CN205910202U - 绒毛膜促性腺激素β亚单位微流控盘片 - Google Patents
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Abstract
本实用新型公开了一种绒毛膜促性腺激素β亚单位微流控盘片，包括微流控盘片，所述的微流控盘片上安装有微流检测单元，所述的微流检测单元包括全血注入槽、全血分离信道、血球储存槽、血浆传送流道、混合/侦测槽、人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体包被的磁微粒溶液注入槽、清洗液注入槽、内含磁铁的外部磁铁区域、废液槽、碱性磷酸酶标记的人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体溶液注入槽、发光底物液注入槽。本实用新型采用简单的方法即可实现微流控盘片内部微流体的智慧控制，同时能够使反应液体得以充分混合，保证反应体系高效进行，快速实现样品中 hCG 浓度的定量检测；具有操作简单，检测灵敏度高，结果准确可靠，重复性好，低成本的特点。
Description
技术领域
本实用新型涉及一种绒毛膜促性腺激素β亚单位微流控盘片，属于医学免疫体外诊断领域，能够在很短时间内实现对生物样品中人绒毛膜促性腺激素β亚单位的定量检测，具有操作简单，灵敏度高，低成本的特点。
背景技术
人绒毛膜促性腺素(Human Chorionic Gonadotropin，hCG)是由胎盘合体滋养层细胞合成和分泌的糖蛋白激素，由α、β两个不同亚单位组成，α亚单位与垂体分泌的FSH（促卵泡激素）、LH（促黄体生成素）和TSH（促甲状腺激素）等的α亚单位结构相似，相互间能发生交叉反应。β亚单位与LH的β亚单位不同，特异性更强，成为检测中的首选靶点，总β-hCG可以在很大程度上替代总hCG的指示作用。hCG具有FSH和LH的功能，可以维持月经黄体的寿命，使月经黄体增大成为妊娠黄体；可以促进雄激素转化为雌激素，同时刺激孕酮形成；可吸附于滋养细胞表面，抑制植物凝集素对淋巴细胞的刺激作用，以免胚胎滋养层细胞被母体淋巴细胞攻击；具有类LH功能，在胎儿垂体分泌LH以前，刺激胎儿睾丸分泌睾酮促进男性性分化；还可促进性腺发育，对男性能刺激睾丸中间质细胞的活力，增加雄性激素（睾酮）的分泌；能与母体甲状腺细胞TSH受体结合，刺激甲状腺活性。hCG 的检查对早期妊娠诊断有重要意义，对异常妊娠诊断、滋养层肿瘤患者（卵巢和卵巢外绒毛癌）的诊断和跟踪、非滋养层肿瘤患者（卵巢癌、宫颈癌、乳腺癌、胃肠癌和睾丸癌）的诊断和跟踪以及21三体综合征的筛查等有一定价值。成熟女性因受精的卵子移动到子宫腔内着床后，形成胚胎，在发育成长为胎儿过程中，胎盘合体滋养层细胞产生大量的hCG，可通过孕妇血液循环而排泄到尿中。当妊娠1～2.5周时，血清和尿中的hCG水平即可迅速升高，第8周孕期达到高峰，至孕期第4个月始降至中等水平，并一直维持到妊娠末期。血hCG检查是目前最早最准确测试是否怀孕的检查方式，一般是在性生活后8-10天可以通过抽血检查hCG来明确是否有怀孕。
目前，检测 β-hCG 的方法主要有酶联免疫分析法 (ELISA) 和化学发光免疫分析法 (CLIA)。 酶联免疫分析法由于方法间差异较大，导致结果不均一，且线性范围较窄，操作复杂，不适于做单人份或少量标本的检测。化学发光技术兴起于上个世纪80年代，是继酶联免疫技术和放免技术之后发展起来的新兴技术，具有高灵敏度、高特异性，方法简便、快速，标记结合物稳定，无放射性同位素损伤和污染等特点，目前得到了广泛的应用。
磁微粒免疫检测技术是利用高分子材料合成一定粒度大小的磁性固相微粒作载体，以物理吸附、化学偶联等方法包被上具有特异性亲和力的的抗体或抗原等各种免疫活性物质，具有分离速度快、效率高、可重复性好、操作简单、不影响被分离细胞或其他生物材料的生物学性状和功能等特点，在外加磁场作用下可定向运动，使某些特殊成分得以分离、浓集或纯化。
微流控盘片作为一种新型的分析检测平台，具有高通量、集成化、便携式、易操作、低成本等优点，已经在众多领域中得到了广泛的应用，尤其是在免疫分析领域已崭露头角。
免疫磁珠的生物微流控盘片是将磁颗粒技术，免疫分析集成到微流控芯片上的一种分析检测方法，目前这种综合性的检测方法的主要难点表现为：1) 液体在芯片内部微流动的智能控制，目前常采用的方法是在芯片内部设置多个微泵和微阀，使得微流控体系变得更加复杂化；2) 反应体系的混合不充分，导致反应不充分；3) 集成化程度不高，导致非特异性背景高。
实用新型内容
本实用新型目的在于提供了一种绒毛膜促性腺激素β亚单位微流控盘片；本实用新型采用简单的方法即可实现微流控盘片内部微流体的智慧控制，同时能够使反应液体得以充分混合，保证反应体系高效进行，可快速实现样品中 hCG 浓度的定量检测；具有操作简单，检测灵敏度高，结果准确可靠，重复性好，低成本的特点。
为了达到上述目的，本实用新型的技术方案是：
一种绒毛膜促性腺激素β亚单位微流控盘片，包括微流控盘片，所述的微流控盘片上安装有微流检测单元，所述的微流检测单元包括全血注入槽，所述的全血注入槽通过全血分离信道与血球储存槽相连，所述血球储存槽与血浆传送流道连通；所述的血浆传送流道与混合/侦测槽顶部相连；所述的混合/侦测槽顶部通过管路与人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体包被的磁微粒溶液注入槽连通；所述的混合/侦测槽顶部还通过管路与清洗液注入槽连通；所述的混合/侦测槽一侧安装有内含磁铁的外部磁铁区域；所述的混合/侦测槽底部通过管路与废液槽连通，且所述的混合/侦测槽底部与废液槽之间的管路上安装有阀门；所述的人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体包被的磁微粒溶液注入槽顶部通过管路与碱性磷酸酶标记的人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体溶液注入槽的底部连通；所述的清洗液注入槽顶部通过管路与发光底物液注入槽的底部连通。
所述的微流控盘片上安装6个以上且为6的倍数的微流检测单元。
所述的微流控盘片上优选安装12个微流检测单元。
本实用新型的有益效果是：本实用新型采用简单的方法即可实现微流控盘片内部微流体的智慧控制，同时能够使反应液体得以充分混合，保证反应体系高效进行，可快速实现样品中 hCG 浓度的定量检测；具有操作简单，检测灵敏度高，结果准确可靠，重复性好，低成本的特点。
附图说明
图1是本实用新型一种绒毛膜促性腺激素β亚单位微流控盘片的结构示意图；
图2是图1中微流控盘片上单个微流检测单元的放大示意图。
具体实施方式
实施例1：人绒毛膜促性腺激素β亚单位的定量检测
本实施例的一种绒毛膜促性腺激素β亚单位微流控盘片，如图1、2所示，包括微流控盘片13，所述的微流控盘片13上安装有12个微流检测单元，所述的每个微流检测单元包括全血注入槽1，所述的全血注入槽1通过全血分离信道2与血球储存槽3相连，所述血球储存槽3与血浆传送流道4连通；所述的血浆传送流道4与混合/侦测槽7顶部相连；所述的混合/侦测槽7顶部通过管路与人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体包被的磁微粒溶液注入槽9连通；所述的混合/侦测槽7顶部还通过管路与清洗液注入槽10连通；所述的混合/侦测槽7一侧安装有内含磁铁的外部磁铁区域8；所述的混合/侦测槽7底部通过管路与废液槽6连通，且所述的混合/侦测槽7底部与废液槽6之间的管路上安装有阀门5；所述的人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体包被的磁微粒溶液注入槽9顶部通过管路与碱性磷酸酶标记的人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体溶液注入槽11的底部连通；所述的清洗液注入槽10顶部通过管路与发光底物液注入槽12的底部连通。
1. 人绒毛膜促性腺激素β亚单位溶液配制
1）人绒毛膜促性腺激素β亚单位系列校准品的制备：用胎牛血清将人绒毛膜促性腺激素β亚单位纯品（罗氏诊断试剂（上海）有限公司）稀释为系列校准品，其校准品浓度范围为0～1000IU/L。
2）人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体包被的磁微粒溶液的制备：
技术方案一：将2.0μm磁微粒（广州达于成贸易有限公司）加磁场，静置5min，倒出上清液，用MES缓冲液（2-（N-吗啉）乙磺酸一水合物，上海励瑞生物科技有限公司）清洗3次，并用该缓冲液进行悬浮；用去离子水配制EDC溶液（碳二亚胺，上海励瑞生物科技有限公司）和Sulfo-NHS溶液（N-羟基硫代琥珀酰亚胺，上海励瑞生物科技有限公司），每mL磁微粒悬浮液中加入1mL浓度为10mg/mL的EDC溶液及Sulfo-NHS溶液，室温条件下搅拌反应1h后，加磁场，静置5min，倒出上清液；用MES缓冲液悬浮，每mL磁微粒悬浮液中加入1mg人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体，在室温条件下搅拌反应1h后，加磁场，静置5min，倒出上清液，加Tris-HCl缓冲液清洗3次；用含有品质百分浓度为0.5%的牛血清白蛋白和品质百分浓度为0.02%Proclin300（防腐剂，上海励瑞生物科技有限公司）的PBS缓冲液重悬，得到人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体包被的磁微粒溶液。
技术方案二：将人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体置于透析袋中，在PBS缓冲液中过夜透析；用PBS缓冲液配制BNHS溶液（生物素-N-羟基琥珀亚胺酯，海励瑞生物科技有限公司），每mg抗体中加入15μL BNHS溶液，混合均匀，室温反应30min；将标记好的抗体置于透析袋中，在PBS缓冲液中过夜透析。将2.0μm链霉亲和素磁微粒（广州达于成贸易有限公司）加磁场，静置5min，倒出上清液，用PBS缓冲液清洗3次，并用该缓冲液进行悬浮；倒出上清液；每mL磁微粒悬浮液中加入1mg标记好的抗体，混合均匀，室温反应20min；用含有5%牛血清白蛋白的Tris-HCl缓冲液清洗3次；用含有0.5%牛血清白蛋白和0.02% Proclin300 的PBS缓冲液重悬，得到人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体包被的磁微粒溶液。
3）碱性磷酸酶标记的人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体溶液的制备：用PB缓冲液配制Sulfo-SMCC溶液（4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐，上海励瑞生物科技有限公司），每mg碱性磷酸酶中加入0.1mL Sulfo-SMCC溶液，混合均匀，室温反应30min，用PB缓冲液进行透析；用PB缓冲液配制2-亚氨基硫羟烷盐酸盐溶液，每mg抗体中加入0.1mL 2-亚氨基硫羟烷盐酸盐溶液，混合均匀，室温反应30min，用PB缓冲液进行透析；将上述透析后的碱性磷酸酶和抗体混合均匀，室温反应120min；通过蛋白纯化系统（AKTA purifier100）收集蛋白，加入50%的甘油，得到碱性磷酸酶标记的人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体溶液。
4）碱性磷酸酶催化的化学发光底物液的制备：向Tris-HCl缓冲液中加入2-氨基-2-甲基-1-丙醇、AMPPD（1，2-二氧环已烷衍生物，广州达于成贸易有限公司）和发光增强剂（AP底物增强剂，上海励瑞生物科技有限公司）。
5）清洗液的制备：向Tris-HCl缓冲液中加入0.02%的吐温20和15%的氯化钠。
2. 绒毛膜促性腺激素β亚单位微流控盘片及其使用方法：
1）标准曲线的制作：取 25 μL 人绒毛膜促性腺激素β亚单位（hCG）系列校准品(浓度为0 IU/ L、5 IU/ L、25 IU/ L、100 IU/ L、250 IU/ L、500 IU/ L、1000 IU/ L) 加入本实施例中人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体包被的磁微粒溶液注入槽9，将微流控盘片13置于配套仪器中。每个样本分别重复测定三次。配套仪器根据 RLU 和 hCG 浓度间的比例关系，自动拟合计算出 hCG 浓度，取三次测定平均值，绘制标准曲线。
2）将微流控盘片13放入配套仪器中，开启自动加样装置，可将全血 120 μL 、人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体包被的磁微粒溶液 15 μL、碱性磷酸酶标记的人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体溶液 15 μL 分别注入至全血注入槽1、人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体包被的磁微粒溶液注入槽9、碱性磷酸酶标记的人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体溶液注入槽11中。
3）以 4,000 RPM (加速度a=2,500 RPM/s) 操控微流控盘片13旋转 60 秒，能在全血分离信道2分离血浆及血球，并将人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体包被的磁微粒溶液及碱性磷酸酶标记的人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体溶液传送至混合/侦测槽7，人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体包被的磁微粒溶液可藉外部磁铁区域8中的磁铁的吸引保留于混合/侦测槽 (可避免被冲刷至废液槽)。
4）以 1,300 RPM (加速度a=800 RPM/s) 操控微流控盘片13旋转14秒，可将血浆经由血浆传送流道4传送至混合/侦测槽7，血球则被保留于血球储存槽3。
5）以1,800 RPM (加速度a=3,500 RPM/s) 操控微流控盘片13旋转20秒，藉由外部磁铁区域8中的磁铁操控，可操纵人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体包被的磁微粒于混合/侦测槽7内移动，进而达到良好的混合/培育效果。
