CN108135155A - 制备用于低温程序的生物样品的装置及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了构造为对至少一种生物样品执行低温程序的装置以及用于使用该装置的方法。所公开的装置包括吸管和罩盖。吸管包括吸管空间，其构造为从吸管空间的远端朝吸管空间的近端吸取液体。罩盖联接至吸管的远端并且包括穿孔构件，穿孔构件包括至少一个孔口，所述至少一个孔口的直径小于至少一种生物样品的直径，其中穿孔元件构造为允许液体流入制备空间并允许液体从制备空间流出。持有空间构造为与吸管空间一起形成制备空间，其中至少一种生物样品可以经受低温程序。

Description

制备用于低温程序的生物样品的装置及方法

技术领域

本申请总体涉及用于生物样品显微操作的装置，更具体地涉及生物样品的玻璃化、培养、低温保存、解冻和/或加温以及使用这些装置的方法。

背景技术

在非常低的温度下保存生物样品、例如保存卵母细胞和胚胎被称为低温保存。低温保存的主要挑战之一是防止样品内的胞内液体变成冰晶。两种常用的低温保存技术是慢速冻结和玻璃化。

在慢速冻结过程期间，冰晶形成于胞间，并且结果剩余的液体变得高渗，因此允许胞内水离开细胞并通过外渗朝细胞外流通，由此防止胞内结晶。

在玻璃化中，通过非常高的冷却速率避免胞间和胞内水结晶。根据一些玻璃化方案，将样品插入非常冷的低温介质(例如液氮(LN)或LN浆液)中，由此导致非常高的冷却速率，这使得胞内和胞间液体玻璃化而不是结晶。

在一些方案中，玻璃化可以通过增加样品的粘度进一步实现，例如通过应用各种低温保护剂和/或其它适用的添加剂、通过减少样品的体积或通过其组合而进一步实现。例如，出版物“Vitrification of oocytes and embryos”(Amir Arav，“Embryonicdevelopment and manipulation in animal development”，A.Luria和F.Gandolfi编辑，波特兰出版社，伦敦，英国，1992)提出了一种将封闭在足以使细胞保留在生理条件下的液滴中的细胞玻璃化的方法。在该出版物中，Arav报道，即使利用低浓度的低温保护剂，在70纳升液滴体积的情况下也可以实现良好的存活率。

以下出版物中进一步描述了玻璃化：

“Titration of Vitrification Solution in Mouse EmbryoCryopreservation”(A.ARAV，L.GIANAROLI和P.S.SUSIANO，Cryobiology 25(6)，1988)提出通过降低胚胎暴露至低温保护剂溶液的时间和温度来降低玻璃化溶液的毒性。

“Osmotic and cytotoxic study of vitrification of immature bovineoocytes”(A.Arav，D.Shuhu和M.Mattioli，Journal of Reproduction and Fertility，99：353-358,1993)提出了为了确定适用于未成熟牛卵母细胞玻璃化的溶液成分所做的实验。

“New trends in gamete's cryopreservation”(Amir Arav，Saar Yavin，YoelZeron，Dity Natan，Izik Dekel和Haim Gacitua.Molecular and CellularEndocrinology，187：77-81,2002)提出了基于‘多热梯度’(MTG)冻结来改善精子、卵母细胞和胚胎冻结和玻璃化的技术。

“Measurement of essential physical properties of vitrificationsolutions”(S.Yavin和A.Arav.Theriogenology，67(1)：81-9,2007)检验了与成功玻璃化有关的主要参数，并且构成了玻璃化过程方面的指南。

“Embryo cryopreservation in the presence of low concentration ofvitrification solution with sealed pulled straws in liquid nitrogen slush”(Saar Yavin，Adaya Aroyo，Zvi Roth和Amir Arav.Human Reproduction，24(4)：797-804,2009)提出一种结合了LN浆液和密封式拉细吸管(SPS)的玻璃化方法。

美国专利申请2011/0207112(Burbank和Jones，2011年公布)公开了一种低温保存和复活卵母细胞、胚胎或胚泡的自动化系统和方法。一个或多个卵母细胞或胚胎定位于处理容器中，处理容器配置为允许流体流入和流出处理容器，其中两种或更多种流体流入和流出在其中具有卵母细胞或胚胎的处理容器。

PCT公布文献WO/2014/088514(NG和Vajta，2014年公布)涉及一种生产至少一种玻璃化细胞的方法，该方法包括将细胞装载到至少一个导管中的持有空间中；以增加的浓度向导管的持有空间提供至少一种低温保护剂，其中所述低温保护剂能够平衡细胞；将导管的持有空间中的细胞冷却以产生玻璃化细胞；以及将玻璃化细胞存储并维持在导管的持有空间中。

