CN219507891U - 细菌抗菌药物敏感性检测的微孔板 - Google Patents

Abstract

本实用新型涉及微生物检测领域，具体涉及细菌抗菌药物敏感性检测的微孔板。本实用新型涉及细菌抗菌药物敏感性检测的微孔板，所述微孔板包括底片和密封膜，所述底片上开设相连通的加样孔、加样通道、储液池、分流通道、反应孔以及废液池。所述底片采用透明亲水材质，并且对底片上的反应孔进行亲水处理，结合0.6％的低熔点琼脂糖，在即能降低待检测细菌具有运动性影响的同时，又能促进抗菌药物原位均匀快速扩散，使检测结果准确可靠。同时本实用新型的微孔板结构简单、造价低廉，在反应孔提前包被抗菌药物，进一步简化了操作步骤；且所述微孔板能与现有多种设备配套使用，具有广泛的应用前景。

Description

细菌抗菌药物敏感性检测的微孔板

技术领域

本实用新型涉及微生物检测领域，具体涉及细菌抗菌药物敏感性检测的微孔板。

背景技术

微生物个体形体微小，一般常见球菌的直径约为0.5～1μm，中等大小的杆菌长2～5μm、宽0.3～1μm，肉眼无法看见，在固体琼脂培养基中分裂增殖时，许多细胞堆积在一起形成微小菌斑或团簇，在抗生素抑菌/杀菌作用下，形成直径不一的增殖体，通过显微成像装置进行观察，可较传统比浊法显著缩短药敏试验周期。近年来，多孔微孔板常用来代替96孔板用于微量反应的载体，因其密封性好、生物安全性高，通过显微镜对微培养孔内微菌落形态、大小持续观察，可对抗菌药物敏感性进行快速、准确判读。

用于单细胞识别的细菌耐药性快速检测微流控芯片、制备及应用(专利号：CN114196520 A)所涉及的微流控芯片包含注药区、注菌区和反应区，配合显微镜等成像装置进行检测。该微流控芯片中药物可冻干预置的方法提前植入反应区，再使用微量移液器将其注入微流控芯片中，并进入反应区与药物接触并检测细菌数量的变化。

一种快速检测微生物耐药性的方法及专用微流控芯片(专利号：CN 104593253A)，该专利通过将低熔点琼脂糖和微生物的混合液滴加到透明聚二甲基硅氧烷板上，凝固后形成固定细菌的琼脂糖层，抗生素以溶液的形式在侧端添加依靠扩散形成浓度梯度，通过显微成像装置观察菌落大小和形态变化判读药敏结果。

现有显微镜观察药敏实验(Microscopic observation drug susceptibilityassay,MODS)是对液体培养基中细菌形态和数量进行观察分析。然而，运动性细菌可以依靠周身鞭毛实现滑行或改变浮力来四处游动，对显微镜下观察抗菌药物敏感性时造成干扰。因此，1.使用微流控芯片和显微成像装置对反应孔细菌进行计数时需限制或固定细菌的运动，其中虽然使用多聚赖氨酸涂层虽然具有不错的吸附初代细菌的作用，但对增值后子代菌和运动型较强的细菌(如铜绿假单胞菌)吸附效果一般；2.在使用微流控芯片时采用琼脂糖虽然能满足细菌固定的需求，但因抗生素的扩散问题需另设抗菌药物的添加或预置孔，造成板卡结构复杂成本较高和多次加样增加操作的问题。

实用新型内容

有鉴于此，本实用新型要解决的技术问题在于提供细菌抗菌药物敏感性检测的微孔板。

本实用新型提供了细菌抗菌药物敏感性检测的微孔板，其包括底片和与所述底片密封配合的密封膜；

所述底片上设置有至少一个检测单元，所述检测单元包括相互连通的加样孔、加样通道、储液池、分流通道、反应孔以及废液池；

所述加样孔位于底片中心；

所述加样通道与所述加样孔相连通，向远离所述加样孔的方向延伸并与储液池相连通；

所述储液池为以加样孔为圆心的同心圆环结构；

所述分流通道与储液池相连通，向远离所述储液池方向延伸，贯穿反应孔并与废液池相连通；

所述反应孔为经亲水处理的包被有抗菌药物的纳米孔；

所述废液池为位于储液池外围的同心圆环结构；

所述密封膜对所述底片上除所述加样孔外的结构进行密封，所述密封膜上开设有排气孔，所述排气孔位于废液池上方，沿废液池圆周均匀分布。

进一步的，所述的微孔板中，

所述加样孔数量为一个，所述反应孔表面覆有防水透气膜，仅进样时打开，减少了污染，提高了生物安全性，所述加样孔形状可以是圆形、椭圆形、方形或者其他任意形状，本实用新型实例中，优选圆形，可与生物实验中常规使用的标准Tip头的尺寸相匹配，便于操作。

