CN85101019A - 免疫微脂粒分析-方法及产品 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种新的溶膜免疫分析法。该法公开了使抗原先与脂质共价偶合,再将该抗原一脂质络合物与一种形成六方形相的脂质混合以形成另含有自动淬火荧光染料的双层微脂粒囊胞。当这种含抗原的微脂粒与涂附有抗体分子的固体表面接触时,抗原与抗体发生结合,微脂粒破裂而释出染料。欲分析生物体液之游离抗原,先将流体与固体表面-抗体络合物接触,使已结合的抗体达饱和,以抑制微脂粒的结合,使染料释出。由释出量对已知抗原浓度之标准曲线,可快速测定释出量而得知未知抗原浓度。
Description
本发明系关于一种新颖之溶膜免疫分析法。此分析之一体现,乃令抗原首先与脂质共价偶合,再令此抗原一脂质络合物与一种形成六方形相之脂质相混合以形成另含有自动淬火萤光染料之双层微脂粒囊胞。当此种含抗原之微脂粒与涂附有抗体分子之固体表面接触时,接原与抗体间发生结合,微脂粒破裂而释出染料。欲分析生物体液之游离抗原,首先乃将流体与固体表面一抗体络合物接触,使得已结合之抗体达饱和。因此抑制微脂粒之结合作用,而导致染料减少释出。经由染料之释出对已知抗原浓度之标准曲线,可快速地由分析所得之染料释出量而得知生物体液中未知之抗原浓度。同样地,抗体及其它称号诸如酵素,药等,可使用本分析法之些微改良法测定之。
本发明乃指示一种同质固态之免疫微脂粒分析法及此法所使用之有效制品,尤其是组套形式者。本分析法乃利用抗原性微脂粒之侧相分离,其导致微脂粒之去稳定及溶解,因此可定量并用以测定生物体液中抗原,抗体及类似因子之存在及/或浓度。
一般系使用高容量屏障分析法来检定生物样本中抗原物质,抗体及分析物之存在并予以定量测量。例如,经常使用放射免疫分析(RIA)技术以供临床诊断。然而,RIA步骤经常不能与大量之屏障项目相容。放射追踪剂(因其真正特性)仅具有有限之稳定度,且其于使用期间需要特殊之操作,特殊之处理技术及复杂之仪器使用法。
现今之其它有用之免疫分析法包括萤光及酵素之技术。这些分析法通常需要分离之步骤(过滤法或离心法)以供判断。而这些分离之必要条件导致分析时间变慢且难以自动化。
先前已述及微脂粒乃作为免疫分析法中之有效成份。例如Mc Connell等人,于美国专利第3887698号中描述,含有稳定游离基团之微脂粒于被电子顺磁共振(EPR)所检定之免疫分析法中之用途。Mandle等人,于美国专利第4,372,745号中描述微脂粒于免疫分析法中作为含有微小胶囊之萤光剂之用途。此分析法需要使用一种去垢剂诸如Triton X-100等以破坏微脂体并释出萤光化合物。Ullman等人于美国专利第4,193,983号中描述,微脂粒亦可用以作为免疫分析法中之标记载体。此分析法中所用之标记包括萤光剂,酵素及化学发光化合物。
Kinsky及其同僚首先指出,含有微脂粒之击抗原脂质可与抗体结合,并固定其补体(Haxby et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,61 300(1968);Alving et al.,Biochem.,8 1582(1969);Kinsky et al.,Biochem.,84149(1969))。结果为微脂粒因为活化之补体成分之故而造成溶解。
Cole于美国专利第4,342,826号中描述一种免疫分析法其乃使用附有抗原,且包覆有酵素之微脂粒,此微脂粒于同质抗体及有效补体之存在中发生破裂。此分析法乃利用抗体及补体间之均相反应而释出酵素标记。此种补体促成性结果已成为许多文献之焦点(最近之文献则请参见Alving & Richards,Liposomes,Ostro,ed.,209-287(Marcel Pekker,New York,1983))。
最近已有数种非补体促成性溶解微脂粒之分析法发展出。例如,抗体结合至已联结有溶膜蛋白质(melittin)之击抗原上会阻碍melittin溶解微脂粒之效力(Freytag et al.,Biophys.J,45 360(a)(1984)。将狼疮血清中之抗体结合至含有微脂粒之心脂上可避免微脂粒被MG+2离子溶解(Janoff et al.,Clin.Chem.,29 1587,(1983),这些分析法均不需补体,但需要溶膜分子或离子。
虽然前述分析法相当灵敏,但通常涉及许多步骤,且有时难以再生及/或自动化。因此,吾人期望有新颖及更有效之分析法。
本发明乃指示一种免疫分析法,其中微脂粒之溶解乃为免疫络合物形成之直接结果。本发明之分析法与能提供快速测定之RIA一样灵敏,亦不需有溶膜分子,离子或有效补体存在。
本发明乃指示一种新颖之溶膜分析法。因此,上述之溶膜分析法含有下列之步骤:
(a)形成含有重要分析物及标记化合物之微脂粒。
(b)提供一种已与接受器(供接受重要分析体用)结合固相惰性支器。
(c)将上述之测试液与上述步骤(b)之接受器一固相支器混合一段充分之时间以使上述之受器与上述测试液中存在之任何分析物达饱和。
(d)将上述步骤(a)所形成之微脂粒与上述步骤(c)之饱和接受器一固相支器相混合。
(e)测定步骤(d)中微脂粒所释出之标记化合物是否存在。
