CN220004073U - 一种可控开放式的微流控玻璃化冷冻芯片 - Google Patents
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Abstract
本实用新型公开一种可控开放式微流控玻璃化冷冻芯片,主要包括芯片本体和密封贴;所述芯片本体上集成有微流换液管、细胞筛和数字液滴流量计,所述微流换液管和数字液滴流量计相连,所述细胞筛布置在微流换液管内;所述芯片本体还设有将微流换液管与外部连通的冻融孔;所述密封贴与冻融孔配合使用,用于在微流控细胞玻璃化冷冻操作过程的预设步骤中封闭冻融孔。本实用新型通过在微流控芯片上设置与密封贴配合使用的冻融孔,使得冷冻过程中生物样品可最快速度接触液氮,减小冷冻过程因降温速度太慢引起的生物样品活性降低的风险。
Description
技术领域
本实用新型属于生物样品微流控细胞玻璃化冷冻操作技术领域,具体涉及一种可控开放式的微流控玻璃化冷冻芯片。
背景技术
低温冷冻保存生物样品通常是指在超低温(零下196摄氏度)的液氮中保存活体,以维持其融化复原后的活性。低温保存技术当前被广泛应用于细胞、组织和器官的长期储存并且已经在诸多领域获得突破性的进展,例如在辅助生殖领域(卵子、精子、胚胎的冷冻等)以及干细胞冷冻领域等。玻璃化冷冻法是通过添加高浓度的冷冻液使得细胞在超低温环境下快速冷冻(冷却速度约10000摄氏度每分钟),形成不规则的玻璃化样固体,避免了冷冻的过程中生成冰晶。由于其冷冻速度快以及对细胞的损失小(没有产生冰晶),玻璃化快速冷冻技术是现在最常用的低温冷冻保存技术。然而,玻璃化冷冻技术的一大难点是细胞会被暴露在高浓度的冷冻液中,而高浓度冷冻液是对细胞有化学毒性。为了解决这一问题,常见的解决方案是对细胞逐步换带浓度梯度的缓冲液以及冷冻液,让细胞逐步接触和适应浓度从低到高的冷冻液以缓慢达到内外渗透压的平衡,减小化学毒性。
当前细胞换液的方式有两大类,一是手动换液,二是自动化换液。然而,这两种换液方式都是用传统的类似移液枪稀释的方式,通常只能产生特定浓度梯度的平衡液和冷冻液,难以产生大范围的跨多个浓度的梯度,有进一步的改进空间。为了使得换液过程对细胞的活性的影响降到最小,理想的换液方式是产生从低到高连续的多个精确可控的浓度梯度。专利CN112430531A针对生物样品微流控细胞玻璃化冷冻操作提出了一种可数字化操作的装置,通过在微流控芯片内集成的数字液滴流量计实现了液体吸入移除的精确定量,可用数字式液滴生成的方式使生物样品周围的液体浓度梯度连续可调。该方案中冷冻过程通过需要加载负压,将液氮吸入芯片管道中使生物样品接触液氮,然而由于生物样品距管道入口有一定距离以及液氮本身物理性质,该吸取液氮的过程耗时长,降温速度慢可能引起生物样品活性降低。
实用新型内容
为解决上述问题,本实用新型针对生物样品微流控细胞玻璃化冷冻操作提出一种全新的可控开放式的微流控玻璃化冷冻芯片,通过在微流控芯片上设置与密封贴配合使用的冻融孔,使得冷冻过程中生物样品可最快速度接触液氮,减小冷冻过程因降温速度太慢引起的生物样品活性降低的风险。
本实用新型的技术方案如下:
一种可控开放式的微流控玻璃化冷冻芯片,主要包括芯片本体和密封贴;所述芯片本体上集成有微流换液管、细胞筛和数字液滴流量计,所述微流换液管和数字液滴流量计相连,所述细胞筛布置在微流换液管内;所述芯片本体还设有将微流换液管与外部连通的冻融孔;所述密封贴与冻融孔配合使用,用于在微流控细胞玻璃化冷冻操作过程的预设步骤中封闭冻融孔。
作为一种可选方案,所述冻融孔与细胞筛正对应设置,其中心点与细胞筛的中心点重合。
作为一种可选方案,所述冻融孔的尺寸大于或等于细胞筛内捕获的细胞的尺寸。