所述加样通道的数量为多条，其中，每条加样通道长度相同，每两条加样通道与加样孔圆心之间连线的夹角为40°～120°，优选120°，夹角120°时，所述加样通道的数量为3条。当然，所述每两条加样通道与加样孔圆心之间连线的夹角也可以为其他，数量包括但不限于3条、6条、12条、24条、48条或96条等。待测样本由移液枪经加样孔1注入，流经加样通道2后进入储液池3。

所述分流通道的数量为多条，其中，每条分流通道长度相同，每两条分流通道与加样孔圆心之间连线的夹角为3°～120°，优选15°，夹角为15°时，所述分流通道的数量为24条。当然，所述每两条分流通道与加样孔圆心之间连线的夹角也可以为其他，数量包括但不限于6条、12条、24条、48条或96条等。

进一步的，所述分流通道以反应孔为中心向储液池一端延伸长度与向废液池一端延伸的长度的比值为3：1，宽度的比值为2：1；对反应孔5前后分流通道4的长度和宽度进行限定，有利于前端减少进样缓冲，后端排除多余气体，保证检测结果的准确性。

所述反应孔的数量为多个，所述反应孔的数量与所述分流通道一致，所述反应孔的容积为10～20μL；且所述反应孔预包埋抗菌药物，提高检测通量。

所述储液池的数量为一个，所述储液池的容积为50μL～200μL，所述储液池的容积与微孔板其他部件配套，能够使待测菌液具有足够残留在反应孔与药物反应，且不过多影响检测。

本实用新型所述的微孔板中，所述反应孔经亲水处理的试剂选自Hydro300溶液、聚乙二醇溶液或亲水性二氧化硅溶液中的至少一种。

进一步的，所述亲水处理的试剂为Hydro 300溶液，其包括水和Hydro 300，其中Hydro 300的体积分数为0.1％。

与进行亲水处理的反应孔的结果相比，没有亲水处理的反应孔中出现近抗生素包被位点生长慢或不生长，远位置生长较快等生长不均现象，不利于实验结果的准确呈现，亲水试剂处理后，抗菌药物扩散均匀，作用结果均一，实验结果准确可靠，且利用表面亲水处理剂为Hydro 300溶液处理反应孔效果优于其他亲水处理剂处理效果。

本实用新型微孔板的底片材质为无色透明的聚碳酸酯，厚度为2～3mm，底片上结构的深度受到底片厚度的影响，所述底片上各结构的深度小于所述厚度，所述底片上的结构包括加样孔、加样通道、储液池、分流通道、反应孔以及废液池。合适的厚度可以保证底片不容易变形且具有足够的载量，并且能保持反应条件的均匀一致，进一步提高检测的准确度。

所述密封膜材质包括无色透明的聚乙烯膜，厚度为小于1mm，便于实验结果的观察。

本实用新型上述整体对保证药敏检测结果的准确性至关重要。

本实用新型提供了细菌抗菌药物敏感性的检测方法，其为待检测菌液与低熔点琼脂培养基混合后注入如本实用新型所述的微孔板进行培养后观察，分析待检测菌液药物敏感性。

进一步的，

所述低熔点琼脂培养基包括但不限于低熔点MHA琼脂培养基或低熔点1640琼脂培养基，本实用新型以低熔点MHA琼脂培养基用于所述药敏试验；所述MHA琼脂培养基包括水和3g/L牛肉浸粉，17.5g/L酸水解酪蛋白，3g/L冷水可溶性蛋白和6g/L低熔点琼脂糖。

所述检测方法采用低熔点琼脂糖的浓度为0.6％，可使细菌的运动强度保持在0.3％～1.0％之间，消除细菌运动干扰，且抗菌药物在0.6％低熔点琼脂培养基冷却凝固过程中可均匀溶解扩散，这些均对实验结果的准确性起到至关重要的作用，并且培养基采用冷水可溶性蛋白，使培养基在复融过程中无大分子蛋白析出干扰显微镜镜检。

所述观察为通过显微镜观察，观察方式包括定焦观察和/或变焦观察，进一步的，拍照方式为定焦拍照，降低检测操作难度，缩短检测时长，使抗菌药物敏感性检测工作在0.5～3h内完成。

本实用新型涉及细菌抗菌药物敏感性检测的微孔板，所述微孔板包括底片和密封膜，所述底片上开设相连通的加样孔、加样通道、储液池、分流通道、反应孔以及废液池。所述底片采用透明亲水材质，并且对底片上的反应孔进行亲水处理，结合0.6％的低熔点琼脂糖，在即能降低待检测细菌具有运动性影响的同时，又能促进抗菌药物原位均匀快速扩散，使检测结果准确可靠。同时本实用新型的微孔板结构简单、造价低廉，在反应孔提前包被抗菌药物，进一步简化了操作步骤；且所述微孔板能与现有多种设备配套使用，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为本实用新型的微孔板平面图，其上覆盖有密封膜，其中，1为加样孔；2为加样通道；3为储液池；4为分液通道；5为反应孔；6为废液池；

图2为微孔板叠加图，其中结构7为密封膜；8为密封膜加样孔；9为排气孔；

图3为大肠杆菌与阿米卡星作用显微镜观察实例图片。

具体实施方式

本实用新型提供了细菌抗菌药物敏感性检测的微孔板，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本实用新型。本实用新型的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本实用新型内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本实用新型技术。

需要说明的是，当元件被称为“固定于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上或者也可以存在居中的元件。当一个元件被认为是“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或者可能同时存在居中元件。本文所使用的术语“垂直的”、“水平的”、“左”、“右”以及类似的表述只是为了说明的目的。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本实用新型的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本实用新型的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本实用新型。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本实用新型采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本实用新型：

实施例1细菌抗菌药物敏感性快速检测微孔板

本实用新型中涉及了一种用于细菌抗菌药物敏感性快速检测微孔板，其包括底片和密封膜。

所述底片材质为无色透明光滑的聚碳酸酯，一方面，聚碳酸酯材料强度较好，能够起到良好的支撑作用；另一方面，聚碳酸酯材料的透光性好，便于观测，并且聚碳酸酯材料无生物毒性，具有良好的生物相容性和生物可降解的特性。当然，透明底片还可以为其它透光且亲水材质。

其中，所述底片上开设有至少一个检测单元，所述检测单元包括相连通的加样孔1、加样通道2、储液池3、分流通道4、反应孔5以及废液池6。

所述加样孔1位于所述底片中心，所述反应孔表面覆有防水透气膜，仅进样时打开；所述加样孔1的形状可以是圆形、椭圆形、方形或者其他任意形状，在本实用新型实例中，优选圆形，且加样孔1尺寸恰好与生物实验中常规使用的标准Tip头的尺寸相匹配，操作人员可以使用标准Tip头直接对准加样孔1进样，使得微孔板容易制造且方便操作人员使用。

所述加样通道2向远离所述加样孔1的方向延伸并与储液池相连通；所述加样通道的数量为多条，每条加样通道长度相同，每两条加样通道与加样孔圆心之间连线的夹角为40°～120°，优选120°，夹角120°时，所述加样通道的数量为3条。当然，所述每两条加样通道与加样孔圆心之间连线的夹角也可以为其他，数量包括但不限于3条、6条、12条、24条、48条或96条等。待测样本由移液枪经加样孔1注入，流经加样通道2后进入储液池3。

所述储液池3是以加样孔为圆心的同心圆环结构，其与加样区的加样通道2连通，所述储液池的容积为50μL～200μL。所述储液池3的容积与微孔板其他部件配套，能够使待测菌液具有足够残留在反应孔与药物反应，且不过多影响检测。

所述分流通道4向远离所述储液池3方向延伸并与废液池6连通；所述分流通道的数量为多条，其中，每条分流通道长度相同，每两条分流通道与加样孔圆心之间连线的夹角为3°～120°，优选15°，夹角为15°时，所述分流通道的数量为24条。当然，所述每两条分流通道与加样孔圆心之间连线的夹角也可以为其他，数量包括但不限于6条、12条、24条、48条或96条等。所述分流通道4的长度介于20mm～80mm之间；进一步的，所述分流通道4贯穿所述反应孔5，其以反应孔5为中心向储液池3一端延伸长度与向废液池6一端延伸的长度的比值为3：1，宽度的比值为2：1。进入储液池3的待测样本通过分流通道4进入反应孔5与待测药物进行反应，对反应孔5前后分流通道4的长度和宽度进行限定，有利于检测结果的准确性；一方面，本实用新型保持反应孔5前端分流通道较长，用于减弱待测菌液注入后的缓冲力，从而降低对药物浓度的影响，提高检测的准确度；另一方面，本实用新型反应孔5后端分流通道长度较短且宽度较窄，这样可使反应孔截流足够的待测样本，而且可排出气体减少对实验结果的干扰。

所述反应孔5包被有待测药物，为待测样本与抗菌药物作用的微米级反应孔，所述反应孔的容积为10～20μL；所述反应孔5的数量与分流通道4相同，所述反应孔5的数量包括但不限于6个、12个、24个、48个或96个等，优选数量为24个；所述反应孔5包被抗菌药物之前由亲水性试剂处理，干燥后可预包埋待一组或多组稀释梯度的抗菌药物；同时本实用新型底片材质为聚碳酸酯，其本身亲水性强，在包被抗菌药物之前利用亲水性试剂对反应孔5进一步处理，可进一步促进抗菌药物扩散，减少包被药物体积、缩短干燥时间和保护效价；本实用新型的反应孔5若不用亲水试剂处理，会导致反应孔中近抗生素包被位点生长慢或不生长，远位置生长较快等生长不均现象。因为细菌抗菌药物绝大多数为水溶性药物，为缩短干燥时间减少药效损失，所以使尽可能小体积的药物体积进行干燥。同时需要抗菌药物在孔底部平铺进行干燥以促进药物在孔内自下而上扩散均匀，因此选择使用亲水试剂可以达到此目的。所述的亲水试剂包括但不限于Hydro 300、聚乙二醇或亲水性二氧化硅中的至少一种，其中以Hydro 300处理效果最好。

所述废液池6用于收集多余废液；根据需求废液池6可以设计成不同形状。用户操作不同或者加样器不同都会导致样品吸液量有差别，本实用新型的实例中，所述废液池6为位于储液池3外围的同心圆环结构。当样品吸液量过少时，反应孔5内无液体样品或反应样品量不足，导致检测结果不准确；反之，当样品吸液量过多时，会导致液体溢出排气孔9等问题；而此时废液池6可以起到缓冲的作用。

进一步的，所述微孔板还包括密封膜7，如图2所示。所述密封膜7优选为聚乙烯膜密封膜。聚乙烯膜易于制作，且不会污染微生物悬浮液，避免对测试样品造成污染。当然，密封膜7还可以为其他易于制作且不会污染微生物悬浮液的聚合物顶层。其次，聚二甲基硅氧烷材质密封膜的厚度优选小于1mm，聚二甲基硅氧烷材质密封膜厚度较小，便于观测，能够避免厚度对检测结果的影响。

所述密封膜用于对所述底片上除所述加样孔外的结构进行密封，所述密封膜上开设有排气孔和与加样孔对应的密封膜孔8；所述排气孔9以密封膜孔8为圆心呈圆周排列，所述排气孔位于所述废液池上方。密封膜孔8形状可以是圆形、椭圆形、方形或者其他任意形状，本实用新型的实施例中，优选圆形。所述排气孔9的形状可以是圆形、椭圆形、方形或者其他任意形状，本实用新型的实施例中，优选圆形；所述排气孔的个数为3～18，优选8个，可根据微孔板其他构件的数量进行调整。

本实用新型微孔板的底片的厚度为2～3mm，底片上结构的深度受到底片厚度的影响，所述底片上各结构的深度小于所述厚度，所述底片上的结构包括加样孔1、加样通道2、储液池3、分流通道4、反应孔5以及废液池6。合适的厚度可以保证底片不容易变形且具有足够的载量，并且能保持反应条件的均匀一致，进一步提高检测的准确度。

本实用新型上述整体能够保证药敏检测结果的准确性。

实施例2微孔板药敏实验

具体步骤为：

第一步：使用0.1％的表面亲水处理剂Hydro 300均匀处理微孔板反应孔(示例为24孔微孔板)，后干燥处理；

第二步：称量一定质量的革兰阴性菌抗生素，包括阿米卡星(AMK)、氨苄西林(AMP)、头孢西丁(FOX)、庆大霉素(GEN)抗生素粉末；革兰阳性菌抗生素，包括氨苄西林(AMP)、头孢洛林(CPT)、达托霉素(DAP)、头孢西丁(FOX)。分别溶解后使用抗生素稀释液进行2倍梯度倍比稀释，10μL体积微孔板反应孔中分别加入稀释后的革兰阴性菌抗生素2μL，使最终检测浓度梯度依次为AMK(4/2/1/0.5/0.25/0.12μg/mL)、AMP(16/8/4/2/1/0.5μg/mL)、FOX(8/4/2/1/0.5μg/mL)、GEN(2/1/0.5/0.25/0.12/0.06μg/mL)和对照孔；和革兰阳性菌抗生素2μL，使最终检测浓度梯度依次为AMP(16/8/4/2/1/0.5μg/mL)、CPT(4/2/1/0.5/0.25/0.12μg/mL)、DAP(4/2/1/0.5/0.25/0.12μg/mL)、FOX(8/4/2/1/0.5μg/mL)和对照孔。