本分析之体现中,乃令抗原首先与脂质共价偶合,再将此抗原一脂质络合物用以联结其它非双层脂质与脂质混合物以形成另含有自动淬火萤光染料之稳定性双层微脂粒囊胞。当此种含抗原及染料之微脂粒与已结合有抗体分子之惰性固体表面接触时,抗原一脂质络合物及抗体间发生快速结合,微脂粒发生破裂而释出染料。染料之释出可使用标准之萤光计测量法予以定量。欲分析测试样本中之抗原量,首先乃将原始或稀释之样本加至惰性固体表面上以使已接触之抗体达饱和。因此,继而之微脂粒结合力及染料释出量降低。而后藉与已知标准曲线中之量相比较而测定未知样本中之抗原量。本发明亦指示上述分析法中之有用产品,尤其是组套形式者。
图1阐释带有DNP-cap-PE之DOPE及DOPC微脂粒之稳定度。测量已音波化脂质之90°光散射度可得知DOPE(a)及DOPC(b)微脂粒之稳定度。
图2为放大1.12×106倍之DOPE-DNP-cap-PE(88∶12)以负性染料染色后之电子显微照片;
图3阐释DOPE微脂粒所具有之藉由已接触至玻片上之抗体而溶解之免疫特殊性。
W/O 玻片 +DOC+DOPE 微脂粒
(GS) (0.12%)
GS +微脂粒
GS-BSA+微脂粒
GS-XDNP-Ig G(40ul〔118ug/ml〕)+微脂粒
GS-N-Ig G(40ul〔87.7ug/ml〕)+微脂粒
GS-XDNP-Ig G+被组断之DNP-Gly(40ul〔10mM〕)+微脂粒
GS-N-Ig G+被阻断之DNP-Gly+微脂粒
GS-XDNP-Ig G+事先与N-Ig G共同保温之微脂粒
(1∶1 V/V〔8.77mg/ml〕)
GS-N-IgG+事先与N-IgG共同保温之微脂粒
GS-XDNP-IgG+事先与XDNP-IgG共同保温之微脂粒
(1∶1 V/V〔11.8mg/ml〕)
GS-N-IgG+事先与XDNP-IgG共同保温之微脂粒
GS-XDNP-IgG+事先与BSA共同保温之微脂粒
(1∶1 V/V〔4mg/ml〕)
GS-N-IgG+事先与BSA共同保温之微脂粒
图4阐释DOPC微脂粒所具有之藉由已接触至玻片上之抗体而溶解之免疫特殊性。
W/O 玻片(GS)+DOPC微脂粒+0.12%DOC
GS+DOPC微脂粒
GS-BSA+DOPC微脂粒
GS-XDNPIgG(40ul11.08mg/ml)+微脂粒
GS-N.IgG(40ul8.77mg/ml)+微脂粒
GS-XDNPIgG+被阻断之DNP-Gly(40ul 10mM)+微脂粒
GS-N-IgG+被阻断之DNP-Gly+微脂粒
GS-XDNP-IgG+事先与游离XDNP-IgG(1∶1)保温之微脂粒
GS-N-IgG+事先与游离XDNP-IgG(1∶1)保温之微脂粒
GS-XDNP-IgG+事先与游离N-IgG(1∶1)保温之微脂粒
GS-N-IgG+事先与游离-IgG(1∶1)保温之微脂粒
GS-XDNP-IgG+事先与BSA(4mg/ml)(1∶1)保温之微脂粒
GS-N-IgG+事先与BSA(1∶1)保温之微脂粒
图5阐释已接触至玻片上之抗体之浓度于DOPE微脂粒溶解作用上之效应。使用指定浓度之抗DNP IgG(c)或正常IgG(d)以涂附于玻片上,再藉由测量calcein之释出量而得知DOPE微脂粒之溶解程度。
图6阐述DOPE微脂粒之溶解作用被游离击抗原所抑制之程度。微脂粒加入前,先将指定浓度之DNP-Gly(e)或Gly(f)加至已接触于玻片上之抗-DNP IgG中。
图7阐述DOPE微脂粒之溶解作用被游离抗体所抑制之程度。微脂粒于加入已结合于玻片之抗体前,事先与指定浓度之游离抗-DNPIgG(g)及正常IgG(h)共同保温。
图8为本发明固相免疫微脂粒分析法之图型说明。
微脂粒系为含有封闭性脂质双层之显微囊胞。参见:
Papahadjopoulos,Ann,N.Y.Acad.Sci.,3081(1978),由于微脂粒系为较简易之组成物且对化学,物理及免疫操作方面具有适应性,故彼等为溶膜分析法最嗜用之物质。
当与其它免疫分析技术比较后,得知使用溶膜免疫分析法具有数种优点:(1)单一溶解之结果导致许多信号分子之释出,因此彼乃为高度之信号放大作用。(2)罕需将免疫络合物与游离抗体或抗原分离,因此通常系为均质之分析法(3)可使用光学测量法诸如比色及萤光技术等,因而避免使用放射性同位素。基此些原因,故溶膜分析法于最近之免疫分析发展中已逐渐受到注目。
本发明之免疫微脂粒分析法可被阐释为一种特别称号(即抗原)之分析法。而后可应用此处所述之供分析抗原所用之一般原则及技术,以分析其它种类诸如抗体,击抗原等。
欲有助于了解本发明,此处及权利要求部分所使用之下列用语具有以下之定义:
分析物-待测量之化合物或组成物,其可为配合基,诸如抗原,击抗原或抗体等。例如,于理想体现中,分析体可为抗原或抗体。
配合这一供免疫接受器所用之任何化合物,其可自然存在或被制得。当配合基为抗体时,则免疫接受器可为抗原或抗一抗体。
配合基一脂质络合物-一种含有重要分析物及含有可与脂质(用以形成微脂粒)相容之脂质组成物的共价键结币状物,其乃供此处之分析法用。如果重要配合基不能直接用以稳定供形成囊胞所用之脂质双层时,则首先必需使用惯用之偶合化学法将配合基偶合至适当脂质上。类似之偶合化学法乃示于下,以供抗一配合基及惰性固体支器之偶合使用。供此些偶合作用所用之有用脂质包括(<C10)脂肪酸,磷脂,(>C10)烃,大环之烃,多环烃及其它由熟知技艺中所择定者。使用配合基一脂质络合物以稳定其它不稳定之微脂粒组成物。例如,于一体现中,已共价结合至磷脂醯乙醇胺衍生物(N-己醯-)上之抗原系被使用以稳定主要由磷脂醯乙醇胺(88莫耳百分比)所组成之微脂粒。