作为一种可选方案,所述冻融孔的形状为圆形、椭圆形、矩形、正多边形。
作为一种可选方案,所述密封贴包括相互连接的基底层和胶黏剂层,所述基底层选用具防水性能的灭菌生物惰性材料,所述胶黏剂层选用兼具黏性和防水性能的灭菌生物惰性材料。
作为一种可选方案,所述基底层的材料为PE、PET、PU、PVC中的任意一种;所述胶黏剂层的材料为CA、PU、硅树脂中的任意一种。
作为一种可选方案,所述密封贴中,基底层的厚度为0.03~0.2mm,胶黏剂层的厚度为0.02~0.05mm。
作为一种可选方案,所述密封贴为医用防水胶带。
作为一种可选方案,所述芯片本体为PP、PS、PMMA、COC、COP材料。
作为一种可选方案,所述芯片本体包括配合使用的主板和盖板;所述微流换液管、细胞筛和数字液滴流量计设置在主板上,所述冻融孔设置在盖板上。
与现有技术相比,本实用新型所提供的可控开放式的微流控玻璃化冷冻芯片,不仅能实现数字式浓度梯度连续精确可调,实现连续的数字式液体稀释,大大提高换液过程中细胞的活性;通过冻融孔和密封贴的配合使用,在生物样品冷冻前可将冻融孔打开,使得冷冻时生物样品和液氮可以最快速度接触,减小冷冻过程因降温速度太慢引起的生物样品活性降低的风险,提高生物样品玻璃化冷冻的成功率。
附图说明
图1为实施例所述可控开放式的微流控玻璃化冷冻芯片的三维结构组成示意图。
图2为实施例所述的可控开放式的微流控玻璃化冷冻芯片的平面结构图,其中:图2A示意的是芯片主板主视图,图2B示意的是贴有密封贴的盖板主视图,图2C示意的是芯片整体主视图,图2D示意的是芯片整体侧视图。
附图标注:1-主板,11-微流控换液管,12-细胞筛,13-数字液滴流量计,2-盖板,21-冻融孔,3-密封贴。
具体实施方式
下面将结合具体实施例和附图对本实用新型的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本实用新型一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本实用新型中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本实用新型保护的范围。
可以理解的,本实用新型中所述的“细胞”主要包括人或其他生物的卵母细胞、胚胎、干细胞和胚泡等生物样品。
结合图1至图2所示,实施例公开一种可控开放式的微流控玻璃化冷冻芯片,主要用于微流控细胞玻璃化冷冻操作(简称“微流操作”)中单个细胞吸取、挤出以及一体化冻融。该芯片主要分为三部分,即主板1与盖板2,以及具有生物兼容性的密封贴3。
芯片主板1上集成有微流换液管11、细胞筛12和数字液滴流量计13;芯片盖板2上设有冻融孔21。其中,主板1的厚度可选0.01~5mm,优选0.1~1mm;盖板2的厚度可选0.01~1mm,优选0.01~0.1mm。可以理解的,本实施例中,芯片主板1和盖板2共同构成芯片本体,芯片本体的材料可优选能被灭菌的生物惰性(也称生物兼容性)材料,并具备高导热性和高热扩散性,例如,可选择PP(聚丙烯)、PS(聚苯乙烯)、PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)、COC(环烯烃类共聚物)、COP(环烯烃类共聚物)等。主板1和盖板2可通过键合技术固定在一起。本实用新型对芯片本体的结构并不作限定,在它实施例中,芯片本体也可以由两个对称设计的半剖结构对齐键合,也即主板和盖板的结构除冻融孔的区别外其它基本相同。
