选定特定应用之后，可经例行程序进行测定。同样可以理解，在胶囊中线虫的浓度并非处处均匀。某些实施方案中可提供不连续的线虫分布，如在胶囊的中心部分的浓度较大的情况下，同时保持本发明的益处。
本发明的另一方面为在和含有能引诱所需的昆虫宿主的试剂一起的水合的水凝胶胶囊中封装线虫。所述的试剂也称为诱饵，例如包括如供饲养昆虫的商业用配方食品、化学引诱剂、信息素及其他同类物。
在某些情况下也认为需要所述引诱剂刺激昆虫去摄食胶囊，同而可在减少线虫由胶囊中迁移的要求的同时增加组合物的杀虫作用。另外，可提供一种鉴别试剂，与引诱剂独立或混合使用，以便刺激所预料的昆虫宿主去摄食所述胶囊。引诱昆虫或刺激昆虫摄食胶囊的已知有用试剂如下。
表2    诱饵
麸皮
小麦胚芽
蒸糖
真菌腐化的木屑粉
昆虫信息素
植物/根部物质或渗出物
肖里与黑尔昆虫食料
其他昆虫食料及饲喂刺激剂。
在详细地叙述了本发明的细节后，下列提供本发明的具体实施方案实例作为说明，不可解释或对所附上的权利要求的范围有限制作用的提示。
为说明本发明，提供下列实例来描述各种各样线虫、水凝胶试剂及引诱剂和摄食刺激剂。所标志的各种量如无特别说明则为每100毫升的克数。
实例Ⅰ
如Dutky等人在“昆虫病理学会志”6：417-422（1964）中所叙述的在蜡螟的幼虫中生产DD-136线虫。经约四天后，将昆虫宿主的躯壳放置在含有水的收集盘中，约一星期后收获线虫。所收获的线虫贮存在250立方厘米的组织培养瓶中，贮存温度为4℃，浓度为每毫升约34000个线虫。
将2克LF-6藻酸钠（新泽西、里奇菲尔特、Multi-Kem产品）溶解于商用混合器中的100毫升水中，搅拌约4至5分钟。游线虫的传染期幼虫混合在藻酸钠溶液中以便产生浓度为每毫升约4，000个线虫。然后将含线虫的溶液逐滴地装载在含100毫摩尔CaCl22H2O的络合试剂中。所述络合试剂溶液需在加入藻酸盐溶液时进行连续搅拌以避免二价阳离子局部稀薄。
经约20至30分钟络合反应时间后，用选筛把胶囊从络合溶液中分离出来，并在去离子水中洗涤。然后将这些胶囊贮存在温度约为4℃的潮湿的环境中。
经9个月贮存期后，测定被封装的线虫的生活力及传染性，其方法如下：
将每个样品胶囊沉浸在0.5摩尔的柠檬酸钠作为溶剂的溶液中使之溶解。将所述含有线虫的溶液用水稀释，并用解剂显微镜测读出活的线虫。
将昆虫宿主放置在50毫升的烧杯中，用含有约7%水的沙覆盖，并用所获线虫接种。将烧杯盖住以便阻止干燥作用，7天后把昆虫的死亡率进行记录。
这些检定的结果列于表3中。
表3    生物检定结果
处理    幼虫
死亡率%
实例ⅠA
1.在溶液中贮存9个月的线虫    100
2.在大胶囊（90毫克重）    70
中贮存9个月的线虫
3.在小胶囊（30毫克重）    90
中贮存9个月的线虫
4.无线虫    10
实例ⅠB
1.在溶液中贮存5个月的线虫    100
2.在与CaCl2络合的胶囊 90
中贮存5个月的成虫
3.在与CuSO4络合的胶囊 100
中贮存5个月的线虫
4.无线虫    0
实例ⅠC
1.在溶液中贮存2个月的线虫    100
2.在每个胶囊中包含2000    100
个线虫的胶囊中贮存2个月
的线虫
3.在每个胶囊中包含1000    100
个线虫的胶囊中贮存2个月
的线虫
4.在每个胶囊中包含2000    100
个线虫的胶囊中贮存2个月
的线虫
5.在每个胶囊中包含3000    100
个线虫的胶囊中贮存2个月
的线虫
6.在每个胶囊中包含4000    80
个线虫的胶囊中贮存2个月
的线虫
7.无线虫    0
实例Ⅱ