标记化合物-可用以检定,而非放射示踪物之任何化合物。此处特别有用之标记有酵素(参见Cole美国专利第4342825号(插于本文中以供参考),化学发光类,产色剂及产萤光剂等。最理想之标记化合物为自动淬火之萤光染料。这些化合物包括水溶性萤光素衍生物诸如羧基萤光素及calcein等。其它适当之标记为水溶性萤光团(如8-胺基-萘-1,3,6-三磺酸等)及水溶性灭火剂(诸如p-二甲苯溴化双(吡啶)等)之结合物。当染料/灭火剂结合物于溶解作用时由微脂粒中释出后,稀释作用可令之去淬火,因而再检定萤光团。参见Ellen et al.,Biochem.23 1532(1984)等。
接受器一为可辨认其它分子之特殊空间及极性组织之任何化合物及组成物。天然接受体包括抗体,酵素,lectin等。为配合任何特定之配合基,故接受器通常被称为抗一配合基。依各种状况而可互相交换称谓,亦即在一事例中为接受器,而于另一事例中可为配合基。例如,于理想体现中,抗原之接受器为抗体,而抗体之接受器为抗一抗体或(最好为)抗体之同质抗原。
系统一分析物,配合基及/或接受器试剂之结合物,通常与补助试剂诸如缓冲剂,盐类,稳定剂等共同组成,其乃置于单一容器中,通常为分析组套形式者。例如,检定抗原存在及/或浓度之系统包括含有下列成分之适当容器(1)于微脂粒膜中之抗原或其化学衍生物(2)装于第(1)项微脂粒中之萤光剂或其它适当标记;(3)已附着至固体支器上之供抗原所用之抗体;及(4)供制备曲线(曲线乃供已知之染料释出量与未知之染料释出量相比较)所用之已知浓度之标准抗原,或为事先已定之比较曲线及一作为对照之标准物。另外,组套可仅包括:(1)制备配合基一脂质络合物所用之适当试剂;(2)必要时,其它形成微脂粒之成分;(3)标记化合物;(4)标准分析物;及(5)标准接受器。使用者可依特殊分析法之必需条件而组成特定之试剂。亦可提供检定之方法以作为系统之一部分,但典型上并不需要。
本发明之一体现中,抗原之分析法包括由抗原一脂质络合物所形成之微脂粒之侧相分离,其导致微脂粒之去稳定,并释出标记化合物诸如萤光染料等。
任何可形成六方(HII)相之脂质均可用于本发明之操作中。一种适当之脂质为未饱和之磷脂醯乙醇胺(PE)诸如蛋PE或二油基PE等。未饱和PE本身于室温及中性pH下并不形成稳定之微脂粒。除了PE外,可形成HII相之脂质尚包括心脂及磷脂酸。这些脂质乃于二价阳离子诸如Ca+2等之存在下形成HII相。其它则无报告显示可于生理情况之温度及盐浓度下形成HII相。然而,形成HII之脂质之结构所需之一般必需物为偶合至较巨大疏水部分上之较小亲水基团(整个分子之形状为圆锥状)。因此,可制得合成性脂质,其于适当之分子构型(圆锥状)下亦具有HII相,且有用于本发明之操作中。
甚至主张,具有补充形状(即逆转圆锥状)之脂质分子可与上述之HII形成性脂质共同形成稳定之双层微脂粒。这些脂质分子乃含有偶合至小疏水部分上之巨大亲水基团。由熟知技艺中明显可知,水溶性配合基(诸如抗原等)及具有充分疏水特性之脂质之联结络合物乃具有逆转圆锥之分构型。因此,此型之配合基一脂质络合物将有用以稳定其它含有HII形成性脂质之不稳定微脂粒双层。参见Cellis及Dekruij ff,Biochem.Biophys.Acta 559 399(1979),其内容乃插入本文中以供参考。
使用HII形成性脂质及配合基一脂质络合物诸如抗原一脂质络合物等,并藉由音波作用,渗析法及其它惯用之技术,则可制得稳定之微脂粒,且标记化合物诸如自动淬火之萤光染料等亦可被置入微脂粒中。当含有抗原之微脂粒与已有可辨认抗原或可与抗原反应之抗体分子附着之惰性固体表面进行接触时,抗原一脂质络合物乃侧面移动,且与抗体结合。此种微脂粒之侧相分离促使双层快速转变为六方相,并导致内藏标记之释出。因此,(例如)可测量所释出之萤光信号而无需由惰性固体表面上分离任何试剂或其它物质。
欲分析生物体液诸如血清中之游离抗原,首先乃将血清加至已附着于惰性固体表面上之抗体中,因而使抗原结合至附着性抗体上。由此可抑制微脂粒之结合力,并降低染料释出之程度。欲分析游离抗体,则首先将血清加至微脂粒中。既然游离抗体乃非多价,故不发生微脂粒之相分离作用。抗原一脂质络合物之结合位乃充满游离抗体,因而再次降低微脂粒结合至固定抗体上之能力。
本发明之分析法系于水性介质中,于适当pH诸如中性pH(通常乃接近最适宜之分析灵敏度)下进行,而无需分离分析成分或发品。
测定分析物所用之分析带可藉使用适当之水溶液(通常为含有未知样本之缓冲者)制得,其事先可接受微脂粒一分析物一萤光试剂,任何与制造可检定记号有关之辅助物质,及已结合至固体,惰性支器上之适当改良或未改良接受器处理。
生物样本中作为分析物之配合基或抗一配合基浓度可影响固体支器结合性接受器及免疫微脂粒络合物间之结合度,并影响可检定之记号之制造。
分析法之进行中,通常使用水性之介质。亦可使用其它极性溶剂,通常为1至6个碳原子,更常为1至4个碳原子之氧化之有机溶剂,包括醇类,醚类等。这些潜溶剂通常以40体积%以下之量,而更常以20体积%以下之量存在。
介质之pH通常介于约4至10之间,更常在约5至9之范围间,而以约0.5至8.5间更理想。pH乃选择能保持接受器之特定结合力达显著程度,但又能制得最适宜之记号者。于某些实例中,乃采取介于两者间之折衷办法。可使用各种不同之缓冲液以得到期望之pH并于测定期间保持pH值。缓冲液之实例包括硼酸盐,磷酸盐,碳酸盐,Tris,Tris HCl,二乙基丙二醯脲等。所使用之特殊缓冲液于本发明中并不苛定,但于单一分析法中,则缓冲液比其它理想。