其中,微流换液管11主要用于吸取细胞和液体,这里的液体包括微流操作中涉及到的培养液、平衡液、冷冻液、解冻液、稀释液、洗液等。细胞筛12主要用于捕获和固定细胞。数字液滴流量计13主要用于液滴的定量产生和移除,使生物样品周围的液体梯度连续可调。需要说明的是,上述三种部件的结构和工作原理并非本实用新型重点,本实用新型对此也不作具体限制,只要能实现相应功能即可,具体例子可参照美国专利US16538307以及中国专利CN112430531A,此处不再赘述。
其中,冻融孔21用于使细胞筛13处固定的细胞在冷冻时与液氮直接接触,其尺寸以及位置会一定程度影响冷冻效果。通常冻融孔21尺寸要大于或等于细胞的尺寸,也即其外轮廓能完全覆盖细胞的外轮廓,这样使得细胞能与液氮以最快的速度接触。由于不同细胞种类的尺寸差异非常大,以人类卵母细胞以及胚胎为例,冻融孔直径可选0.1~1mm,优选0.1~0.2mm。冻融孔21设置在微流换液管11区域,与微流换液管11相连通。优选的,冻融孔21的位置与细胞筛13的位置正对应,即二者的中心重合。冻融孔21通常为圆形,在其它实施例中也可选择椭圆形、矩形、正多边形、或其它规则或不规则形状。
其中,密封贴3主要用于微流操作中微流控细胞玻璃化冷冻操作中吸取、挤出细胞以及换液时封闭芯片,具体粘贴在冻融孔21处。密封贴3主要包括相互连接的基底层和胶黏剂层,其中,基底层可选用兼有防水性能的灭菌生物惰性材料,例如,PE(聚乙烯),PET(聚对苯二甲酸乙二醇酯),PU(聚氨酯),PVC(聚氯乙烯)等,其厚度范围0.03~0.2mm而胶黏剂层可选用兼高黏性和防水性能的灭菌生物惰性材料,例如,CA(丙烯酸树脂),PU(聚氨酯)以及硅树脂等,其厚度范围0.02~0.05mm。密封贴3的形状和尺寸通常与冻融孔21的形状和尺寸相适应,只要能保证密封即可。具体的,密封贴可采用现有的3M Nexcare医用防水胶带以及3M Transpore医用防水胶带等。
实施例2示出了细胞吸取和挤出以及细胞冻融的操作流程,可基于实施例1所示的开放式微流控玻璃化冷冻芯片,主要包含12个步骤。
步骤1,吸取培养液:使用前需将密封贴3贴在冻融孔上方,随后将开放式微流控玻璃化冷冻芯片分别与施压机构以及阀门连接,施压机构提供负压,阀门调至关闭状态。将开放式微流控玻璃化冷冻芯片插入装有培养液的容器中,细胞培养液被吸入并充满整个微流控芯片。
步骤2,吸取细胞:将微流换液管11对准目标细胞,将细胞连同培养液一同吸入微流换液管11中,细胞将卡在细胞筛12处。该步骤可与步骤1合并完成。
步骤3,吸取平衡液:将开放式微流控玻璃化冷冻芯片插入装有平衡液的容器中,施压机构继续提供负压,阀门关闭。平衡液被数字式地吸入芯片,培养液被数字式地移除。细胞周围的液体环境由初始的培养液被逐渐被平衡液替换,直至完全变为平衡液,步骤3结束。
步骤4,吸取冷冻液:将开放式微流控玻璃化冷冻芯片插入装有冷冻液的容器中,与步骤3相似,细胞周围的液体逐渐从平衡液变为冷冻液。
步骤5,定量移除微流换液管内部分冷冻液:将开放式微流控玻璃化冷冻芯片从装有冷冻液的容器中拔出,继续施加负压,定量可控地将细胞周围的液体继续移除。通过这种方式,可以细胞周围的液体量可以得到精确控制,可以根据需要,实现某个特定的量。对于生物样品的冷冻保存而言,细胞周围的冷冻液体积可保留0.5~1μL。
步骤6,吸除储液池内多余液体:打开阀门,将数字流量计13与大气相通;施压机构仍然施加负压,使得多余液体得以被吸除,由于微流换液管11两端的气压相等,通常为标准大气压,使得该过程中细胞周围的液体可以维持在原位。
步骤7,液氮冷冻:将开放式微流控玻璃化冷冻芯片与施压机构以及阀门分离,然后移除密封贴3,将开放式微流控玻璃化冷冻芯片放入液氮容器中进行液氮冷冻。液氮将通过冻融孔21直接进入微流换液管11,与下方的细胞直接接触,实现快速冷冻。