发明内容

根据本发明的一些实施例，公开了被构造为对至少一种生物样品执行低温程序的装置，该装置包括：

包括吸管空间的吸管，其构造为从吸管空间的远端朝吸管空间的近端吸取液体；以及

联接至吸管的远端的罩盖(pod)，该罩盖包括

穿孔构件，其包括至少一个孔口，所述至少一个孔口的直径小于所述至少一种生物样品的直径，其中穿孔元件构造为允许液体流入制备空间并允许液体从制备空间流出；以及

持有空间，其构造为与吸管空间一起形成制备空间，其中至少一种生物样品可以经受低温程序。

在一些情况下，所述至少一个孔口具有圆形横截面。

在一些情况下，所述至少一个孔口具有方形横截面。

在一些情况下，该装置还包括：联接至吸管的近端的泵。

在一些情况下，吸管是毛细管并且吸管空间是毛细空间。

本发明的一些实施例公开了一种能够联接至吸管的罩盖，该吸管构造用于对至少一种生物样品执行低温程序，该罩盖包括：

持有空间，其构造为在与吸管联接时与吸管空间一起形成制备空间；

穿孔构件，其包括至少一个孔口，所述至少一个孔口的直径小于所述至少一种生物样品的直径，其中穿孔元件构造为允许用于低温程序的液体流入持有空间并允许液体从持有空间流出。

在一些情况下，所述至少一个孔口具有圆形横截面。

在一些情况下，所述至少一个孔口具有方形横截面。

根据本发明的实施例，提供了用于对吸管中的至少一种生物样品执行低温程序的方法，其包括：

将至少一种生物样品装载到吸管中；

将吸管中的至少一种样品暴露至密度逐渐变化的溶液，同时

防止至少一种样品流出吸管。

在一些情况下，装载至少一种生物样品是通过毛细作用来执行的。

在其它情况下，装载至少一种生物样品是通过泵入至少一种样品来执行的。

在另外的情况下，装载至少一种生物样品是通过利用连通器理念来执行的。

此外，在一些情况下，暴露是通过更换吸管中的溶液来执行的。

在一些情况下，暴露是通过毛细作用来执行的。

而还在其它情况下，暴露是通过将逐渐变化溶液的层装载至吸管中来执行的。

此外，在一些情况下，将层进行装载是根据连通器理念来执行的。

附图说明

为了理解本发明并且在实践中看到它如何实现，现在将参照附图仅通过非限制性示例来描述实施例，其中：

图1是构造为将低温程序应用于生物样品的毛细装置的示意图；

图2A示出了根据本发明实施例的罩盖；

图2B示出了根据本发明的实施例的图2A的剖切图；

图2C示出了根据本发明的实施例的包括具有多边形横截面的周向壁的罩盖；

图2D示意性地图示了本发明的实施例中的孔口的纵向切口中的生物样品；

图2E示意性地示出了根据本发明实施例的可替代罩盖；

图2F是根据本发明的实施例的穿孔元件的图像；以及

图2G、图2H、图2I、图2J和图2K示意性地示出了根据本发明实施例的罩盖的二维表示；

图3A、图3B和图3C示出了根据本发明的实施例的罩盖200与毛细管108的联接；

图4是示出了根据本发明的实施例的为了制备玻璃化样品而采取的程序的流程图；以及

图5示出了根据本发明的实施例的其中具有四个不同液体层的吸管；以及

图6是示出了根据本发明的实施例为了制备玻璃化样品而采取的程序的流程图；以及

图7A、图7B和图7C示出了根据本发明的实施例的装载图5的吸管的阶段；以及

图8示出根据本发明的实施例将四种溶液装载到吸管中。

具体实施方式

在下面的描述中，对多于一个附图通用的部件可以由相同的附图标记表示。

此外，除非另外具体指出，否则本说明书中所描述或引用的实施例可以是对本文所描述或引用的任何其它实施例的补充和/或替代。

本文公开了本发明的实施例，这些实施例配置为玻璃化至少一种生物样品，即单一种样品或多种样品。然而，由于简单性的考虑且为了使描述更为易读，说明书中引用了“样品”。应该理解的是，除非另外具体指出，否则无论何时提及“样品”，同样应该也适用于“至少一种样品”。类似地，每当提及“样品”时，同样应适用于“至少一种样品”。

图1是毛细装置100的示意性展示图，该毛细装置构造为将低温程序应用于生物样品102。毛细装置100可以包括透明、半透明和/或不透明构件。相应地，尽管在图中，为了解释本发明，生物样品看起来好像该装置是透明的，但是位于毛细装置内部的生物样品102可能从外部看不见。

目前示出的装置具有含有两个端部的毛细管108。为了区分端部，这两个端部被指定为远端104和近端106。在远端中，装置包括穿孔元件110。在近端中，装置示出为具有手动泵112。注意到手动泵112的存在不是强制性的并且在一些实施例中不存在手动泵。此外，虽然图中的泵是手动泵，但这也不是强制性的并且在其它实施例中可以使用诸如是电动泵的另一种泵，或者甚至不同类型的手动泵。在毛细装置内部具有自由空间114，该自由空间构成“毛细空间”。与毛细管相似，毛细空间也具有远端(位于毛细管的远端)以及近端(位于毛细管的近端)。

参照本文所述的一些实施方案，低温程序包括培养、玻璃化、低温保存、解冻和/或加温等。在一些实施例中，低温程序可以是培养、玻璃化、冻结、冷冻干燥、低温保存、解冻和/或加温中的任一种。在一些实施例中，在有或没有培养的情况下，低温程序可以包括玻璃化和低温保存。在一些实施例中，低温程序可以包括低温保存和解冻或低温保存和加温。在一些实施例中，低温程序可以包括玻璃化、低温保存和解冻或玻璃化、低温保存和加温。然而，在一些实施例中，低温程序可以包括培养、玻璃化、低温保存和解冻或培养、玻璃化、低温保存和加温。本文中，描述是以玻璃化作为示例。然而，应该理解的是，除非特别指出，否则其它低温程序可以在下文中被提及，其中低温程序可以是诸如上述低温程序中的任何一种。

简称为“样品”的生物样品102可以来源于动物，包括但不限于人类、哺乳动物和脊椎动物。在一些情况下，生物样品可以是单细胞样品，例如卵母细胞或精子，而在其它情况下，生物样品可以是多细胞悬液。还在其它情况下，生物样品可以是组织，例如组织片，诸如卵巢组织切片或睾丸组织切片、胚胎或其它。在一些情况下，本发明用于处理生殖生物样品(例如卵母细胞和/或精子和/或胚胎和/或卵巢组织和/或睾丸组织等)。然而，本发明不限于生殖生物样品，并且其实施例可以针对其它种类的生物样品。将本发明与其它(非生殖)种类生物样品一起使用的一个非限制性示例是在可以将组织片送往分析之前制备取自活体的用于低温保存的组织片。

根据本发明的实施例，可以使用不同的方法将生物样品装载到毛细管的毛细空间中。众所周知，在没有诸如重力的外力辅助或甚至与其相反的情况下，毛细现象(也称为毛细作用或毛细运动)导致液体在狭窄空间中流动的能力。相应地，生物样品的质量影响通过毛细作用将生物样品装载到毛细管中的能力。对于小生物样品而言，细胞的装载可以通过毛细作用进行。对于较大的生物样品而言，装载可以使用诸如泵112的泵来进行以泵入样品。如果适用于该情况，泵也可用于装载小生物样品。本身已知的是，例如通过毛细空间的半径、液体的质量和样品的质量来实现确定样品是小或大以允许或防止其毛细装载。

图2A和图2B呈现了根据本发明实施例的称为罩盖200的装置。在图2A中呈现了整个罩盖，而图2B呈现了罩盖200中的为说明实施例的特征而示出的剖切图。罩盖200包括穿孔元件110。穿孔元件包括至少一个孔口202，所述孔口的直径足够小以防止生物样品流动通过，即至少一个孔口的直径小于生物样品的直径。应该理解的是，流动通过孔口的生物样品实际上从罩盖流出，并且在大多数情况下这意味着样品丢失。在不同的实施例中，孔口202的直径不应超过5μm(微米)或10μm或15μm或20μm或25μm或40μm或50μm或55μm或60μm或65μm或70μm或75μm或80μm或85μm或90μm或95μm或100μm或120μm或140μm或150μm或160μm或180μm或200μm或250μm或300μm或350μm或400μm或450μm或500μm或配置为小于生物样品直径的另一直径。

应注意的是，“至少一个孔口”涵盖了其中穿孔构件包括单个孔口的情况以及当穿孔构件包括多个孔口时的那些情况。

罩盖200包括周向壁204，其界定了罩盖中生物样品102可驻留的持有空间206。所示的罩盖200的实施例具有圆形横截面并且周向壁204也具有圆形横截面。然而，这不是限制性的并且周向壁可以具有不同的形状，例如图2C所示的具有多边形横截面的周向壁208。周向壁208可以被绘制为矩形周向壁、方形周向壁、五边形周向壁或具有任何其它基本/经典横截面的周向壁，以说明罩盖的周向壁的横截面可以是适用于情况的任何形状。如果适用，可能存在包括上述和其它横截面中的任何一种的罩盖。