通常系使用适当之温度以进行此分析,并于分析期间中保持恒定之温度。可应用之测定温度一般乃介于约10°至50℃之范围间,最好介于约15℃至40℃间,以约22℃更佳。
待分析之分析物浓度一般乃于10-4至10-15莫耳间变换,而更常介于约10-6至10-13莫耳间。考虑事项诸如分析是否为定性,半定量或定量,以及特殊之检定技术及重要分析物之期望浓度等通常可决定其它试剂之浓度。
虽然各种不同试剂之浓度一般乃藉由重要分析物物之期望浓度范围而决定,但经验上每一试剂之最终浓度通常系以可使分析灵敏度达最理想者(超过依重要分析物之浓度范围所决定者)来决定。
接受器结合至惰性固体表面上之结合作用可使用任何熟练技工可用之技术而达成。这些技术包括(但不限定于)吸附于吸收法,离子键,共价键,氢键等。典型上,系用玻璃或非水溶性聚合物作为供接受器所用之支器。支器可为任何形状或形式。例如,此处可使用平滑物体,诸如玻片,聚合盘或条,试管壁或广泛可用之珠等作用支器。接受器与支器间之键必需强固,使得普通之清洗步骤或与水溶液(包括测试血清)之结合作用均不能破坏此键。
一种适当之化学结合形式系于固体支器及计接受时器间提供具有共价特性之桥梁。基此目的,故选择含有或提供有适当反应官能基团例如胺基团,羟基团及羧基团等之固体支器,使得接受器能够轻易地结合至固体支器上。介于固体支器及接受器之间之特别有用之桥梁系为具有共价特性之化学键者。
通常,有用以作为惰性支器及接受器间桥梁之官能基团系由下列所示者择定:
接受器-NH-CS-NH-支器
接受器-NH-CO-NH-支器
接受器-N=N-支器
接受器-O-CO-支器
接受器-NH-CO-支器
接受器-CO-NH-支器
接受器-NH-C(=O)-O-支器
接受器-NH-C(=NH)-NH-支器
介于接受器及支器间之特殊桥梁并不为本发明分析法中之苛定部分。桥梁可为任何型式,或任何型式之混合物,其惟一目的乃避免接受器由支器由支器上被清洗掉。此桥梁通常为亲水性,且对配合基一接受器之结合系为惰性。
具有三度空间网之聚合物系为此处有用之惰性固体支器。于水或水溶液中可胀大之此聚合物系为完全不可溶,且通常被视为惰性。聚合物之适当实例为藉由含有多数羟基团之交联物质诸如碳水化合物及糖醇(例如葡聚糖,淀粉,糊精及其它多糖等)及聚乙烯醇等,与二官能性物质(例如,X-R-Z型之物质,其中X及Z为囟素或环氧基团,且R为二官能性物质之余物,通常为3至10个碳原子之脂族碳键)所得之共聚作用物。
接受器系于温和之情况下结合至惰性聚合物上,以避免降低其免疫化学反应力。
本分析法中,特别有用之支器系为玻璃(玻片,珠粒等),胶乳及水胀胶诸如Sephadex及聚丙烯醯胺等。支器最好系使用可得到大结合带之形式者,以微粒或珠粒形式最适当。
本发明之分析法最好为均质分析法。故固体支器之大小及/或密度必须选择能对标记化合物提供最小之背景干扰(如光散射等)者。如果遭遇干扰,则必须使用大微粒及/或高密度微粒,使得微粒能沈积至分析管之底部数分钟,因此消除对标记化合物检查力之任何干扰。此延迟作用可藉于试剂之混合及分析之判读期间,将短暂(1-2分)之延迟作用并入,而被包括于自动化分析系统中。
本发明分析法可藉由下述免疫微脂粒之制备法阐述之。其它体现之免疫微脂粒则可藉由类似之方法制得。
许多方法可制备微脂粒。部分乃用以制备小囊胞(d<0.05微米),部分用以制备大囊胞(d>0.05微米)。部分乃用以制备多层状囊胞,部分则制备单层囊胞。本发明中,以单层囊胞较理想,此乃因膜上一发生溶解则表示整个囊胞发生溶解。然而,亦可使用多层状囊胞,其或许仅具有较低之效力。微脂粒之制法乃彻底地描述于某些论文中,诸如Sjoka及Papahadjopoulos,Ann.Rev.Biophys.Bioeng.,9 467(1980),Deamer及Uster,于Liposomes,ed,M.J.Ostro,Marcel Dekker,New York,1983,p.27-51中。最近公布之专题论文LiposomeTechnology,ed.G.Gregoriadis,CRC Press,Boca Raton亦含有最新式之讯息,尤其于第1册中。
二油基磷脂醯乙醇胺(DOPE)于室温及中性pH下并不形成稳定之双层微脂粒。然而,稳定之单层微脂粒系藉将DOPE与最小量之12%之击抗原化脂质,N-(二硝基苯胺基己醯基)-磷脂醯乙醇胺(DNP-cap-PE)混合而制得。当这些含有自动淬火萤光染料诸如calcein等之微脂粒与已吸附于玻璃表面上之兔子抗-DNPIgG进行结合时,微脂粒发生溶解,且释出自动淬火之萤光染料至介质中。正常之兔子IgG具有很小之效应。游离之兔子抗-DNP IgG仅能诱导微脂粒发生集合,但不能导致任何染料释出。当含有二油基磷脂醯胆碱及DNP-cap-PE之微脂粒加至已涂附有兔子抗-DNPIgG或正常兔子IgG之玻璃表面上时,并不能使微脂粒溶解,此乃因磷脂醯胆碱不能形成HII相之故。
