CN212504829U - 一种基于微通道阻塞的核酸现场快速检验装置 - Google Patents

Abstract

本实用新型公开了一种基于微通道阻塞的核酸现场快速检验装置及其制备方法和检测方法，属于集成微流控芯片制造和核酸扩增的快速现场定性检测技术领域。本实用新型解决现有POCT方法需要在非实验条件下安全无污染、高效准确、简单快速等需求的问题。本实用新型基于核酸扩增技术与微流控芯片结合，建立依靠区分核酸沉淀阻塞微小通道特性的目视POCT方法，针对病毒核酸检测，可在感染初期得出准确结果，适用于变温扩增和恒温扩增情况，无需复杂的核酸检验设备，在相应核酸扩增试剂工作温度下封闭加热扩增后，连接至微流控芯片，并在室温条件下给予负压驱动，即可通过芯片的显色效果目视判断检测结果。

Description

一种基于微通道阻塞的核酸现场快速检验装置

技术领域

本实用新型涉及一种基于微通道阻塞的核酸现场快速检验装置，兼容现有多种非恒温或恒温扩增试剂，属于集成微流控芯片制造和扩增的核酸快速现场定性检测技术领域。

背景技术

目前核酸检测已被广泛应用于临床医学领域，它相较于检测病人抗体的胶体金显色检测方法，具备在感染初期检出的能力，应用在防疫检测中可以获得宝贵的时间提前量。由于待检测样本中的核酸含量十分有限，所以需要对微量核酸进行扩增。最早提出的核酸扩增方法是聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)，也是目前应用最广泛的核酸扩増方法。但是，PCR需要受过专业训练的工作人员操作精密的温度循环仪器来实现核酸的变性、退火和延伸，这限制了其便捷应用的可能性。随着一系列核酸等温扩增方法的产生，如环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，降低了仪器复杂性，反应过程简单高效，有利于检测设备小型化和现场布置。但是，对于核酸的现场快速检验(Point-of-Care Testing,POCT)依然有较大挑战，如产物脂糖电泳检测开盖容易造成污染，荧光定量检测需要专业仪器设备，焦磷酸镁浊度目视分辨不显著，使用专业仪器又限制其广泛应用。

如何在全球范围内推广易用的核酸POCT检测技术，特别是发展中地区和欠发达地区，面临如何克服现场污染、降低费用、去除复杂仪器、简化操作等一系列问题。微流控芯片提供了一种可能的解决方案，将多个反应步骤整合于几平方厘米的微流控芯片内，实现检测仪器的微型化，样品预处理的简单化，实验操作的高效化和精确化，检测成本的经济化。

实用新型内容

本实用新型为了解决上述问题，提供一种基于微通道阻塞的核酸现场快速检验装置。

本实用新型的技术方案：

一种基于微通道阻塞的核酸现场快速检验装置，该装置包括微流控芯片1和附属装置，所述的微流控芯片1由设有微米级通道的基片以及与基片键合的盖片组成，所述的微流控芯片1的一端与附属装置连通，微流控芯片1的另一端与负压源3相连；所述的微流控芯片1包括依次连通的进口段、混合段、至少一个阻塞通道6和显色腔8。

进一步地，附属装置包括软盖试管2、进样管、注射管和负压源3，所述的进口段为入口段4，入口段4设有液体进口，软盖试管2使用导管与入口段4的液体进口连通。

进一步地，混合段为弯曲通道5，弯曲通道5的两端分别与入口段4和阻塞通道6连通。

进一步地，阻塞通道6的两端分别设有防回流结构9，两个防回流结构9之间填装颗粒物质，阻塞通道6还设有装配口7，颗粒物质通过装配口7填装在阻塞通道6；所述的阻塞通道6内填装颗粒物质的直径为5-30μm。