步骤8,低温保存:将冷冻好的装有细胞的开放式微流控玻璃化冷冻芯片放入低温容器中保存。
步骤9,吸取解冻液:将低温保存中的开放式微流控玻璃化冷冻芯片取出,重新将其于施压机构和阀门连接,并插入装有解冻液的容器中。施压机构提供负压,关闭阀门,吸取解冻也。需要注意的是,装有解冻液容器应被放置在热台上,将解冻液加热至相应温度,对于人体组织来说,应加热至37℃。
步骤10,吸取稀释液:将开放式微流控玻璃化冷冻芯片插入装有稀释液的容器中,继续保持负压以及阀门关闭,与步骤3相似,细胞周围液体逐渐从解冻液变为稀释液。
步骤11,吸取洗液:将开放式微流控玻璃化冷冻芯片插入装有洗液的容器中,继续保持负压以及阀门关闭,与步骤3相似,细胞周围液体逐渐从解冻液变为洗液。
步骤12,挤出细胞:施加机构提供正压,继续保持阀门关闭,将细胞推入预先准备好的装有细胞培养液的容器中。
由此通过本实用新型所提供的可控开放式的微流控玻璃化冷冻芯片在实现微流控细胞玻璃化冷冻操作的过程中,能以最快速度冷冻生物样品,减小冷冻过程因降温速度太慢引起的生物样品活性降低的风险,提高生物样品玻璃化冷冻的成功率。
最后需要说明的是,尽管以上结合附图对本实用新型的实施方案进行了描述,但本实用新型并不局限于上述的具体实施方案和应用领域,上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的,而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下,在不脱离本实用新型权利要求所保护的范围的情况下,还可以做出很多种的形式,这些均属于本实用新型保护之列。
Claims (9)
1.一种可控开放式的微流控玻璃化冷冻芯片,其特征在于,包括芯片本体和密封贴;所述芯片本体上集成有微流换液管、细胞筛和数字液滴流量计,所述微流换液管和数字液滴流量计相连,所述细胞筛布置在微流换液管内;所述芯片本体还设有将微流换液管与外部连通的冻融孔;所述密封贴与冻融孔配合使用,用于在微流控细胞玻璃化冷冻操作过程的预设步骤中封闭冻融孔。
2.如权利要求1所述的可控开放式的微流控玻璃化冷冻芯片,其特征在于,所述冻融孔与细胞筛正对应设置,其中心点与细胞筛的中心点重合。
3.如权利要求1所述的可控开放式的微流控玻璃化冷冻芯片,其特征在于,所述冻融孔的尺寸大于或等于细胞筛内捕获的细胞的尺寸。
4.如权利要求1所述的可控开放式的微流控玻璃化冷冻芯片,其特征在于,所述冻融孔的形状为圆形、椭圆形、矩形、正多边形。
5.如权利要求1所述的可控开放式的微流控玻璃化冷冻芯片,其特征在于,所述密封贴包括相互连接的基底层和胶黏剂层,所述基底层选用具防水性能的灭菌生物惰性材料,所述胶黏剂层选用兼具黏性和防水性能的灭菌生物惰性材料。
6.如权利要求5所述的可控开放式的微流控玻璃化冷冻芯片,其特征在于,所述基底层的材料为PE、PET、PU、PVC中的任意一种;所述胶黏剂层的材料为CA、PU、硅树脂中的任意一种。
7.如权利要求5所述的可控开放式的微流控玻璃化冷冻芯片,其特征在于,所述密封贴中,基底层的厚度为0.03~0.2mm,胶黏剂层的厚度为0.02~0.05mm。
8.如权利要求1所述的可控开放式的微流控玻璃化冷冻芯片,其特征在于,所述密封贴为医用防水胶带。
9.如权利要求1至8任意一项所述的可控开放式的微流控玻璃化冷冻芯片,其特征在于,所述芯片本体包括配合使用的主板和盖板;所述微流换液管、细胞筛和数字液滴流量计设置在主板上,所述冻融孔设置在盖板上。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |