CN111394234A - 一种用于核酸扩增的数字化芯片及方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于核酸扩增的数字化芯片及方法，包括数字化检测阵列反应室、总进样口和总出样口；数字化阵列反应室包括若干个主渠道和若干个微单元，每个微单元通过一个主渠道连通总进样口和总出样口；所述微单元包括微单元反应室，微单元反应室的入口和出口分别连通主渠道，且微单元反应室入口与主渠道连接处之后的一段主渠道的宽度减小，使主渠道内流经此处的水相转流到微单元反应室内，而油相的流向不变。本发明利用油水界面张力控制液体在疏水性渠道内的流体行为，从而将PCR试剂封存在设计的微反应室内、并用油将其密封，可用于高效、便利的核酸扩增检测实验。以解决目前dPCR领域芯片技术复杂、制备工艺要求高、操作不便等问题。

Description

一种用于核酸扩增的数字化芯片及方法

技术领域

本发明属于医学检验分析领域，具体涉及一种可应用于核酸扩增的数字化微流控芯片及方法。

背景技术

核酸，包括DNA(deoxyribonucleic acid)和RNA(ribonucleic acid)，是在携带遗传信息的生物体中发现的最重要的生物大分子，已被广泛的用作检测各种疾病的重要生物标记。在诊断遗传性或获得性疾病时，通常进行核酸测试以确定靶标浓度(例如靶标核苷酸序列的拷贝数)。但是，临床样品(例如血液)中目标核酸的浓度通常较低，而通常大多数现有的检测方法都无法检测到很低浓度的核酸样品，因此需要对目标分子进行扩增。聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是应用最广泛的核酸扩增技术，用于扩增和检测低浓度的核酸。

现在数字化PCR(digital PCR，dPCR)技术已经发展成为检测核酸的重要的手段，可以得到非常好的定量分析结果。在dPCR中，DNA模板首先会被稀释至一定浓度，从统计学角度在扩增之前在反应室中只会存在一个或零个分子。反应室内存在等量的核酸扩增反应物，在适当的热反应条件下，核酸进行扩增反应。反应试剂中预先加入了荧光指示剂，检测到的荧光信号与扩增产物浓度呈正比关系。根据反应室的荧光信号的明暗对比，即可知道反应室存在的目标核酸的浓度。

目前，主要有四种手段可以进行dPCR检测：基于微乳液滴法、微陷阱法、微渠道法和液滴打印技术。液滴的荧光信号收集方法适用于光电倍增管检测，其他方法利用CCD或互补CMOS来捕获2D荧光图像。这四种技术都涉及到油水接触界面，其中微乳液滴法对油水接触性质要求较高，由于产生的液滴需要进行转移操作，因此要求微乳液滴具有很高的稳定性。打印法对油要求较低，但整个技术需要精密设备，成本较高。微陷阱法成本低，但也存在操作复杂，需要一定的检测经验的人才可操作的缺陷。微渠道法，相对操作简单，也无需昂贵设备支持，它需要巧妙设计芯片结构才能得到完美测试结果。然而，目前市面上还没有一种能够方便制备和操作，可以实现高通量的数字化分析芯片技术。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种简单工艺制作的微流控数字化芯片，利用油水界面张力控制液体在疏水性渠道内的流体行为，从而将PCR试剂封存在设计的微反应室内、并用油将其密封，可用于高效、便利的核酸扩增检测实验。以解决目前dPCR领域芯片技术复杂、制备工艺要求高、操作不便等问题。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于核酸扩增的数字化芯片，包括数字化检测阵列反应室、总进样口和总出样口；数字化阵列反应室包括若干个主渠道和若干个微单元，每个微单元通过一个主渠道连通总进样口和总出样口；所述微单元包括微单元反应室，微单元反应室的入口和出口分别连通主渠道，且微单元反应室入口与主渠道连接处之后的一段主渠道的宽度减小后变大，使主渠道内流经此处的水相转流到微单元反应室内，而主渠道内流经此处的油相继续沿着主渠道流动。

优选的，所述若干个主渠道互相平行。

优选的，所述数字化芯片厚度为50-80um。

基于上述数字化芯片的核酸扩增方法，包括如下步骤：

步骤1：将芯片内充满油，连接进样器到总进样口；出样口连接缓冲瓶，缓冲瓶连接抽气泵；

步骤2：移液枪取适量PCR试剂戳破进样器密封口，注射进入进样器内的油中，由于水相比重大于油，PCR反应试剂受重力向下坠落；

步骤3：打开抽气泵，在芯片内负压条件下，进样器中的液体会流入微单元反应室，微单元反应室内预先是充满油，当水相流到微单元反应室入口时，会转流到微单元反应室内，而不会继续沿着主渠道流；当水相全部流完，油相再次接近微单元反应室入口时，油会继续沿着主渠道流，而不会进入微单元反应室，从而实现将PCR水相密封；

步骤4：待油相将所有的微单元反应室密封，且主渠道内再次被油相充满时，关闭缓冲瓶止逆阀入口，关闭抽气泵，取下缓冲瓶，进行PCR扩增热反应。

有益效果：

(1)高通量，可同时进行10000个以上的PCR平行试验。

(2)操作简便，无需专业操作背景。

(3)芯片的使用具有普适性，方便和PCR反应设备，以及荧光检测设备等配合使用。既可以单独使用，也可与其他配套一体化设备一起使用。

(4)芯片制作工艺简单、成本低。

附图说明

图1为芯片装置总览图，A为薄膜密封，B为进样器，M为数字化检测阵列反应室，O为总出样口，I为总进样口，W为进样器B中预先加入的油。

图2为缓冲瓶示意图，E为进样口，Z为止逆阀，F为出气口，T为缓冲瓶腔体。

图3为微单元结构平面图。

图4(A)为单元结构。1为主渠道，2为微单元反应室入口，3为微单元反应室出口，4为微单元反应室。图4(B)为芯片矩阵结构示意图。溶液从左侧流入，右侧流出。图5为流体模拟软件模拟该数字化芯片一个单元的进样。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步的说明。

本发明设计了一个基于透明塑料或玻璃材质的微流控芯片，该芯片包括：进样器、数字化检测阵列反应室、总进样口和总出样口。

1)一个进样器，薄膜塑料材质，内置密封油，顶端薄膜密封，可以注射器或移液枪头戳破注射进样。

2)一个总进样口和一个总出样口，主要进行PCR反应试剂的流入和流出。

3)数字化阵列反应室包括若干个平行的主渠道，主渠道的两端分别连通总进样口和总出样口，主渠道上设有若干个微单元，每个微单元包括微单元反应室，微单元反应室的入口和出口分别连通主渠道，且微单元反应室入口与主渠道连接处之后的一段主渠道的宽度减小后变大，使主渠道内流经此处的水相转流到微单元反应室内，而主渠道内流经此处的油相继续沿着主渠道流；

基于本发明数字化芯片的核酸扩增方法包括如下步骤：

1)不论何种材质制备的芯片，内表面需要是疏水表面。可以油浸润，而不能水浸润。

2)首先将芯片内充满油，连接进样器到总进样口；总出样口连接缓冲瓶(收集废弃液体样品)，缓冲瓶连接抽气泵。

3)移液枪取适量PCR试剂戳破进样器密封口，注射进入进样器内的油中，由于水相比重大于油，PCR反应试剂受重力向下坠落。

4)打开抽气泵，在芯片内负压条件下，进样器中的液体会流入微单元反应室：微单元反应室内预先是充满油，当水相流到微单元反应室入口时，由于表面张力的改变，它会转流到微单元反应室内，而不会继续沿着主渠道流；当水相全部流完，油相再次接近微单元反应室入口时，油会继续沿着主渠道流，而不会进入反应室，从而实现将PCR水相密封。