在图2B中示出了穿孔元件110的剖切图，其中该剖切图暴露了三个孔口202中的纵向切口202a。纵向切口示出了孔口202实际上穿过穿孔元件110，从而允许直径小于穿孔直径的颗粒穿过穿孔构件。

此外，图2A、图2B和图2C示出了具有圆形横截面的孔口202。这也不是强制性的，并且如果适用，可以使用其它形式的孔口。例如，应该理解的是，在诸如负压的特定条件下，诸如卵母细胞的生物样品102可以在持有空间206内部被拉向穿孔元件202。例如如图2D所示，在这种条件下，生物样品可能倾向于穿透孔口。本发明的一个目的在于提高在低温保存后进一步解冻或加温的样品回收率，而样品穿透进入孔口会降低样品的存活和回收率。相应地，根据本发明的可替代实施例，例如图2E的可替代罩盖，使用具有方形横截面的孔口，从而降低生物样品穿透进入孔口中的倾向。

图2F是根据本发明的实施例的穿孔元件的图像，其中可以看到具有方形孔口210的穿孔元件110。

在进一步描述之前，应该考虑到迄今为止所描述的孔口的形式(圆形和方形)是非限制性的，并且可以存在具有不同形式和形状的其它孔口。例如，孔口可能是可以出现毛细流动所穿过的狭缝。

截至目前，在图2A至2F所描述的实施例中，罩盖的周向壁基本垂直于穿孔元件，这意味着两个表面(穿孔元件和壁)以基本上直角(90度)相交汇，并允许例如由于较小的形状变形而导致的1度、2度或3度的偏差。应注意的是，基本垂直也是非限制性的，并且在其它实施例中，穿孔元件和壁可以以比90度更宽或更窄的角度相交汇。此外，角度可能沿着壁改变。穿孔元件与壁的交汇角度α在罩盖的持有空间内部进行测量并标记为角度α。在角度沿着线改变的那些情况下，沿着壁存在其中标记为β的交汇角度呈现β≠α的至少一个位置。相应地，图2G、图2H和图2I示意性地示出了根据本发明的实施例的罩盖的二维表示，其中在图2G中α<90度、在图2H中α>90度并且在图2I中α≠β。

在罩盖的持有空间内部测量交汇角度α和β是惯例的问题，并且在一些实施例中，在持有空间的外部对角度进行测量。

可以沿着周向壁的上缘选择任何点，并在壁上画出从所选点至穿孔元件的最短线。这条线构成了“高度”。在迄今参照图2A至图2I所描述的实施例中，高度是直线。应该理解的是，在一些实施例中，例如图2J所示，穿孔元件可以形成非平面基部。类似地，壁可以不同于笔直而进行弯曲，例如图2K所示，其中壁朝着中心弯曲。

应该理解的是，如果适用，也存在前述实施例的组合。例如，图2A的圆形壁可以与图2E的方形孔口和/或图2J的非平面穿孔元件组合。任何其它组合也可适用，包括如下周向壁，所述周向壁就其朝向持有空间的一侧和外侧具有不同形状。

关于对若干罩盖的介绍，应该理解的是，罩盖通常包括器皿和持有空间。根据一些实施例，器皿包括周向壁和穿孔元件。该器皿在其近端包括至少一个开口并且在其远端包括多个孔口。

罩盖可以联接到毛细管，例如图1的管108。毛细管和罩盖在结构上是可以联接的。例如，图3A至图3C示出根据本发明实施例的罩盖200与毛细管108的联接。毛细管的开放远端接近罩盖200的周向壁204。为了将罩盖与毛细管联接，周向壁204的外部形式应该适配于毛细管位于和靠近管的远端开口处的形式，类似于钥匙对钥匙孔的适配。在图3B中，毛细管进一步接近周向壁，并且在图3C中，当罩盖锁定毛细管和/或反之亦然(即，毛细管锁定罩盖)时，联接得以实现。关于联接，罩盖的持有空间和毛细管的毛细空间可一起形成其中可以形成液柱的制备空间。此外，在一些实施例中，可以将罩盖和毛细管一起作为单个单元进行制造，其中可以将样品例如从毛细管/空间的近端装载到制备空间中。