进一步地，显色腔8设有出口10，出口10上安装有导管，导管的另一端与负压源3连通。

进一步地，阻塞通道6的通道断面总宽度不大于500μm，通道高度不小于30μm，且通道高度不大于150μm。

进一步地，阻塞通道6为多孔介质通道。

进一步地，软盖试管2为配备可穿刺密封盖的200μL检测试管。

进一步地，阻塞通道6的数量为1-3条。

上述装置检测时，首先将检测样本与等温扩增反应体系或非等温扩增反应体系加入到软盖试管2，旋涡混合后，加热扩增，扩增完成后冷却，取装有有色指示剂的进样管从软盖试管2的可穿刺密封盖处插入，剪掉进样管尾部；取装有酒精溶液的注射管从软盖试管 2的可穿刺密封盖处插入，然后将酒精溶液推入软盖试管2内，拔出注射管，震荡混合，将导管一端通过酒精溶液注射管拔出位置插入软盖试管2的底部，将导管另一端与入口段 4的液体进口连通，使用另一根导管将显色腔8通过出口10与负压源3连通。

上述基于微通道阻塞的核酸现场快速检验装置，还具有另一种结构，该装置包括微流控芯片1和附属装置，所述的微流控芯片1由设有微米级通道的基片以及与基片键合的盖片组成，所述的微流控芯片1的一端与附属装置连通，微流控芯片1的另一端与负压源3相连；所述的微流控芯片1包括依次连通的进口段、混合段、至少一个阻塞通道6和显色腔8。

进一步地，进口段包括2个进口11和支管12，每个所述进口11均与一个支管12相连通，所述的混合段为混合弯曲通道13，2个所述支管12连通到混合弯曲通道13，所述混合弯曲通道13与阻塞通道6连通。

进一步地，阻塞通道6包括防回流机构14、预装配进口15和阻塞起始结构16，每个所述阻塞通道6在与混合弯曲通道13连接端的起始端通道内部设置一个防回流机构14，每个所述阻塞通道6与显色腔8连接端的通道内部设置一个阻塞起始结构16，所述的防回流机构14与阻塞起始结构16之间的阻塞通道6上设置预装配进口15，每个所述阻塞通道6与显色腔8连通。

进一步地，显色腔8上设置气压出口18，所述气压出口18连接负压源3。

进一步地，附属装置包括供液管A和供液管B，供液管A和供液管B分别与2个进口11连通；所述的供液管A向微流控芯片1中依次注入检测样本和油性有色指示液；所述的供液管B向微流控芯片1中依次注入酒精溶液和油性有色指示液。

进一步地，阻塞通道6的数量为1-3条。

本实用新型具有以下有益效果：本申请基于核酸扩增的目视POCT技术，依托微流控芯片技术，建立依靠区分核酸沉淀阻塞微小通道的目视快速检测方法，本实用新型提供的装置针对病毒核酸检测，可在感染初期得出准确结果，适用于温度变化的PCR和恒温扩增情况，无需复杂的核酸检验设备，全过程只需使用配备可穿刺顶盖的检测试管盛放样本试剂，在相应核酸扩增试剂工作温度下封闭加热扩增后，连接至微流控芯片，并在室温条件下给予负压驱动，即可通过芯片的显色效果目视判断检测结果。并且在测试过程中该装置可以在闭盖状态下，完成目视判别的现场即时定性核酸检测。此外，本实用新型在检测过程中使用高浓度乙醇溶液直接灭活试剂，保证了扩增反应现场测试过程中更好的安全性，以及后续的无污染处理。

附图说明

图1为实施例1检测装置的示意图；

图2为实施例1微通道的结构示意图；

图3为实施例1的装置具有两条阻塞通道的微通道的结构示意图；

图4为实施例2检测装置的示意图；

图5为实施例2微通道的结构示意图；

1-微流控芯片，2-软盖试管，3-负压源，4-反应腔，5-弯曲通道，6-阻塞通道，7-装配口，8-显色腔，9-防回流结构，10-出口，11-进口，12-支管，13-混合弯曲通道，14-防回流机构，15-预装配进口，16-阻塞起始结构，18-气压出口。