如上所述,分析法之设计系以未饱和PE于生理情况下无能力形成稳定双层微脂粒者为基础(Reiss-Husson,J.Mol.Biol.,25 363(1967);Rand et al.,Chem.Phys.Lipids,6 333(1971);Callis et al.,Biochem.Biophys.Acta,559 399(1979))。测定能稳定DOPE双层微脂粒所需之DNP-cap-PE之最小量,使得小扰动可导致双层中配合基一脂质络合物之有效浓度之降低,并导致双层之去稳定。扰动因素乃被设计为配合基一脂质络合物与固定,多价抗一配合基之结合作用。最小量可随着温度,pH及分析法中所用之配合基或抗一配合而变,然而,适当之量可藉由熟知技艺中使用之例行实验(以此处及其它可用文献中所述之原则为基础)来决定。
不欲涉及任何特殊之理论,故本发明分析法之原理乃被解释为磷脂之侧相分离。如图8所示配合基一脂质络合物系以约1×10+8cm2/sec之扩散系数而于流体脂质双层之平面中快速扩散(参见review,peters,Cell Biol.Intern.Rpts.,5733(1981))。此乃指,其仅花费1秒以下之时间供配合基一脂质络合物扩散至微脂粒及抗一配合基(抗-配合基系已结合至玻璃表面上)间之结合带上。结合后,免疫络合物之形成可避免配合基一脂质络合物由表面随意扩散出。故令配合基一脂质络合物快速置入结合带中。此种侧相分离有效地降低微脂粒巨大双层中配合基一脂质络合物之浓度,并导致微脂粒之去稳定。于室温下,整个过程仅费数秒更少。虽然此机转尚属推论,但其与所观察到者(即游离之二价抗体并不导致微脂粒之漏损)一致。二价抗体结合至配合基一脂质络合物上之结合作用不能发生广泛之相分离。事实上可观察到,被二价抗体所交联之微脂粒乃发生集合现象。
本发明之分析法及产品乃更进一步地以下列实例阐释之,其有助于了解本发明,但并不意指本发明之范围仅限于此,本发明之范围系于附加之请求专利事项中说明之。除非另有说明,否则此处之百分比均为莫耳比,所有温度均以摄氏温度表示,且均未修正。
实例1
藉DNP-cap-PE使DOPE微脂粒双层稳定之程度
吾人乃藉90°光散射度(于600nm下)来检定稳定微脂粒之形成。欲测定DNP-cap-PE(其可稳定DOPE双层)之最小量,乃将各种不同量之DNP-cap-PE与DOPE或DOPC混合,再将脂质混合物于光散射之测量前,先音波化20分钟。当形成稳定之音波化微脂粒时,悬浮液之混浊度变低,因而检定出之光散射度为低。如图1所示,DNP-cap-PE之浓度高于12%时,则可产生稳定之DOPE微脂粒。当介于6至11%间时,微脂粒悬浮液相当混浊,因而该示高值之光散射度。6%以下则可见脂质之大量集结块,光散射度并再次变低。即使于延长之音波作用后,纯DOPE(无配合基一脂质络合物)亦仅能形成大集结块。对比之下,于所有浓度之DNP-cap-PE存在下,DOPC均形成稳定,低光散射度之微脂粒。因此结论为,吾人需要最小浓度为12%之DNP-cap-PE以供稳定之DOPE微脂粒之形成,此组成物系供其后之所有实验使用。
实例2
微脂粒之大小
以负性染色电子显微术检查之结果,含有DOPE:DNP-cap-PE(88∶12)之音波化微脂粒(其后称之为DOPE微脂粒)之大小系为单层且较为均质(图2),微脂粒之平均直径为908±134埃。
实例3
微脂粒之内含容量
得知DOPE微脂粒之平均直径后,再根据Enoch et al.,Proc,Natl.Acad.Sci.USA,76 145(1979)之法所计算出微脂粒之内含容量为2.66微升/微莫耳脂质。内含容量并亦可于移去未置入之calcein(藉由胶过滤法)后,藉由测量置入微脂粒中之calcein量而直接得之。此法为首先设定萤光强度对calcein浓度(0至0.5微莫耳)之标准曲线;再测量另含有微量十六基〔3H〕胆甾基醚之微脂粒悬浮液中之3H-cpm以测定脂质块。假设微脂粒内之calcein浓度为40微莫耳,则内含容量被测定为2.08微升/微莫耳脂质。此乃与由微脂粒大小所计算出之值一致。DOPE:DNP-cap-PE(88∶12)微脂粒(此后称之为DOPC微脂粒)之内含容量为0.54微升/微莫耳,此系指此种微脂粒之大小比DOPE微脂粒小得多。含有calcein之DOPE或DOPC微脂粒可于4℃下稳定储存至少一星期而无显著之染料漏失。
实例4
微脂粒一抗体相互作用后,染料之释出
欲测量微脂粒之溶解作用,故将40微莫耳浓度之calcein置入微脂粒内。此浓度之calcein萤光系可自动淬火。当染料由微脂粒中漏出时,则大大地增强萤光强度(Allen et al.,Biochim.Biophys.Acta,597 418(1980))。使用已涂附有各种不同型蛋白质之玻璃表面来测试由微脂粒中诱导calcein释出之能力。如同图3所见,纯玻璃表面及涂附有BSA之玻璃表面均不能诱使微脂粒漏失。然而,当DOPE微脂粒与涂附有抗-DNP IgG进行结合时,则所有内含之calcein均释出。涂附有正常IgG之玻璃表面亦具有某些效应,但其程度远逊于涂附有抗-DNP IgG者。事先以游离击抗原,DNP-Gly处理玻璃表面,或事先将含有游离抗-DNP IgG之微脂粒保温均可阻碍染料之释出,然而将含有游离之正常IgG或BSA之微脂粒事先保温则不能。这些结果强烈地指出,染料由DOPE微脂粒中释出系为抗体一击抗原于玻璃表面上结合之直接结果。DOPE微脂粒系非常稳定;故无任何测试之玻璃表面之型式可诱使染料释出(图4)。
实例5
固定化抗体之浓度对染料释出之效应
玻璃表面之涂附过程中所使用之IgG溶液之浓度亦为可变。图5显示,染料之释出系依玻璃表面上之抗体浓度而定。玻璃表面上所涂附之抗-DNP IgG之浓度大于1微克/ml时,则几乎所有的染料均释出。此浓度以下,则渐次地降低释出量。于高浓度(10微克/ml以上)下,正常IgG对微脂粒之溶解作用方面亦具有非特定之效应,然而其程度远逊于由抗-DNP IgG所引起者。于下列之实例6中,系将10微克/ml浓度之IgG涂附至玻璃表面上。
实例6
游离系抗原对染料释出之抑制力
吾人亦检定游离击抗原对微脂粒溶解作用之抑制效应。由图6可见,游离击抗原DNP-Gly可有效地抑制染料由DOPE微脂粒中释出。引起50%抑制力之游离击抗原之浓度被算得为0.35微莫耳,其乃相当于在40微升之预保温介质中占14×10-12莫耳。一种非抗原性类同物,Gly,即使于1毫莫耳之浓度下,对染料之释出亦不具效力。
实例7
游离抗体对染料释出之抑制力
即使于10mg/ml下,游离之抗-DNP IgG亦不能导致染料之释出。然而,当抗-DNP IgG与微脂粒预先共同保温时,则可目视到DOPE或DOPC微脂粒发生集结作用。DOPE微脂粒与游离抗-DNP IgG(非正常IgG)之预保温作用可抑制染料之释出(图7),能发生50%抑制力之游离抗体之浓度为0.5mg/ml,其相当于在5微升预保温之体积下占2.5微克。
物料
二油基磷脂醯乙醇胺(DOPE),二油基磷脂醯胆酸(DOPC)及N-(二硝基苯胺基己醯基)一磷脂醯乙醇胺(DNP-cap-PE)系由Avanti Polar Lipids,Inc(Birmingham,AL)购得。Calcein,N-(二硝基苯基)-甘胺酸(DNP-Gly)及甘胺酸系由Sigma Chemical Co.(St.Louis,Mo)购得。其它试剂则为分析级。
抗体
以微DOP析出之牛血清白蛋白(BSA)类免疫兔子,再由兔子来制得抗-DNP血清(Eisen et al.,Meth.Immunol.Immunochem.,1 351(1967)),其系为Dr.Stephen Kennel所赠之大礼。IgG部分系藉蛋白质-A亲合性色层分析法而由血清中纯化出(Warr,Antibody as a tool;The applications of Immunochemistry,Marchalonis and Warr,eds.,59-96(John Wiley and Sons,New York,(1982)),再于-20℃下储藏于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。藉由将40微升之各种不同浓度之IgG溶液加至干净玻片上直径为1.5cm之点上而使抗体与玻璃表面结合。于室温下20分钟后,以6至8mlPBS彻底清洗玻片,再将点以外之处吸干,而后立刻用以供接下之学实验用。
微脂粒之制备
于例行之实验中,首先乃将DOPE或DOPC(8.8微莫耳),DNP-cap-PE(1.2微莫耳)及微量之十六基〔3H〕胆甾基醚(最终之比活度为5.7×109cpm/mol混合,再使用N2气流将溶剂蒸发光。将干燥之脂质予以真空干燥至少30分钟。再加入一百微升含有4微莫耳calcein之PBS(pH7.4)。令混合物于室温下,于浴音波计(Laboratory Supplies,Inc.,Hicksvile,NY)中音波化20分钟,直至得到均匀半透明之微脂粒悬浮液为止,而后将微脂粒悬浮液置于Biogel A 50M柱上进行色层分析以移去未置入之calcein。再使用PBS以于空体积部分中洗提微脂粒,继而计算其3H放射性,收集并于4℃下储藏之。
微脂粒-抗体之交互作用
将微脂粒悬浮液(每5至45微升中占0.9至1.9×10-9莫耳之脂质)加至已事先涂附有IgG之玻片之点上。于湿室中,于室温下保温20分钟后,以2mlPBS润洗玻片使能定量地将微脂粒移至石英小池中。使用Perkin Elmer LS5分光萤光计而于λex=490nm及λex=520nm下测量萤光,加入去氧胆酸钠使最终浓度为0.12%后,可测量微脂粒中全部之calcein萤光。染料之释出百分比乃定义如下:
释出%= (F-FO)/(Ft-FO)
其中Fo及F分别为微脂粒样本与固定化抗体进彳交互作用前及交互作用后之calcein萤光强度。Ft为加入去氧胆酸盐后,所释出之全部calcein之萤光强度。
为抑制染料之释出,可于加入微脂粒前,先将40微升之游离抗原加至已附着于玻片上之固定化抗体中,并于室温下保温20分钟。为抑制游离抗离,则可于加至玻片前,先将等量之微脂粒及抗体混合,并于室温下预保温20分钟。
微脂粒之90℃光散射度
欲测试微脂粒之形成,故将音波化之脂质以PBS稀释100倍。使用缝宽为3nm之Perkin Elmer LS5分光萤光计,而于λex=λex=660nm下测量90°光散射度。
电子显微术
使用0.5%水性醋酸双氧铀将微脂粒(0.75微莫耳/ml)予以负性染色,再于Hitachi600电子显微镜(于76KV下操作)下观察之。微脂粒之大小系以放大之显微照相图片测量。
本发明之方法可广泛地应用至各种不同之分析物上。多株及单株抗体均可藉由使用标准免疫技术至多数分析体上而增加。此处亦可使用其它之溶膜技术,例如,使用本发明分析法以检定酵素或酵素基质之检定法亦可以类同于前述之抗原或抗体检定法完成。
通常,已偶合至适当脂质(如需要的话)上之酵素基质系与HII形成脂质(诸如DOPE等)混合以形成含有标记(诸如萤光染料等)之稳定微脂粒。微脂粒及适当酵素(已结合至固体支器上)间之交互作用可导致微脂粒之溶解,并释出萤光染料。染料释出量之校正可藉使用标准酵素或基质浓度完成,而生物测试中,染料之释出量被未知量之酵素或基质抑制之程度可被测定,浓度则由标准点计算出。
可被本发明分析法检定出之酵素包括(但不限定于)氧化还原酶诸如醇去氢酶,甘油去氢酶,二羟醋酸盐还原酶,L-乳酸盐还原酶,萍果酸盐还原酶,6-磷酸葡糖去氢酶,1-磷酸甘露糖醇去氢酶,L-乳酸盐去氢酶,葡萄糖氧化酶,半乳糖氧化酶,L-胺基酸氧化酶,D-胺基酸氧化酶,多酚氧化酶,抗坏血酸盐氧化酶,过氧化氢酶,过氧化物酶等;水解酶诸如羧酸酯水解酶,胆碱酯酶,磷酸单酯水解酶碱活性磷酸酶,磷酸二酯水解酶,磷脂酶C(当用以形成微脂粒之脂质不为磷脂时)等;甙水解酶,包括α-淀粉酶,纤维素酶,溶菌酶,β-半乳糖甙酶,戊基葡萄糖酶,β-葡萄糖 酸酶等;肽基一胺基酸水解酶,羧肽酶A,肽基-肽水解酶,α-胰凝乳朊酶,木瓜酸,尿素酶,无机焦磷酸酶等;分解酶诸如碳-碳分解酶,如醛基分解酶,诸如醛缩酶等;碳一氧分解酶,如水解酶,诸如碳酸酐酶等;碳-氮分解酶,如氨分解酶,诸如组胺酸等。
本发明分析法可用以检定并计算生物样本中循环荷尔蒙之浓度。这些荷尔蒙之抗体可藉由标准之免疫技术制得。将此抗体结合至惰性固体支器上则可令含有HII形成性脂质及荷尔蒙一脂质络合物之微脂粒发生溶解。一种染料或酵素可被装入微脂粒中以作为标记化合物。这些荷尔蒙包括甲状腺激素诸如甲状腺素,三碘甲状腺原氨酸,甲状旁腺激素及降钙素等;胰内分泌激素诸如胰岛素,前胰岛素及增升糖素等;脑下垂体激素包括催乳素,肾上腺皮质刺激素,甲状腺刺激素,催产素及血管增压素等;子宫及胎盆内分泌激素诸如绒毛膜促性腺激素,胎盘催乳素,绒毛膜促甲状腺激素及松弛激素等;类脂醇激素包括雌素双醇,雌素酮,雌素醇,睾丸素酮及二氢基睾丸素酮等;生长因素诸如尿胃素,神经生长因素及somatomedins等。
同样地,本方法可施用至细胞内传递者,环状核酸及前列腺素上。
本发明同样地亦可施用至循环系统方面之药物之筛选上,这些药包括心性甙(cardiac glycosides);狄各新(digoxin);洋地黄毒素(digitoxin),镇痉剂,二苯基内醯脲,mesantoin,苯基巴比特鲁(phenobarbital)及5-乙基-1-甲基-5-苯基巴比特酸(mephobarbital)等。特别重要者为那些具有微小治疗指数之药;亦即吾人需要具有疗效之最小循环值,如使用较高之值则反而产生毒性或有害反应。
本步骤亦可用以筛选对抗抗生素所引起之抗体,亦或施用至抗生素本身上,抗生素包括青霉素(penicillins)头牙胞菌素(cephalosporins),噻嗯霉素(thienamycins),clavulanic acids,monobactams,链霉素(streptomycin,及四环素类,(tetracyclines),氯四环素(chlortetracycline),氧四霉素(oxytetracycline)及四环素(tetracycline),氯霉素(chloramphenicol),红霉素(erythromycin),卡洛霉素(caromycin),多黏杆菌素B(polymyxin B),治疗需氧格兰氏阴性杆菌之感染所用之胺基糖苷抗生素如健他霉素(gentamycin),阿米卡辛(amikacin),土霸霉素(tobramycin),卡那霉素(kanamycin)及新微素(neomicin)等可藉本发明法分析。
同样地,本法可用以检定及估计药物诸如阿片剂一吗啡,海洛因,美拍利定(meperidine)及methadone等;麦角膺碱诸如麦角酸二乙醯胺等;marijuana;巴比特酸盐及可卡因(cocaine)及其衍生物等之滥用。
本法并不限定于小分子。大分子类诸如DNA,及大抗原(如蛋白蛋白等),均可直接或与适当脂族联结后,用以与HII形成性脂质共同形成稳定之微脂粒囊胞。故,本发明亦可用以检定大分子类诸如大抗原,血浆蛋白,肝炎联结性抗原,组织配合性标记等。
既然本发明极易进行,且未使用不稳定或危险之试剂,故本分析法可在比典型之诊断实验室之设备更差及更不复杂之环境下应用。例如,本分析方法可施用至筛选食物及周围毒素上。于食物筛选方面,重要之抗原系为霉菌毒素及天然毒物。其包括主要之毒素如aflatoxins,赭毒素(ochratoxin),巴秋灵(patulin),青霉酸,Zearelonone及tricothecene毒素等,以及由食物中自然产生之毒性代谢物诸如番薯酮等。除了天然毒物外,尚有各种不同之周围污染物存在于食物中,即使其仅是微小之量,但亦对人类产生显著之威胁。彼等可为单一副产物或农药,如多氯化之联苯,氯化之二苯并-p-二喔星,氯化之二苯并呋喃,七氯环氧化物,狄氏剂及DDT,1,1′-(2,2,2-三氯基乙叉)-双(4-氯苯)等。
本发明(包括理想体现)业已详细描述。然而,由熟知技艺中可得知,依据所公布之考虑事项,吾人将本发明进一步地进行修正及改良,而使其仍介于本发明之范畴及精髓内(示于下列之请求专利部分中)。
图6中:
50%抑制力〔DNP-GLY〕=0.35×10-6
施用量=40μl
灵敏度=40×10-61×0.35×10-6
(根据50%抑制度而言) 莫尔/升
=14.19×10-12莫尔
=14.19p莫尔
图7中:
LOG(游离AB)INmg/ml(事先与DOPE微脂粒共同保温)
固定化XDNP-Ab之量=40μlOF(0.12mg/ml)
50%抑制力〔游离×DNP-1gG〕=0.50mg/ml(MW=150.000)
与微脂粒共同保温之总量 =5μl
灵敏度=50g/L×5×10-6× (1莫尔)/150,000
(根据50%抑制力而言)=1.67×10-9莫尔
=1.67n莫尔
Claims (35)
1、一种检定或定量测试流体中重要生物分析物之免疫分析法,其特征在于:
(a)形成含有重要分析体及标记化合物之微脂粒
(b)提供一种已与拉受器(供接受重要分析体用)结合之固惰性支器
(c)将上述之测试液与上述步骤(b)之接受器一固相支器混合一段充分之时间以使上述之接受器与上述测试液中存在之任何分析物达饱和;
(d)将上述步骤(a)所形成之微脂粒与上述步骤(c)之饱和接受器-固相支器相混合;
(e)测定步骤(d)中微脂粒所释出之标记化合物是否存在。
2、根据权利要求1所述的免疫分析法,其中步骤(e)更进一步地还要定量标记化合物之释出量并测定测试液中之分析物之存在量。
3、根据权利要求1所述的免疫分析法,其中上述之重要分析物系为抗原。
4、根据权利要求1所述的免疫分析法,其中上述之重要分析物系为酵素。
5、根据权利要求1所述的免疫分析法,其中上述之重要分析物系为药。
6、根据权利要求1所述的免疫分析法,其中上述之微脂粒乃含有HII形成性脂质及分析物一配合物络合物之混合物。
7、根据权利要求1所述的免疫分析法,其中上述之固相惰性支器系为玻璃。
8、根据权利要求7所述的免疫分析法,其中上述之玻璃支器系为珠粒之形式。
9、根据权利要求1所述的免疫分析法,其中上述之固相支器系为一聚合物。
10、根据权利要求9所述的免疫分析法,其中上述之聚合物系为胶乳。
11、根据权利要求10所述的免疫分析法,其中上述之胶乳系为珠粒形式。
12、根据权利要求1所述的免疫分析法,其中上述之标记化合物系为自动淬火之萤光染料。
13、根据权利要求12所述的免疫分析法,其中上述之自动淬火萤光染料系为calcein。
14、根据权利要求1所述的免疫分析法,其中上述之混合步骤(d)乃导致微脂粒膜之溶解。
15、一种检定或定量测试流体中重要之生物接受器之免疫分析法,其特征在于包括:
(a)形成含有相关于重要生物接受器之配合基及标记化合物之微脂粒;
(b)提供一种已与重要生物接受器结合之固相惰性支器;
(c)将上述测试液与步骤(a)之微脂粒混合一段充分之时间,令上述微脂粒上之结合位与上述测试液中存在之任何重要接收器起反应。
(d)将上述步骤(c)之反应微脂粒与上述步骤(b)之固相结合接受器混合;
(e)测定步骤(d)中微脂粒所释出之标记化合物是否存在。
16、根据权利要求15所述的免疫分析法,其中步骤(e)更进一步地还要定量标记化合物之释出量,并测定测试液中接受器之存在量。
17、根据权利要求15所述的免疫分析法,其中上述之重要接受器系为抗体。
18、根据权利要求17所述的免疫分析法,其中上述之配合基系为抗原。
19、根据权利要求15所述的免疫分析法,其中上述之微脂粒含有HII形成性脂质及接受器或接受器一脂质络合物之混合物。
20、根据权利要求15所述的免疫分析法,其中上述之固相支器为玻璃。
21、根据权利要求15所述的免疫分析法,其中上述之固相支器系为聚合物。
22、根据权利要求15所述的免疫分析法,其中上述之标记化合物系为自动淬火之萤光染料。
23、根据权利要求22所述的免疫分析法,其中上述之自动淬火萤光染料系为calcein。
24、根据权利要求15所述的免疫分析法,其中上述之混合步骤(d)乃导致膜之溶解。
25、根据权利要求6或19所述的免疫分析法,其中上述之HII形成性脂质系为磷脂醯乙醇胺或其衍生物。
26、根据权利要求25所述的免疫分析法,其中上述之磷脂醯乙醇胺衍生物系由二油基磷脂醯乙醇胺及蛋磷脂醯乙醇胺所择定。
27、一种供检定重要生物分析物之系统,其特征在于包括:
(a)已置入微脂粒中之萤光物质及重要分析物。
(b)供上述分析物(已结合至固相支器上)用之接受器。
28、根据权利要求27所述的系统,其中上述之重要分析物系为抗原。
29、根据权利要求28所述的系统,其中上述之接受器系为供上述抗原所用之抗体。
30、根据权利要求27所述的系统,其中上述之微脂粒乃含有二油基磷脂醯乙醇胺及抗原一脂质络合物。
31、根据权利要求27所述的系统,其中上述之固相支器系为玻璃。
32、根据权利要求31所述的系统,其中上述之玻璃支器系为珠粒之形式。
33、含有大量标记化合物及大量测剂之免疫分析组套,其特征在于:其适于供制备(a)事先测定之配合基一脂质络合物;(b)含有上述络合物及上述标记化合物之稳定微脂粒;(c)标准分析物;及(d)标准接受器。
34、供检定测试样本中分析物配合基是否存在之免疫分析组套,其特征在于有:(a)含有标记化合物及上述配合基之适当微脂粒,(b)已有抗配合基接受器(供上述配合基用)结合于上之固体支器;及(c)含有已知量之上述分析物之对照组。
35、供检定测试样本中分析物抗配合基是否存在之免疫分析组套其特征在于包括:(a)含有标记化合物及同质配合基(供上述抗配合基用)之稳定微脂粒:(b)已有抗配合基结合于上之固体支器;及(c)含有已知量之上述抗配合基之对照组。
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1985
- 1985-04-01 CN CN 85101019 patent/CN85101019A/zh active Pending
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