CN208125741U - 一种检测抗苗勒管激素的荧光微流控芯片 - Google Patents
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Abstract
本实用新型提供一种检测抗苗勒管激素的荧光微流控芯片,所述芯片包括基底、试剂层、避光层、位于避光层下方的亲水层、位于亲水层下方的微流控通道结构层、位于微流控通道结构层下方的回收层。本实用新型通过对荧光微流控芯片结构进行设计改造,增加单向清洗通道和包被室以及在标记抗体涂布处增加微柱结构,实现了对AMH抗体快速、准确、定量地对测量,有效消除反应体系中残余荧光微球对检测的影响,提高微流控芯片检测的荧光信号范围以及检测的精密度,实现抗苗勒管激素在微流体环境中的快速、准确、定量的测定。
Description
技术领域
本实用新型涉及临床医学测试领域,尤其涉及一种抗苗勒管激素定量检测微流控芯片。
背景技术
现代女性婚育龄的推迟已然成为大趋势,同时国家生育政策的放开,高龄高危产妇人口数量陡然增高,其中,不孕、不育、难孕人群比例与孕育风险不断提升。AMH的检测旨在辅助医师评估女性绝经时间和生育能力,从而达到指导女性不孕症治疗,甚至试管婴儿的特异化诊断治疗具有重大意义。
激素水平的检测是临床判断卵巢储备能力的传统方法之一,包括评估女性生殖激素六项指标,即促卵泡生成素(Follicle-stimulating hormone,FSH)、催乳激素(Prolactin,PRL)、促黄体生成激素(Luteinizing hormone,LH)、孕酮(Progesterone,P)、雌二醇(Estradiol2,E2)、睾酮(Testosterone,T)。传统最佳检测生殖激素的时间是在女性月经周期的第二至第三天进行。相较于其它指标,AMH检测不受月经周期的影响,可在一个月经周期内随时反映卵巢储备功能,而且检测结果稳定。
微流控芯片技术采用微机电加工技术协同生物化学反应技术在芯片上构建微流路反应系统,将生化反应与分析的过程浓缩至相互联系贯通的路径和固化空间组成的微芯片结构上,生物样品和反应液进入系统后,经过毛细虹吸、电水力泵和电渗流等方法驱动通道中反应体系的流动、混合、反应,形成微流路,从而达到芯片上完成一种或连续多种的生化反应。激光诱导荧光、电化学和化学等多种检测系统以及与光谱分析等技术手段结合的检测手段被用在微流控芯片样本检测过程,对样品进行快速、准确和高通量分析技术水平。
但常规设计的微流控芯片用于免疫荧光检测时存在检测过程背景较高、检测灵敏度以及检测准确度较差等问题。本发明通过对现有常规微流控设计进行改造,通过增加单向清洗通道和包被室以及在标记抗体涂布处增加微柱结构可以有效的解决上述问题,从而最终实现对目标产物快速、准确、定量地测量。
实用新型内容
为了达到对样品中抗苗勒管激素快速、准确的分析,本实用新型通过对微流控通道进行设计改造,增加两个单向清洗通道,可消除通道内残余荧光微球对检测的影响。设计两个包被室,提高抗原的捕获能力。从而定量检测抗苗勒管激素完成了本实用新型。
本实用新型的技术方案如下:
一种检测抗苗勒管激素的荧光微流控芯片,所述芯片包括基底、试剂层、避光层、位于避光层下方的亲水层、位于亲水层下方的微流控通道结构层、位于微流控通道结构层下方的回收层;
所述避光层包含遮光涂层、包被室视窗、加样孔、气孔及液体进入指示试剂视窗;
所述亲水层包含亲水性涂层、加样孔、气孔及液体进入指示试剂视窗;所述避光层和亲水层中的加样孔、气孔及液体进入指示试剂视窗的规格一致;