5)待油相将所有的微单元反应室密封，且渠道内再次被油相充满时，关闭缓冲瓶止逆阀入口，关闭抽气泵，取下缓冲瓶，进行PCR扩增热反应。

如图1所示，左上角虚线B标出为进样器，其下端接口连通芯片总进样口I。A为薄膜密封，方便保持进样器内清洁，防止灰尘污染物进入和内置油溅出，可以注射器或移液枪头戳破注射进样。M为数字化检测阵列反应室。O为出样口，其连接图2中缓冲瓶。

如图2所示，缓冲瓶左边E为进样口，通过止逆阀(Z)连接芯片出样口O。F为出气口，连接真空泵。T为缓冲瓶腔体。

图3所示为芯片设计的平面结构，图中标线刻度为0.2毫米。

图4A和B分别为结构阵列单元和阵列示意图。芯片内管道和微反应室等结构高度相同，可避免因多层高度设计导致的制作工艺复杂的问题。高度范围在20-80微米均可，具体高度视情况而定，可以根据所需反应室的体积计算得出高度需求。

如图5所示，图中灰色表示油相(O)，黑色表示水相(W)。实验之前，芯片内部已经充满油，(A-B)显示进样开始，在外力作用下，油相推动水相从主渠道流入，水相的前端接近至阵列单元的入口处。由于芯片内表面为疏水结构，水相进入反应室的阻力要小于继续沿着主渠道移动的阻力。所以，水相进入反应室，同时反应室设计有导流出口，方便水相进入后把原本处在反应室的油推出反应室，实现液体置换。由于芯片内壁设计为疏水性，当水相充满反应室后，水相继续从导流渠道流出的压力明显大于油相流出的压力。多余的水会沿着主渠道继续向前移动(C)，而非进入反应室。(D)显示，水相后面的油继续往前移动，在反应室入口处，进入反应室的阻力大于继续沿着主渠道运动的阻力，因此会将多余的水相沿着主渠道往前推移，而不会进入反应室。最终实现将单元反应室隔离。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种用于核酸扩增的数字化芯片，包括数字化检测阵列反应室、总进样口和总出样口；其特征在于，数字化阵列反应室包括若干个主渠道和若干个微单元，每个微单元通过一个主渠道连通总进样口和总出样口；所述微单元包括微单元反应室，微单元反应室的入口和出口分别连通主渠道，且微单元反应室入口与主渠道连接处之后的一段主渠道的宽度减小后变大，使主渠道内流经此处的水相转流到微单元反应室内，而主渠道内流经此处的油相继续沿着主渠道方向流动。

2.根据权利要求1所述的一种用于核酸扩增的数字化芯片，其特征在于，所述若干个主渠道互相平行。

3.根据权利要求1所述的一种用于核酸扩增的数字化芯片，其特征在于，所述数字化芯片厚度为50-80um。

4.基于权利要求1所述数字化芯片的核酸扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：将芯片内充满油，连接进样器到总进样口；出样口连接缓冲瓶，缓冲瓶连接抽气泵；

步骤2：移液枪取适量PCR试剂戳破进样器密封口，注射进入进样器内的油中，由于水相比重大于油，PCR反应试剂受重力向下坠落；

步骤3：打开抽气泵，在芯片内负压条件下，进样器中的液体会流入微单元反应室，微单元反应室内预先是充满油，当水相流到微单元反应室入口时，会转流到微单元反应室内，而不会继续沿着主渠道流；当水相全部流完，油相再次接近微单元反应室入口时，油会继续沿着主渠道流，而不会进入微单元反应室，从而实现将PCR水相密封；

步骤4：待油相将所有的微单元反应室密封，且主渠道内再次被油相充满时，关闭缓冲瓶止逆阀入口，关闭抽气泵，取下缓冲瓶，进行PCR扩增热反应。

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