6）将清洗液70 μL注入至清洗液注入槽10内，以4,200 RPM (加速度a=2,600 RPM/s) 操控微流控盘片13旋转 12 秒，可将清洗液传送至混合/侦测槽7，清洗液可置换混合/侦测槽7内的液体，此液体会被传送至废液槽6，人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体包被的磁微粒可藉由外部磁铁区域8中的磁铁的吸引保留于混合/侦测槽内。
7）将发光底物液 50 μL注入至发光底物液注入槽12内，以1,700 RPM (加速度a=2,000 RPM/s) 操控微流控盘片13旋转23秒，可将发光底物传送至混合/侦测槽7，发光底物可置换混合/侦测槽7内的液体，此液体会被传送至废液槽6，人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体包被的磁微粒可藉由外部磁铁区域8中的磁铁的吸引保留于混合/侦测槽内。最终，已反应的液体会在混合/侦测槽7进行检测，根据相对发光强度 (RLU) 与人绒毛膜促性腺激素β亚单位抗原浓度间的比例关系，检测系统可自动换算，可快速报告测试结果，从而实现人绒毛膜促性腺激素β亚单位的定量检测。
8）结果表明：采用本实用新型所述方法通过进一步的试验，检测灵敏度为 0.001IU/L，检测范围为 0.001～1000 IU/L，批间变异系数小于 8 %，批内变异系数小于 8 %。
本实施例采用简单的方法即可实现微流控盘片内部微流体的智慧控制，同时能够使反应液体得以充分混合，保证反应体系高效进行，可快速实现样品中 hCG 浓度的定量检测；具有操作简单，检测灵敏度高，结果准确可靠，重复性好，低成本的特点。
实施例2：磁微粒颗粒尺寸筛选
磁性微球的粒径小，比表面积大，表面含有活性基团，故偶联容量大，但磁性微球尺寸过小不利于磁铁收集，尺寸过大在盘片中不利于混合反应，故进行磁微粒尺寸筛选。
其他的实验条件参见实施例1，磁微粒颗粒的尺寸按照以下方案进行。
选择颗粒尺寸分别为 0.1 μm、0.5 μm、1.0 μm、1.5 μm、2.0 μm、3.0 μm、5.0 μm磁颗粒标记降钙素原单克隆抗体抗体。检测时采用磁性大小经过优选的永久磁铁，固定磁铁高度。
实验结果如下 ：
磁微粒粒径尺寸从 0.1 μm、0.5 μm、1.0 μm、1.5 μm、2.0 μm、3.0 μm 依次增强，3.0 μm 干扰加大，5.0 μm 开始减小，信号值最低，综合各因素 2.0 μm 信号最强，干扰最小。
结果分析 ：磁微粒尺寸较小时，比表面积较大，表面所负载的生物分子量大，同时能够很好地分散在溶液中，但要保证磁性微球充分被收集所需的磁场强度大。在本实施例中由于磁珠所受的磁场力不能保证其充分被收集，导致部分有效磁珠在清洗过程中流失，从而导致最终检测信号值不高。当磁颗粒粒径较大时，比表面积小，表面生物分子的标记率相对较低，相同条件下，磁性粒子所受磁场力大，分散的磁珠能够得到充分的收集，但其由于极易发生沉降，导致生物分子间反应不充分，从而减弱发光信号。综合考虑，粒径为 1.0μm 至 3.0 μm 磁性微球效果较好，因此本实用新型的实施例中 2.0 μm 的磁性微球效果最好。
Claims (1)
1.一种绒毛膜促性腺激素β亚单位微流控盘片，其特征在于：包括微流控盘片(13)，所述的微流控盘片(13)上安装有微流检测单元，所述的微流检测单元包括全血注入槽(1)，所述的全血注入槽(1)通过全血分离信道(2)与血球储存槽(3)相连，所述血球储存槽(3)与血浆传送流道(4)连通；所述的血浆传送流道(4)与混合/侦测槽(7)顶部相连；所述的混合/侦测槽(7)顶部通过管路与人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体包被的磁微粒溶液注入槽(9)连通；所述的混合/侦测槽(7)顶部还通过管路与清洗液注入槽(10)连通；所述的混合/侦测槽(7)一侧安装有内含磁铁的外部磁铁区域(8)；所述的混合/侦测槽(7)底部通过管路与废液槽(6)连通，且所述的混合/侦测槽(7)底部与废液槽(6)之间的管路上安装有阀门(5)；所述的人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体包被的磁微粒溶液注入槽(9)顶部通过管路与碱性磷酸酶标记的人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体溶液注入槽(11)的底部连通；所述的清洗液注入槽(10)顶部通过管路与发光底物液注入槽(12)的底部连通；所述的微流控盘片(13)上安装12个微流检测单元。
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