所述的微流控通道结构层包括加样孔、缓冲分流区、单向清洗通道、荧光微球室、S反应通道、包被室和回收通道入口;所述荧光微球室、S反应通道和包被室一起组成样本反应区;所述的回收通道入口连接微流控通道结构层和回收层;
所述回收层包含气孔、回收入口和储备废液的回收腔;所述的回收层的回收入口连接微流控通道结构层的回收通道入口。
所述微流控通道结构层中,缓冲分流区为树形分支结构,避免相同位置出现分枝结构。
所述微流控通道结构层中,单向清洗通道包括气孔、单向阀及通道,单向清洗通道有2个。所述单向清洗通道辅助检测,流体流向时间高于主通道反应时间,清楚主通道中残留荧光微球。
所述微流控通道结构层中,荧光微球室包括微柱和标有抗体的荧光微球,微柱的直径范围为0.1μm~1μm,微柱均匀分散于标记室内,所述微柱结构为圆柱、立方体或锥形。所述标有抗体的荧光微球,可特异性标记一种或多种抗体。
所述微流控通道结构层中,S反应通道宽度为5μm~20μm。
所述微流控通道结构层中,包被室有2个,包被室具有微引流通道;包被室微引流通道宽度0.5μm~5μm。每个包被室包被一种或多种抗体。所述包被室透过亲水层、避光层,对外可见,包括微球标记室在内的其它结构为避光层遮挡,对外不可见。
所述微流控通道结构层中,回收通道入口包括通往下方回收层的开口和液体进入指示试剂,所述指示试剂在有液体通过时会由白色变成红色。回收通道入口的液体进入指示试剂可穿过亲水层、避光层被肉眼观测或设备检测。
所述的避光层中指示试剂视窗的位置尺寸与微流控通道结构层中的回收通道入口的液体进入指示试剂位置尺寸一致。
所述的亲水层,是由PET材质做成,以PET材质的塑料作为支撑层,在支撑层上涂有亲水物质做成的亲水涂层,且支撑层上开有加样孔及透气孔,所述亲水层为无色透明,所述加样孔为圆形、方形或不规则形状,容积为50μL-500μL,所述透气孔直径2μm-20μm。
所述的亲水层,所述亲水层支撑材料除PET,还适用:PVC、PE、PP、PS中的任意一种。
所述亲水涂层的接触角为40°-60°。
所述回收层的厚度范围为400~800μm,长度范围为80~800mm,宽度范围为20~200mm。
所述微流控通道结构层的厚度范围为200~500μm,长度范围为80~800mm,宽度范围为20~200mm。
所述亲水层的厚度范围为100~400μm,长度范围为80~800mm,宽度范围为20~200mm。
所述避光的厚度范围为200~600μm,长度范围为80~800mm,宽度范围为20~200mm。
从以上技术方案可以看出,本实用新型通过对荧光微流控芯片结构进行设计改造,增加单向清洗通道和包被室以及在标记抗体涂布处增加微柱结构,实现了对AMH抗体快速、准确、定量地对测量,有效消除反应体系中残余荧光微球对检测的影响,提高微流控芯片检测的荧光信号范围以及检测的精密度,实现抗苗勒管激素在微流体环境中的快速、准确、定量的测定。
附图说明
图1为本实用新型的检测抗苗勒管激素荧光微流控芯片的整体结构图。
图2为本实用新型的微流控芯片避光层的结构图。
图3为本实用新型的微流控芯片亲水层的结构图。
图4为本实用新型的微流控芯片通道结构层的示意图。
图5为本实用新型的微流控芯片回收层的结构图。
图6为本实用新型的微流控芯片荧光微球标记室的示意图。
图7为本实用新型的微流控芯片捕获抗体包被室的示意图。
图8为本实用新型的微流控芯片单向清洗通道出口的结构图。
图9为本实用新型的微流控芯片回收通道入口的结构图。
图10a-图10b为本实用新型的微流控芯片单向清洗通道或S反应通道可替代结构。
其中,A为避光层, A1为加样孔,A2为气孔1号,A3为包被室1号视窗,A4为气孔2号,A5为包被室2号视窗,A6为气孔3号,A7为包被室3号视窗,A8为液体进入指示试剂视窗,B为亲水层,B1为加样孔,B2为气孔1号,B3为气孔2号,B4为液体进入指示试剂视窗,C为微流控通道结构层,C1为样品池,C2为单向清洗通道1号,C3为单向清洗通道2号,C4为荧光微球室,C5为S反应通道,C6为包被室1号,C7为包被室2号,C8为包被室3号(即质控室),C9为回收通道入口,D为回收层,D1、D2、D4、D5为气孔,D3为回收入口。
具体实施方式
为了本技术领域的人员能够理解本实用新型方案,结合本实用新型实施例附图,对本实用新型实施例中的技术方案进行完整明确地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本实用新型部分实施例,而不是全部的实施例。基于本实用新型中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都应当属于本实用新型保护的范围。
本实用新型提供一种检测抗苗勒管激素荧光微流控芯片,所述芯片能够定量测定血液中的抗苗勒管激素含量。
如图1所示,本实用新型的检测抗苗勒管激素的荧光微流控芯片,包括基底、试剂层、避光层A、位于避光层A下方的亲水层B、位于亲水层B下方的微流控通道结构层C、位于微流控通道结构层C下方的回收层D;
如图2所示,本实用新型的检测抗苗勒管激素的荧光微流控芯片的避光层,包含黑色遮光涂层、加样孔、三个气孔、三个包被室视窗及一个液体进入指示试剂视窗。其中,加样孔A1,其主要作用是为样品进入通道结构层提供途径。气孔1号A2,用于为流体从加样孔流至S反应通道提供合适气压环境。包被室1号视窗A3,用于检测包被室1号中的荧光信号强度。气孔2号A4,用于提供流体流至包被室1号合适的压强。包被室2号视窗A5,用于检测包被室2号中的荧光信号强度。气孔3号A6,用于提供流体流至包被室2号合适的压强。包被室3号视窗A7,用于检测包被室3号中的荧光信号强度。液体进入指示试剂视窗A8,用于观测流体是否通过入口进入回收层。
如图3所示,本实用新型的检测抗苗勒管激素的荧光微流控芯片的亲水层,包含亲水性涂层、加样孔、2个气孔及液体进入指示试剂视窗;所述避光层和亲水层中的加样孔、气孔及液体进入指示试剂视窗的规格一致;其中,加样孔B1,其主要作用是为样品进入通道结构层提供途径,气孔1号B2,为流体从加样孔流至S反应通道提供合适气压环境。气孔2号B3,用于提供流体流至包被室1号合适的压强。液体进入指示试剂视窗B4,用于观测流体是否通过入口进入回收层。
如图4所示,本实用新型的检测抗苗勒管激素的荧光微流控芯片的微流控通道结构层,包括加样孔、缓冲分流区、2个单向清洗通道、荧光微球室、S反应通道、2个包被室和回收通道入口;所述荧光微球室、S反应通道和包被室一起组成样本反应区;所述的回收通道入口连接微流控通道结构层和回收层;其中,样品池C1(加样孔),为血液样品加入和临时储存提供空间。单向清洗通道1号C2,为反应结束后清洗通道内参与荧光微球提供可能,可通过改变通道长度改变清洗开始的时间。单向清洗通道2号C3,为反应结束后清洗通道内参与荧光微球提供可能。荧光微球室C4,为标记的荧光微球提供保存和分散的空间。S反应通道C5,样本与标有抗体的荧光微球充分混合反应。包被室1号C6,抗原在此得到第一次固定。包被室2号C7,抗原在此得到第二次固定。包被室3号C8(质控室),抗原在此得到第三次固定(荧光微球再次得到固定)。回收通道入口C9,反应废液从此处通往回收层。
如图5所示,本实用新型的检测抗苗勒管激素的荧光微流控芯片的回收层,包含四个气孔、回收入口和储备废液的回收腔;所述的回收层的回收入口连接微流控通道结构层的回收通道入口。其中,气孔D1、D2、D4、D5,为流体进入回收池提供合适的压强范围。回收入口D3,连接回收通道入口C9。
如图6所示,本实用新型的微流控通道结构层的荧光微球室包括微柱和标有抗体的荧光微球,包含点阵结构和标有抗体的荧光微球。图示仅为一例点阵结构均匀分散1μm,可分散至0.1μm~1μm,微柱结构不局限于圆柱、立方体、锥形。
如图7所示,本实用新型的微流控通道结构层的包被室,具有微引流通道,微引流通道为环状结构,微引流通道宽度0.5μm~5μm,不同的宽度具有不同的反应时间效果。
如图8所示,本实用新型的微流控通道结构层的单向清洗通道,包括气孔、单向阀及通道。其中,气孔为清洗通道中流体提供合适压强环境。单向阀保证主通道中的反应液无法进入清洗通道形成反向流。通道为清洗流体进入主通道提供途径。
如图9所示,本实用新型的微流控通道结构层的回收通道入口,流体流出包被室3号,进入回收入口,被入口通过虹吸进入回收层,回收层具有均匀的亲水涂层,为完成反应层析过程提供恒定的动力。回收通道入口具有液体进入指示试剂,当反应体系通过入口进入回收层时,必经指示试剂,指示试剂遇水由白色变为红色,可通过视窗被肉眼观察或设备检测。
如图10a-图10d所示,本实用新型的微流控通道结构层的单向清洗通道或S反应通道具有多种可替代结构,任何可用于改变通道长度或具有混合作用的通道结构均可用于单向清洗通道或S反应通道的替代结构。
1. AMH荧光微流控检测卡的制作
本实用新型的检测抗苗勒管激素荧光微流控芯片的制作方法,其主要思路是契合检测试剂和通道结构而制得。具体步骤如下:
步骤一:荧光微球标记:选择带有羧基的荧光微球,经过缓冲体系稳定、EDC活化、抗体加入、温育、TRIS封闭,制备获得标有抗体的荧光微球。其中荧光微球可使用量子点(60-90nm)、镧系微球(100-1000nm)、荧光素等,缓冲体系0.01M pH7.5的PBS缓冲体系为优选,EDC活化时间5~30min为优选。
步骤二:包被抗体制备:特异性包被抗体经过缓冲体系稳定,稳定剂及保护剂加入,制备获得。其中用于稳定的缓冲体系0.01M pH7.5的PB缓冲体系为优选,稳定为海藻糖为优选,稳定剂甘油为优选。
步骤三:制备微流控芯片的主要结构:避光层(A)、亲水层(B)、结构层(C)、回收层(D)。其中避光层A为刀模切割制备,A1~A8均为均为击穿结构,制作顺序为先击穿A3、A5、A7,击穿后粘贴亲水层B,可加工加样孔和气孔,为激光击穿操作,击穿结构有A1、A2、A4、A6、A8、B1、B2、B3、B4。结构层C和回收层D为注塑制备,注塑获得相应结构。其中,液体进入指示试剂为住宿完成后粘贴与亲水膜B对应的A8处,并进行烘干处理,烘干时间优选为30min~60min。
步骤四:键合结构层C和回收层D。使用超声波键合。键合结构层C和回收层D,根据不同材质的特性使用相应参数的超声波功率对结构层和回收层进行键合,键合结果优选为完全密封(回收入口除外)。
步骤五:标有抗体的荧光微球分散在微球标记室C4。微球标记室具有均匀的点阵结构,点阵结构均匀分散至0.1μm~1μm,微柱结构不局限于圆柱、立方体、锥形。悬浮与缓冲体系中的荧光微球以0.5μL~3μL的加入量分散与微球标记室,于30℃~40℃恒温环境中,干燥3~6min。
步骤六:特异性抗体包被:对特异性抗体包被于包被室C6、C7、C8。适合的缓冲体系中0.5μL~3μL抗体蛋白与多聚物基板形成共价吸附,在温度37~42℃恒温85%~95%湿度环境中,包被5h~24h。置于30℃~40℃恒温环境中,干燥3~6min。
步骤七:键合A+B结构和C+D结构,根据不同材质的特性使用相应参数的超声波功率对结构层和回收层进行键合,键合结果优选为完全密封。
步骤八:密封:微流控芯片生产保存环境优选为湿度低于25%的环境中(包被工序除外),因此生产完成后,使用塑封工艺对微流控芯片进行及时密封,保证在生产保存过程中亲水性、标记微球、包被抗体保持干燥恒定的环境。
基于上述实施例,本实用新型提供另外一种检测抗苗勒管激素荧光微流控芯片的制作方法,其主要思路是分别契合检测试剂和通道结构而制得。具体步骤如下:
步骤一:荧光微球标记:选择带有羧基的荧光微球,经过缓冲体系稳定、EDC活化、抗体加入、温育、TRIS封闭,制备获得标有抗体的荧光微球。其中荧光微球可使用量子点(60-90nm)、镧系微球(100-1000nm)、荧光素等,缓冲体系0.01M pH7.5的PBS缓冲体系为优选,EDC活化时间5~30min为优选。
步骤二:包被抗体制备:特异性包被抗体经过缓冲体系稳定,稳定剂及保护剂加入,制备获得。其中用于稳定的缓冲体系0.01M pH7.5的PB缓冲体系为优选,稳定为海藻糖为优选,稳定剂甘油为优选。
步骤三:制备微流控芯片的主要结构:避光层(A)、亲水层(B)、结构层(C)、回收层(D)。其中避光层A为刀模切割制备,A1~A8均为均为击穿结构,制作顺序为先击穿A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8。
步骤四:击穿后粘贴亲水层B,可加工加样孔和气孔,为激光击穿操作,击穿结构有B1、B2、B3、B4。
步骤五:结构层C和回收层D为注塑制备,注塑获得相应结构。其中,液体进入指示试剂为住宿完成后粘贴与亲水膜B对应的A8处,并进行烘干处理,烘干时间优选为30min~60min。
步骤六:胶合避光层A和亲水层B,滚压完成。键合结构层C和回收层D。使用超声波键合,键合结构层C和回收层D,根据不同材质的特性使用相应参数的超声波功率对结构层和回收层进行键合,键合结果优选为完全密封(回收入口除外)。
步骤七:标有抗体的荧光微球分散在微球标记室C4。微球标记室具有均匀的点阵结构,点阵结构均匀分散至0.1μm~1μm,微柱结构不局限于圆柱、立方体、锥形。悬浮与缓冲体系中的荧光微球以0.5μL~3μL的加入量分散与微球标记室,于30℃~40℃恒温环境中,干燥3~6min。
步骤八:特异性抗体包被:对特异性抗体包被于包被室C6、C7、C8。适合的缓冲体系中0.5μL~3μL抗体蛋白与多聚物基板形成共价吸附,在温度37~42℃恒温85%~95%湿度环境中,包被5h~24h。置于30℃~40℃恒温环境中,干燥3~6min。
步骤九:键合A+B结构和C+D结构,根据不同材质的特性使用相应参数的超声波功率对结构层和回收层进行键合,键合结果优选为完全密封。
步骤十:密封:微流控芯片生产保存环境优选为湿度低于25%的环境中(包被工序除外),因此生产完成后,使用塑封工艺对微流控芯片进行及时密封,保证在生产保存过程中亲水性、标记微球、包被抗体保持干燥恒定的环境。
2.检测