关于解释如何形成制备空间，应当注意的是，根据本发明可以存在可替代方式。例如，代替通过压力将毛细管联接到罩盖，它们可以例如通过螺接而联接。根据另一个可替代实施例，毛细管和罩盖可以在毛细管装配在罩盖中时通过压力来联接，而不是将罩盖装配到毛细管中，例如3A至3C所示。只要结果是通过将具有穿孔元件的罩盖与毛细管联接而获得制备空间，则可以在此使用适用于该情况的任何其它可替代方案。

在其中将罩盖装配进毛细管或将毛细管装配进罩盖的那些情况下，应该理解的是，存在具有被抱持元件(hugged element)的元件。当罩盖装配毛细管时，正是管抱持罩盖而罩盖被管所抱持。当毛细管装配进罩盖时，罩盖是抱持元件(hugging element)而管是被抱持元件。已知在低温下不同的材料显示出不同程度的收缩。相应地，为了防止管-罩盖连接在低温下瓦解，抱持元件需要由相比于被抱持元件具有更高收缩系数的材料制成。例如，如果毛细管是由聚丙烯制成的抱持元件，则罩盖可以由聚碳酸酯制成。

在对根据本发明的一些装置介绍之后，现在关注用于低温保存生物样品的装置的使用方法。应该理解的是，由于毛细作用，当毛细管的远端(例如图1中的104)浸入液体中时，毛细空间将吸取液体，从而产生液柱。本文中，术语“浸入”是指使远端与液体接触，以便允许毛细作用在毛细管中形成液柱。另一方面，也可以使液体从毛细管的毛细空间内排出。排出可以通过例如使远端与具有足够强度附着力的材料接触来完成，该附着力足以克服在毛细空间中操作以持有液柱的附着力。例如，可以用吸墨纸甚至用吸收棉绒或棉花将液体排出。可替代地，可以通过使用例如联接到管近端的泵将液体推出毛细管，而不利用吸收材料排干毛细管。

上面已经解释的是，生物样品可以例如通过毛细作用而装载到毛细管中。此外，本领域已知玻璃化过程涉及样品所应浸入的溶液的变化。话虽这么说，图4显示了说明根据本发明的实施例的为了制备用于玻璃化的样品而采取的程序的流程图。

在402中，将样品装载至毛细管(例如108)的毛细空间(例如，114)。如前所解释的，装载例如可以通过毛细作用或通过使用泵来完成。应该注意的是，关于装载之后即刻，样品驻留在毛细空间内部，浸没在与装载之前所浸没的液体相似的液体中。因此，例如，假如样品在装载之前已经储存在持有介质中，那么在装载之后即刻会是样品浸没在毛细空间内的持有介质中。

在404中，罩盖联接到毛细管的远端。联接以适用于该情况的任何方式例如通过施加压力(参见图3A至图3C)、通过螺接等执行。罩盖的穿孔构件将防止样品无意中经由毛细管的远端脱离毛细空间。

玻璃化领域的技术人员应该理解的是，为了制备用于玻璃化的样品，样品需要浸没在一系列溶液中，这些溶液用低温保护剂逐渐替代天然驻留在样品中的水。在玻璃化的示例中，这些溶液本身已知为持有介质(HM)、平衡溶液(ES)和玻璃化溶液(VS)。持有介质可以是具有蛋白质的缓冲溶液补给品，平衡溶液可以在缓冲溶液中具有7.5V/V的二甲基亚砜(DMSO)、7.5％V/V的乙二醇(EG)以及20％的胎牛血清(FCS)。玻璃化溶液可以是在缓冲溶液中具有15％V/V的DMSO、15％V/V的EG、0.5M的蔗糖以及20％的胎牛血清(FCS)。相应地，对于该系列中的每种溶液，在406中，例如如前所述，通过在吸墨纸、滤纸、吸收棉绒或棉花等之上与远端接触而使毛细空间内的液体排出，并且在408中，通过将远端浸入在下一种溶液中而将该系列中的下一种溶液装载到毛细空间中。在406中排出最后一种溶液之后，毛细管可以在410中插入到例如液氮、液氮浆或液体空气中以用于低温保存。

因此，本发明的实施例公开了构造为利用一系列溶液处理生物样品的装置(例如装置100)。所述系列可以包括任何适用数目(n)的溶液，例如n＝1、n＝2、n＝3、n＝4、n＝5、n＝6、n＝7、n＝8、n＝9、n＝10或者包括适用于该情况的任何其它适用数目的溶液。

另外，应该理解的是，图4的流程图仅作为示例的方式而被公开，并且可以存在其它实施例。例如，具有任何适用的罩盖(参见例如图2A至2K)的图1的装置100构造为用于使生物样品为低温保存做好准备并且由于该装置100可以插入液氮中而因此构造为用于低温保存本身。然而，图4中所呈现方法的可替代方法可以跳过410(“插入液氮”)。可以从毛细空间提取样品，将样品转移到用于插入液氮中的另一个容器或工具，而非在样品位于装置内时低温保存该样品。

在理解目前为止所描述的实施例之后，可以理解的是，可以通过对毛细作用附加的方式或可替代的方式将溶液装载到毛细空间中。例如，根据一些实施例，可以将泵连接到毛细管的近端，从而将溶液泵送到毛细管中而不是单独通过毛细作用而使溶液流入。此外，理解到溶液(或者通常为液体)通过泵所引起的力而流入毛细管，能想到的是，在一些实施例中，毛细管不再是毛细的。即，本发明的实施例包括“吸管”或“导管”，其中“毛细管”是吸管的私用情况。类似地，“吸管空间”是吸管内部的空间，而“毛细空间”是吸管空间的表现出毛细现象的私用情况。

应注意的是，之前参照包括毛细管的装置所呈现的所有实施例也适用于包括吸管的装置。这也包括罩盖的实施例。相应地，参照图1、图2A至图2K以及图3A至图3C所呈现的实施例也应该适用于非毛细吸管，并加以必要的变通。

当泵联接到吸管以将液体吸入吸管空间时，根据替代图4的方法的实施例，可不需要在将下一种液体装载到吸管空间之前将液体从吸管空间排出。在第二液体(例如平衡溶液)的密度高于第一液体(例如，持有介质)的密度、第三液体(例如玻璃化溶液)相比于第二液体具有更高的密度并以此类推(系列相比于其先前的密度具有更高的密度，换句话说，它更重)的那些情况下，可以理解的是，至少在没有诸如通过混合的额外能源投入的情况下，在吸管空间中在先前溶液层上方具有一层溶液不会导致其混合。图5示出了其中具有四个不同层的吸管500，这四个层标记为502、504、506和508。吸管远端标记为510并且近端标记为512。在远端中存在穿孔构件514，其可以是例如参照图2A至图2K所描述的罩盖之中任何一个的穿孔构件。如果适用于该情况，吸管500可以是或不是毛细的。可以理解的是，层502是最重的溶液(就密度而言)，504更轻，506甚至更加轻，并且最轻的是508。516表示泵，所述泵在吸管的近端512处联接至吸管。518表示生物样品并且520表示吸管空间。

图6是示出根据本发明的实施例的为了制备用于玻璃化的样品而采取的程序的流程图。基本上，尽管在不同溶液的装载中没有执行排干，但图6类似于图4。在602中，将样品(例如102或518)装载到空吸管(例如108或500)的吸管空间(例如，114或520)。如前所述，装载可以例如通过毛细管中的毛细作用或通过使用泵(例如112或516)来完成。应该注意的是，关于装载之后即刻，样品驻留在吸管空间内，并浸没在与装载前所浸没的液体相似的液体中。因此，例如，若样品在装载之前已经储存在持有介质中，那么在装载之后即刻会是样品在吸管内部浸没于持有介质中。

在604中，罩盖联接到毛细管的远端。联接通过任何适用于该情况的方式来进行，例如通过施加压力(参见图3A至3C)、通过螺接等。罩盖的穿孔构件将防止样品无意地经由毛细管的远端脱离毛细空间。

之前已经注意到那些精通玻璃化技术的人将会认识到，为了制备用于玻璃化的生物样品，样品需要浸没在一系列溶液中，而由于低温保护剂的浓度增加，所以溶液的密度随着制备的进行而增加。相应地，对于该系列中的每种溶液，在608中，通过将远端浸入其中并操作泵而将该系列中的下一种溶液装载到毛细空间中。最后，所有的层都在610中排出，并且可以在612中将吸管插入液氮中以用于低温保存。

图7A、图7B和图7C示出了根据本发明的实施例的装载图5的吸管的各阶段。当图1的毛细管具有连接到其上的泵时，可能发生与图1的毛细管相同的阶段。在图7A中，第一层508装载有生物样品518。在所描述的制备用于玻璃化的样品的示例中，第一层可以是由持有介质构成。然后，在图7B中，还加载了第二层506。示例中的层506由密度高于上述持有介质密度的持有介质构成，且因此层508从而被“向上推”，并且层506出现在下方。建议避免摇动吸管，否则这些层可能会混合。另外，生物样品逐渐吸收持有溶液，该持有溶液替代之前已存在的持有介质。这进而使得样品变得更重并且因此它从层508下沉到层506。此后，因为在该系列中存在其它未装载的溶液，所以该过程重复其自身并且如图7C所示地装载层504。层504可以是由平衡溶液构成。该平衡溶液比层506的持有溶液重，因此层506和508被向上推，层504驻留于层506和508下方，并且吸收平衡溶液的样品518进一步下沉到层504。最后，在本示例中装载第四溶液(例如玻璃化溶液)以产生图5，其中层502包括第四、最重的溶液以及所再次下沉的生物样品518。第四溶液可以是另一种平衡溶液，比层504的平衡溶液更重。

应该注意的是，上面的描述并不打算教导如何执行玻璃化。相反，其旨在教导如何使用吸管来制备用于玻璃化的样品。因此，所描述的程序不意在成为精确的玻璃化程序。在阅读本文所述的程序后，熟悉玻璃化技术的人员将能够将该程序应用于本身已知的玻璃化过程。

在理解目前为止呈现的实施例之后，提出了另外的实施例，其不需要毛细现象或使用泵。连通器的理念自古以来即是公知理念。当两端敞开的管道浸入盛有液体的容器中时，液体会将管子填充至与容器中的液体液位相似的液位。

图8示出根据本发明的实施例将四种溶液装载到吸管中。在图(错误，未发现引用源)中，将吸管800浸入容器802内的第一溶液中以装载生物样品804。吸管800在其远端联接至穿孔构件。容器802中的溶液的液位标记为806。如果该程序例如是制备用于玻璃化的生物样品，则第一溶液可以是生物样品所驻留于其中的持有介质。为了将样品装载到吸管中，可以将泵联接到吸管的近端，并且可以在装载后分离。虽然例如图1中可以看到(参见112)但在图8中未示出的泵可以例如是电动泵或诸如洗耳球之类的手动泵。

从图中可以看出，在吸管800内部获得有第一溶液的层808，其液位与容器中溶液的液位相似。此后，吸管可以转移到第二容器810，该第二容器810持有比第一溶液重的第二溶液，该第二溶液在容器中标记为812的液位高于容器802中的第一溶液的液位806。作为响应，较轻的层808将被向上推动以使液位与液体液位812相等，其中第二溶液的新层814将驻留于层808下方。另外，如图中所示，如之前参照图7A、图7B和图7C所解释的，生物样品814将从层808下沉到层814。因此，生物样品814在吸管空间中正被第二溶液所处理。

应注意的是，将吸管800从容器802转移至容器810时，第一溶液的层808应该保持于内部。如果吸管足够窄以维持毛细现象，则该层将保持于内部。然而，如果吸管不维持毛细现象，则可能需要在转移过程中密封吸管的近端，从而防止层808的损失。这与在一个容器和另一个容器之间的任何吸管转移有关。

进一步地，将吸管800转移到容器816，该容器816持有甚至更重的第三溶液，该第三溶液的液位818高于第二溶液在容器810中的液位812。再次地，两个先前的层(808和814)被第三溶液向上推动以使吸管内部的液位与第三溶液的液位818相等。因此，第三溶液的层820创建在层808和814下方，而样品804下沉至第三溶液的层。因此，生物样品814在吸管空间中正被第三溶液所处理。

最后，在本示例中，将吸管800转移到容器822，该容器822持有第四种最重的溶液，该第四溶液在容器中标记为824的液位高于第三溶液在容器816中的液位818。作为响应，层808、814和820被第四溶液向上推动以使吸管800内部的液位与第四溶液的液位818相等。因此，第四溶液的层826创建在层808、814和820下方，而样品804进一步下沉至第四溶液的层。因此，生物样品814在吸管空间中正被第四溶液所处理。

在这个阶段，读者应该理解的是，本发明不限于四种溶液的四层。层和溶液的数量可以根据需要而变化，它可以是一层一种溶液、两层两种溶液、三层三种溶液、四层四种溶液、五层五种溶液、六层六种溶液、七层七种溶液、八层八种溶液、九层九种溶液、十层十种溶液，或适用于情况的任何其它数目的层和溶液。通常，该装置配置为利用浓度逐渐增加的一系列溶液来处理生物样品。

另外，在该图中，容器802、810、816和822是相似的。然而，这也不是强制性的。由于连通器的理念，无论容器的形状和体积如何，吸管中的液体液位将与其所浸入的容器中的液体液位相同。

此外，虽然在示例中溶液在容器中的液位随着过程进行而变得越高，但应该理解的是，这也不是强制性的。相反，只要吸管浸入溶液越来越深，就可以保持液位不变或甚至使液位降低。因此，通常而言，可以应用允许根据连通器理念而使溶液在吸管空间中的液位升高的任何操作，包括组合(例如，如适用于情况，则对第二层增加体积，对第三层浸入更深等)。