具体实施方式

下述实施例中所使用的试验方法均以LAMP为例进行说明如无特殊说明均为常规方法。所用材料、试剂、方法和仪器，未经特殊说明，均为本领域常规材料、试剂、方法和仪器，本领域技术人员均可通过商业渠道获得。

实施例1：

基于微通道阻塞的核酸现场快速检验装置，该装置如图1所示，包括微流控芯片1和附属装置，微流控芯片1由设有微通道的基片以及与基片键合的盖片组成，微流控芯片 1的材质可以选择PDMS、PMMA、玻璃等制成。其中，附属装置包括软盖试管2、进样管、注射管、恒温水浴锅和医用注射器3；微通道包括反应腔4、弯曲通道5、阻塞通道6 和显色腔8，所述的反应腔4、弯曲通道5、阻塞通道6和显色腔8依次连通，反应腔4 设有液体进口，用于液体混合后单口注入的芯片，混合溶液中包括检测样本、扩增反应液和乙醇溶液，该进口连接PTFE导管插入装有待测液体的软盖试管2底部，反应腔4连接一段弯曲通道，用于加强液体混合。如图2所示，阻塞通道6为细长结构以方便阻塞，通道宽500μm，高50μm，从阻塞通道6的两端分别设有防回流结构9，两个防回流结构9 之间填装直径为5-20μm颗粒物质如二氧化硅、PMMA微球等，阻塞通道6还设有装配口 7，颗粒物质通过装配口7填装在阻塞通道6内，实现通道阻塞段的预装填，微球排列紧凑后封闭该装配口7，完成阻塞通道6的装配。此时阻塞通道6可允许水和阴性样本的反应后溶液通过，而阳性样本的反应后溶液因乙醇沉淀量大则难以通过。显色腔8设有出口 10，出口10上安装有导管，导管的另一端与医用注射器3连通。显色腔8内设计有等大小的微柱，可以支撑PDMS薄膜；显色腔8用于观察有色的指示液是否流过通道，显色腔8显色则检测样本为阴性，反之则为阳性。该装置的微流控通道能够将扩增反应后的核酸溶液与高浓度乙醇混合，利用阳性扩增的反应溶液中大量存在的核酸结构，与乙醇混合后生成核酸沉淀，沉淀附着在通道内预装配好的硬质颗粒上形成阻塞，使溶液通过速度显著下降甚至完全不通过，进而从显色指示液的通过情况来判断得到扩增反应是否发生，即待检测样本是否阳性。

阻塞通道6的数量为1-3条，如图3所示。

该装置的具体使用方法：

首先，在软盖试管2内加入配置好20μL的LAMP反应体系，然后加入检测样本，旋涡混合10s，放入65℃的恒温水浴锅中，保证试剂全部没入水面之下，水浴加热扩增20 分钟左右具体依试剂特性。特别地，不同扩增试剂仅在上述加热扩增过程有所区别。如，对于PCR，则采用可以循环加热的扩增仪替代恒温水浴。

待软盖试管2内检测样本加热扩增完成后，室温冷却1min。取装有20μL油性有色指示剂进样管，从软盖试管2的软盖处插入试管，剪掉尾部，连通大气，油性指示液除指示外，还起到了封闭反应体系的作用。取装有20μL酒精溶液注射管，从软盖试管2的软盖处插入试管，将液体缓缓推入，拔出注射管，震荡混合。将一根带有30mm长平口针头的供液管，通过酒精溶液注射管拔出位置缓缓插入，至软盖试管2底部，之后将供液管另一端与反应腔4的液体进口连接。在显色腔8的出口10处使用医用注射器3加8mL抽真空体积，以驱动芯片内液体流动。乙醇与扩增反应后溶液混合会形成核酸沉淀，且沉淀直径较大，可以显著加强阳性检测结果的阻塞。当混合乙醇的反应体系流经阻塞通道段时，阳性样本反应液在乙醇作用下产生许多核酸沉淀，堆积在通道内的颗粒上，使通道内流速显著下降，而阴性样本的有色油性流体会快速地通过阻塞段并进入显色腔。最后，依靠上游的油性有色指示液是否到达显色腔来判断检测结果，可以通过目视观察作出准确判断。上述方法中，可以控制阴性样本在5分钟内流过通道显色，而阳性样本不通过且不显色的时间长不低于10分钟，从而实现30分钟内目视判读核酸检测结果。

实施例2：

如图4和图5所示，该装置的进口段包括2个进口11和支管12，每个所述进口11 均与一个支管12相连通，所述的混合段为混合弯曲通道13，2个所述支管12连通到混合弯曲通道13，所述混合弯曲通道13与阻塞通道6连通。阻塞通道6包括防回流机构14、预装配进口15和阻塞起始结构16，每个所述阻塞通道6在与混合弯曲通道13连接端的起始端通道内部设置一个防回流机构14，每个所述阻塞通道6与显色腔8连接端的通道内部设置一个阻塞起始结构16，所述的防回流机构14与阻塞起始结构16之间的阻塞通道6上设置预装配进口15，每个所述阻塞通道6与显色腔8连通。

颗粒物质从预装配进口15注射进去后，被阻塞起始结构16阻挡，装配在预装配进口 15和阻塞起始结构16之间靠近阻塞起始结构16的位置，阻塞起始结构16的间隙尺寸大于颗粒直径，在阴性情况时，指示剂可以正常通过颗粒装配段使显色腔8处显示肉眼可见颜色。负压装置为注射器或机械微量注射泵等。

该装置的具体使用方法：

将待测样本与扩增反应溶液共20μL装入200μL检测试管内，旋涡混合30s，用100μL注射器连接供液管A的前端如图4，先吸取20μL油性有色指示液，再吸入10μL空气，最后吸入20μL反应体系溶液，油性指示液除指示外，还起到了封闭反应体系的作用，之后将供液管尾端与芯片连接，断开前端注射器。将芯片连同供液管一同没入恒温水浴加热，保证全部没入水面之下，开始扩增，于恒温水浴63℃中加热20min。完成后，室温冷却 1min，用100μL注射器连接供液管B的前端如图4，依次吸取20μL油性有色指示液+10μL 空气+30μL酒精，之后将供液管尾端与芯片连接，断开前端注射器。在显色腔出口处使用普通医用注射器加8mL体积负压，驱动芯片内液体流动。乙醇与扩增反应后溶液混合会形成核酸沉淀，且沉淀直径较大，可以显著加强阳性检测结果的阻塞。当混合乙醇的反应体系流经阻塞通道段时，阳性样本反应液在乙醇作用下产生许多核酸沉淀，堆积在通道内的颗粒上，使通道内流速显著下降，而阴性样本的有色油性流体会快速地通过阻塞段并进入显色腔。最后，依靠上游的油性有色指示液是否到达显色腔来判断检测结果，可以通过目视观察作出准确判断。以上设计结果，可以控制阴性样本在5分钟内流过通道显色，而阳性样本不通过且不显色的时间长不低于10分钟，从而实现30分钟内目视判读核酸检测结果。

本实用新型检测设备和操作简单，易于现场实施。扩增可以在供液管或检测试管中进行，芯片内流动的驱动力可以使用上述负压操作，也可以使用在供液管前端正压驱动流动。且在检测过程中使用高浓度乙醇溶液直接灭活试剂，进一步保证了扩增反应现场测试过程的安全性，方便后续的现场无害处理。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于微通道阻塞的核酸现场快速检验装置，其特征在于，该装置包括微流控芯片(1)和附属装置，所述的微流控芯片(1)由设有微米级通道的基片以及与基片键合的盖片组成，所述的微流控芯片(1)的一端与附属装置连通，微流控芯片(1)的另一端与负压源(3)相连；所述的微流控芯片(1)包括依次连通的进口段、混合段、至少一个阻塞通道(6)和显色腔(8)。