真空冷冻干燥后覆密封膜保存。

第三步：制备0.6％低熔点MH琼脂培养基(不补充外源钙、镁离子)，无菌过滤器除菌、除杂后分装每试剂瓶3mL，室温冷却后低温保存。

第四步：从35±2℃培养18～24h的血琼脂平板中挑选标准菌株大肠埃希菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC29213单菌落，使用电子比浊仪制备0.5麦氏浊度的菌悬液，用复融后冷却至37℃～40℃的0.6％低熔点MH琼脂培养基稀释200倍。

第五步：移液枪吸取菌混液1mL由革兰阴性菌抗生素微孔板和革兰阳性菌抗生素微孔板加样孔注入，分流完成后室温静置冷却5min，放入35±2℃温箱培养。

第六步：将第四步中制备的药敏微孔板分别在孵育0min、30min、60min、90min、120min、150min、180min用普通光学显微镜或倒置显微镜观察菌落大小。

第七步：根据显微镜下孵育孔中微菌落特征，确定大肠埃希菌ATCC25922和金黄色葡萄球菌ATCC29213对应抗生素MIC结果，其中大肠埃希菌ATCC25922判读周期时间为120min，金黄色葡萄球菌ATCC29213判读周期为180min。以微量肉汤实验法MIC结果为参考方法，结果对比符合率为100％(MIC结果可接受与参考方法相差±1个2倍稀释梯度)，具体操作步骤和判读规则参考CLSI M100。MIC结果和质控范围见表1，显微成像结果见图3，药物浓度大于等于0.5μg/ml，浓度过高大肠杆菌不生长，低于等于0.25μg/ml菌能够生长，药敏实验效果明显；同时，该板卡的拍照方式区别于载玻片的聚焦拍照，该板卡使用倒置显微镜进行培养基中部定焦拍照，临近上下界面在图中会有虚影。

表1.MIC结果和质控范围

以上仅是本实用新型的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本实用新型原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本实用新型的保护范围。

Claims (8)

1.细菌抗菌药物敏感性检测的微孔板，其特征在于，

包括底片和与所述底片密封配合的密封膜；

所述底片上设置有至少一个检测单元，所述检测单元包括相互连通的加样孔、加样通道、储液池、分流通道、反应孔以及废液池；

所述加样孔位于底片中心；

所述加样通道与所述加样孔相连通，向远离所述加样孔的方向延伸并与储液池相连通；

所述储液池为以加样孔为圆心的同心圆环结构；

所述分流通道与储液池相连通，向远离所述储液池方向延伸，贯穿反应孔与废液池相连通；

所述反应孔为经亲水处理的包被有抗菌药物的纳米孔；

所述废液池为位于储液池外围的同心圆环结构；

所述密封膜对所述底片上除所述加样孔外的结构进行密封，所述密封膜上开设有排气孔，所述排气孔位于废液池上方，沿废液池圆周均匀分布。

2.根据权利要求1所述的微孔板，其特征在于，

所述加样孔数量为一个，形状为圆形；

所述加样通道的数量为多条，其中，每条加样通道长度相同，每两条加样通道与加样孔圆心之间连线的夹角为40°～120°。

3.根据权利要求1所述的微孔板，其特征在于，所述分流通道的数量为多条，其中，每条分流通道长度相同，每两条分流通道与加样孔圆心之间连线的夹角为3°～120°。

4.根据权利要求1或3所述的微孔板，其特征在于，所述分流通道以反应孔为中心向储液池一端延伸长度与向废液池一端延伸的长度的比值为3：1，宽度的比值为2：1。

5.根据权利要求1或3所述的微孔板，其特征在于，

所述反应孔的数量为多个，所述反应孔的数量与所述分流通道一致，所述反应孔的容积为10～20μL。

6.根据权利要求1所述的微孔板，其特征在于，

所述储液池的数量为一个，所述储液池的容积为50μL～200μL。

7.根据权利要求1所述的微孔板，其特征在于，所述底片材质为无色透明的聚碳酸酯，厚度为2～3mm。

8.根据权利要求1所述的微孔板，其特征在于，所述密封膜材质为无色透明的聚乙烯膜，厚度小于1mm。