重复实例Ⅰ所述的封装程序但用Hdterorhabditis    heliothidis线虫来代替DD-136线虫，短期贮存的结果与实例Ⅰ所得相同。
实例Ⅲ
按实例Ⅰ所述的封装程序将DD-36线虫封装，但进行下述改进：
将肖里与黑尔昆虫食料（肖里-黑尔著“在简单的合成合质中对9种夜蛾属品种的大量-饲养”见于经济昆虫学会志，1965，58∶522-524。）溶解在藻酸钠溶液中，其浓度约为1毫升食料/4毫升凝胶溶液，并与线虫一起进行封装。
将所制备的胶囊供应给昆虫宿主：甜菜夜蛾、一点粘虫，在24至48小时不供应其他的饲料或水。在此之后，将胶囊取去并以普通饲料或水代替。在三天的时间内测定昆虫的死亡率。其结果如表4所示。
表4    线虫释放幼虫死亡率百分比
处理释放线虫于：时间0    1小时    2小时    3小时    4小时
实例ⅢA
水    100    20    20    0    40
胶囊    100    80    40    40    80
胶囊+膜    60    60    100    100    60
实例ⅢB
水    100    100    0    0    20
胶囊    100    80    40    20    0
胶囊+膜    8    100    100    100    60
实例ⅢC
水    100    80    20    0    0
胶囊    80    80    40    0    0
胶囊+膜    20    100    80    80    60
试验之平均值
水    100.0    66.7    13.0    0    20.0
胶囊    93.3    80.0    40.0    20.0    26.7
胶囊+膜    53.3    86.6    93.3    93.3    60.0
实例Ⅳ
如实例Ⅰ所述将线虫封装于水凝胶胶囊中，此外，为降低水份的损失用外表膜涂敷于此胶囊的外表层。所述胶囊膜是按下列程式制备的。
胶囊膜制备程式
Ⅰ制备溶液
A.预处理溶液
将氧化钙在经微孔过滤的水中搅拌（1∶100，重量∶体积）15分钟。将生成的悬浮体经沃德曼＃1用漏斗来过滤，并留取滤液。并将滤液密闭保存。
B.膜溶液
1.乙烯与醋酸乙烯共聚物（Elvax）溶液在环己烷中制备Elvax4260（特拉华、威尔明顿、杜邦公司）溶液（Elvax    4260∶环己烷1∶10重量/体积）环己烷的体积度为1.32毫升/克，因此，10克环己烷中的1克Elvax的溶液等于13.2环己烷中的1克Elvax。当溶液增稠时，利用调节在“低温”位置的科恩宁（coming）热碟搅拌器（pc-351）提高搅拌速度并缓慢加热。保持用箔片盖住溶液。
2.制备添加“蜡”
按5∶2∶1（重量∶重量∶重量）称出制剂组分鲸蜡代＃573（新泽西，译西城，F.B.罗斯公司），鲸蜡醇（1-己癸醇）及硬脂酸。将三者在一个大的烧杯（600-1000毫升）盖中混合，并在热碟上以“低温”加热10至20分钟或直到熔融。
3.把膜成分混合
a.获得石油醚（50-100℃）及二氯甲烷
b.各成分按重量计的比例为
ⅠB1    10份环己烷中的Elvax5份鲸蜡醇
ⅠB2    2份    鲸蜡醇
1份    硬脂酸
ⅠB3    40份    石油醚（体积度＝1.48毫升/克）
40份    二氯甲烷（体积度＝0.78毫升/克）
将ⅠB1倾入ⅠB2中并伴随缓慢的搅拌。加入ⅠB3到2中并继续搅拌。贮存于封装容器中并放置于暗室中。
Ⅱ膜的涂敷