(1)采集血样,用AMH抗原标准品调节血样中AMH的浓度,将血样调节成0.1ng/mL、1.125ng/mL、4.5ng/mL、9ng/mL以及18ng/mL五个浓度的样本。
(2)将每个浓度的血样样本分成二等分。第一份在常规设计的微流控芯片上用配套仪器进行检测;第二份用本实用新型的微流控检测卡在配套检测仪器上检测。
(3)比较用本实用新型的检测卡测试结果与常规设计的微流控芯片检测结果的检测灵敏度及检测精密度。
其检测结果如下:
表1 用本实用新型的检测卡测试结果与常规设计的微流控芯片检测结果
从表1的测试结果可看出:本实用新型的免疫微流控检测卡在检测AMH血液样本时与常规设计的微流控芯片相比较,本方案设计的微流控检测卡具有更好的检测灵敏度和检测精密度以及测试线性相关性。
Claims (9)
1.一种检测抗苗勒管激素的荧光微流控芯片,其特征在于,所述芯片包括基底、试剂层、避光层、位于避光层下方的亲水层、位于亲水层下方的微流控通道结构层、位于微流控通道结构层下方的回收层;
所述避光层包含遮光涂层、包被室视窗、加样孔、气孔及液体进入指示试剂视窗;
所述亲水层包含亲水性涂层、加样孔、气孔及液体进入指示试剂视窗;所述避光层和亲水层中的加样孔、气孔及液体进入指示试剂视窗的规格一致;
所述的微流控通道结构层包括加样孔、缓冲分流区、单向清洗通道、荧光微球室、S反应通道、包被室和回收通道入口;所述荧光微球室、S反应通道和包被室一起组成样本反应区;所述的回收通道入口连接微流控通道结构层和回收层;
所述回收层包含气孔、回收入口和储备废液的回收腔;所述的回收层的回收入口连接微流控通道结构层的回收通道入口。
2.根据权利要求1所述的检测抗苗勒管激素的荧光微流控芯片,其特征在于,所述微流控通道结构层中,缓冲分流区为树形分支结构。
3.根据权利要求1所述的检测抗苗勒管激素的荧光微流控芯片,其特征在于,所述微流控通道结构层中,单向清洗通道包括气孔、单向阀及通道,单向清洗通道有2个。
4.根据权利要求1所述的检测抗苗勒管激素的荧光微流控芯片,其特征在于,所述微流控通道结构层中,荧光微球室包括微柱和标有抗体的荧光微球,微柱的直径范围为0.1μm~1μm,微柱均匀分散于标记室内,所述微柱结构为圆柱、立方体或锥形。
5.根据权利要求1所述的检测抗苗勒管激素的荧光微流控芯片,其特征在于,所述微流控通道结构层中,S反应通道宽度为5μm~20μm。
6.根据权利要求1所述的检测抗苗勒管激素的荧光微流控芯片,其特征在于,所述微流控通道结构层中,包被室有2个,包被室具有微引流通道;包被室微引流通道宽度0.5μm~5μm。
7.根据权利要求1所述的检测抗苗勒管激素的荧光微流控芯片,其特征在于,所述微流控通道结构层中,回收通道入口包括通往下方回收层的开口和液体进入指示试剂,所述指示试剂在有液体通过时会由白色变成红色。
8.根据权利要求1所述的检测抗苗勒管激素的荧光微流控芯片,其特征在于,所述的避光层中指示试剂视窗的位置尺寸与微流控通道结构层中的回收通道入口的液体进入指示试剂位置尺寸一致。
9.根据权利要求1所述的检测抗苗勒管激素的荧光微流控芯片,其特征在于,所述的亲水层,是由PET材质做成,以PET材质的塑料作为支撑层,在支撑层上涂有亲水物质做成的亲水涂层,且支撑层上开有加样孔及透气孔,所述亲水层为无色透明,所述加样孔为圆形、方形或不规则形状,容积为50μL-500μL,所述透气孔直径2μm-20μm。
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