在理解如何通过本发明的一些实施例来应用连通器理念之后，提出了其它实施例：在这些实施例中，可以以一层溶液填充吸管空间，然后闭合吸管空间的近端。接下来，如果将吸管转移到另一种溶液中(或者如果容器中的溶液变成另一种溶液)，则应该理解的是，该层中或者至少该层底部靠近远端的溶液的成分将由于扩散而逐渐改变。

尽管到目前为止提出的实施例涉及逐渐增加的密度，但应该认识到，情况并非总是如此，并且有时密度可以逐渐减小而不是增加。一个这种示例是在使玻璃化的生物样品加温或解冻。在这种示例中，需要逐渐降低样品周围和内部的低温保护剂的浓度。在一些实施方案中，使用高浓度的蔗糖(例如1M，1摩尔蔗糖溶液)来稀释吸管空间中的玻璃化溶液，由此稀释玻璃化溶液。此后，溶液进一步通过诸如0.5M等的较低浓度蔗糖溶液来稀释。

理解的是，有时密度可以减小而不是增加，通常在本文中所说并且进一步回顾本发明的不同实施例：涉及溶液变化(参见例如图4)的那些实施例、涉及溶液扩散的那些实施例、以及涉及溶液层的那些(参见例如图5、图6、图7A至图7C和图8)，通常解释为装载到吸管空间中的生物样品逐渐暴露于具有逐渐变化密度的溶液。穿孔元件防止样品损失，同时其仍允许溶液穿过该穿孔元件流入和流出(溶液是液体类型的)。

尽管上面已经描述了本发明的各种实施例，但是这些仅仅是为了解释本发明的目的而给出的，并且本发明的范围不应被认为仅限于这些实施例。

Claims (16)

1.一种构造为对至少一种生物样品执行低温程序的装置，所述装置包括：

包括吸管空间的吸管，所述吸管构造为从所述吸管空间的远端朝所述吸管空间的近端吸取液体；以及

联接至所述吸管的远端的罩盖，所述罩盖包括

穿孔构件，其包括至少一个孔口，所述至少一个孔口的直径小于所述至少一种生物样品的直径，其中所述穿孔元件构造为允许液体流入制备空间并允许液体从所述制备空间流出；以及

持有空间，其构造为与所述吸管空间一起形成所述制备空间，

其中所述至少一种生物样品能够经受所述低温程序。

2.根据权利要求1所述的装置，其中，所述至少一个孔口具有圆形横截面。

3.根据权利要求1所述的装置，其中，所述至少一个孔口具有方形横截面。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的装置，还包括：

联接至所述吸管的近端的泵。

5.根据权利要求1至5中任一项所述的装置，其中，所述吸管是毛细管并且所述吸管空间是毛细空间。

6.一种能够联接至吸管的罩盖，所述吸管构造成用于对至少一种生物样品执行低温程序，所述罩盖包括：

持有空间，其构造为在与所述吸管联接时与吸管空间一起形成制备空间；

穿孔构件，其包括至少一个孔口，所述至少一个孔口的直径小于所述至少一种生物样品的直径，其中所述穿孔元件构造为允许用于所述低温程序的液体流入所述持有空间并允许液体从所述持有空间流出。

7.根据权利要求6所述的罩盖，其中，所述至少一个孔口具有圆形横截面。

8.根据权利要求6所述的罩盖，其中，所述至少一个孔口具有方形横截面。

9.一种用于对吸管中的至少一种生物样品执行低温程序的方法，其包括：

将所述至少一种生物样品装载到吸管中；

将所述吸管中的所述至少一种样品暴露至密度逐渐变化的溶液，同时防止所述至少一种样品流出所述吸管。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，装载所述至少一种生物样品是通过毛细作用来执行的。

11.根据权利要求9所述的方法，其中，装载所述至少一种生物样品是通过泵入所述至少一种样品来执行的。

12.根据权利要求9所述的方法，其中，装载所述至少一种生物样品是通过利用连通器理念来执行的。

13.根据权利要求9至12中任一项所述的方法，其中，所述暴露是通过更换所述吸管中的溶液来执行的。

14.根据权利要求9至13中任一项所述的方法，其中，所述暴露是通过毛细作用来执行的。

15.根据权利要求9至12中任一项所述的方法，其中，所述暴露是通过将逐渐变化溶液的层装载至所述吸管中来执行的。

16.根据权利要求15所述的方法，其中，将层进行装载是根据连通器理念来执行的。