A.用溶液ⅠA（氧化钙滤液）预先处理胶囊并打旋或搅拌1分钟，其用量比例为2∶1（体积/体积）胶囊：预处理溶液。通过泥龙网倾析预处理溶液并用毛巾清除过量的溶液。将滞留在网上的胶囊于过量的膜溶液ⅠB3浸渍15秒，并让它在溶液上简略地排出多余液体。用吹发风筒以低温度（23.3分钟）吹干胶囊。重复浸渍及吹干步骤以便增加沉积的膜的厚度。让胶囊在空气中干燥3至4小时，以便进一步蒸发囊上的溶液并封住膜上的小孔。
将按上述制备的胶囊供应给下列昆虫宿主：甜菜夜蛾、一点粘虫。在24到48小时内不供应其他的饲料或水。在此之后，将胶囊取去并以普通饲料和水代替。在三天的时间内测定昆虫的死亡率。其结果如表4所示。
由此可见，提供了照本发明的杀虫剂组合物之可获得线虫杀虫本领的实质性改进的结果。用水凝胶封装的线虫的有效杀虫量一般说来较沉渍于水中的线虫相比，前者造成的昆虫宿主的死亡率增高。此外，这种封装的线虫当提供按照本发明的胶囊膜之后，显示出长时间内保留杀虫活性的戏剧性改进。在这方式下，本发明达到了上面所叙述的目的及其他。
虽然本发明为求易于理解的目的而用实例在相当程度上详细说明，但必须理解为可在本发明所附的权利要求的精神和范围内进行各种各样的改进。

Claims (12)

1、一种杀虫剂组合物，其特征在于，该组合物包括水合的水凝胶胶囊，此胶囊包含至少一个能传染一个昆虫宿主的有效杀虫量线虫，所述胶囊具有足够的水合作用以维持所述线虫的生活力及传染性。
2、按照权利要求1所述的杀虫剂组合物，其特征在于，所述的组合物中的水凝胶胶囊包含至少有一个试剂是由藻酸钠、白明胶、瓜尔豆胶及鹿角菜胶等的一组中选择的。
3、按照权利要求1所述的杀虫剂组合物，其特征在于，所述组合物中的所述线虫由至少有一个线虫是由DD-136线虫及Heterorhabditis  heliothidis的一组中选择的。
4、按照权利要求1所述的杀虫剂组合物，其特征在于所述组合物还包括一个能引诱所述昆虫宿主到胶囊的试剂。
5、按照权利要求1所述的杀虫剂组合物，其特征在于，所述组合物进一步包含至少一种能刺激所述昆虫宿主摄食所述胶囊的试剂。
6、按照权利要求1所述的杀虫剂组合物，其特征在于，所述组合物进一步包括基本上覆盖所述胶囊的胶囊膜，所述膜具有能降低所述胶囊的水的损耗率。
7、制备一种杀虫剂组合物的方法，其特征在于，所述的方法包括下列步骤：
提供一混合物，所述混合物包括至少一种能形成水凝胶胶囊的水凝胶试剂，及至少一个能传染昆虫宿主的线虫;
从所述混合物形成胶囊，所述胶囊具有充分的水合作用以便维持一个有效杀虫量的所述线虫的生活力与传染性。
8、按照权利要求7所述的制备杀虫剂组合物的方法，其特征在于，所述方法中所述凝胶试剂至少有一个是从包含藻酸钠、白明胶、瓜尔豆胶及鹿角菜胶的一组中选择的。
9、按照权利要求7所述的制备杀虫剂组合物的方法，其特征在于，所述方法中的所述线虫至少有一个是从包含DD-136线虫和Heterorhabditis  heliothidis的一组中选择的。
10、按照权利要求7所述的制备杀虫剂组合物的方法，其特征在于，在所述方法中的组合物中进一步包含至少一种能引诱所述昆虫宿主到所述胶囊的试剂。
11、按照权利要求7所述的制备杀虫剂组合物的方法，其特征在于，在所述方法中的组合物进一步包含至少一种能刺激所述昆虫宿主摄食所述胶囊的试剂。
12、按照权利要求7所述的制备杀虫剂组合物的方法，其特征在于，在所述的方法制备的胶囊的表面涂敷至少一种膜，所述膜具有能降低所述胶囊的水的损耗率。
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