2.根据权利要求1所述的一种基于微通道阻塞的核酸现场快速检验装置，其特征在于，所述的附属装置包括软盖试管(2)、进样管、注射管和负压源(3)，所述的进口段为入口段(4)，入口段(4)设有液体进口，软盖试管(2)使用导管与入口段(4)的液体进口连通。

3.根据权利要求2所述的一种基于微通道阻塞的核酸现场快速检验装置，其特征在于，所述的混合段为弯曲通道(5)，弯曲通道(5)的两端分别与入口段(4)和阻塞通道(6)连通。

4.根据权利要求3所述的一种基于微通道阻塞的核酸现场快速检验装置，其特征在于，所述的阻塞通道(6)的两端分别设有防回流结构(9)，两个防回流结构(9)之间填装颗粒物质，阻塞通道(6)还设有装配口(7)，颗粒物质通过装配口(7)填装在阻塞通道(6)；所述的阻塞通道(6)内填装颗粒物质的直径为5-30μm。

5.根据权利要求4所述的一种基于微通道阻塞的核酸现场快速检验装置，其特征在于，所述的显色腔(8)设有出口(10)，出口(10)上安装有导管，导管的另一端与负压源(3)连通。

6.根据权利要求5所述的一种基于微通道阻塞的核酸现场快速检验装置，其特征在于，该装置在检测时，首先将检测样本与等温扩增反应体系或非等温扩增反应体系加入到软盖试管(2)，旋涡混合后，加热扩增，扩增完成后冷却，取装有有色指示剂的进样管从软盖试管(2)的可穿刺密封盖处插入，剪掉进样管尾部；取装有酒精溶液的注射管从软盖试管(2)的可穿刺密封盖处插入，然后将酒精溶液推入软盖试管(2)内，拔出注射管，震荡混合，将导管一端通过酒精溶液注射管拔出位置插入软盖试管(2)的底部，将导管另一端与入口段(4)的液体进口连通，使用另一根导管将显色腔(8)通过出口(10)与负压源(3)连通。

7.根据权利要求1所述的一种基于微通道阻塞的核酸现场快速检验装置，其特征在于，所述的进口段包括2个进口(11)和支管(12)，每个所述进口(11)均与一个支管(12)相连通，所述的混合段为混合弯曲通道(13)，2个所述支管(12)连通到混合弯曲通道(13)，所述混合弯曲通道(13)与阻塞通道(6)连通。

8.根据权利要求7所述的一种基于微通道阻塞的核酸现场快速检验装置，其特征在于，所述的阻塞通道(6)包括防回流机构(14)、预装配进口(15)和阻塞起始结构(16)，每个所述阻塞通道(6)在与混合弯曲通道(13)连接端的起始端通道内部设置一个防回流机构(14)，每个所述阻塞通道(6)与显色腔(8)连接端的通道内部设置一个阻塞起始结构(16)，所述的防回流机构(14)与阻塞起始结构(16)之间的阻塞通道(6)上设置预装配进口(15)，每个所述阻塞通道(6)与显色腔(8)连通。

9.根据权利要求8所述的一种基于微通道阻塞的核酸现场快速检验装置，其特征在于，所述显色腔(8)上设置气压出口(18)，所述气压出口(18)连接负压源(3)。

10.根据权利要求6所述的一种基于微通道阻塞的核酸现场快速检验装置，其特征在于，所述的附属装置包括供液管A和供液管B，供液管A和供液管B分别与2个进口(11)连通；所述的供液管A向微流控芯片(1)中依次注入检测样本和油性有色指示液；所述的供液管B向微流控芯片(1)中依次注入酒精溶液和油性有色指示液。

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