CN205046137U - 一种用于人工皮肤组织培养的气液界面灌注式生物反应器 - Google Patents
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Abstract
一种用于人工皮肤组织培养的气液界面灌注式生物反应器，本实用新型涉及一种人工皮肤组织培养的气液界面生物反应器。本实用新型的目的是为了解决常用的悬挂式培养小室需要大量操作员频繁更换培养液且在更换过程中部分样品会染菌的问题。本实用新型的生物反应器包括上盖、下托盖、进气管、出气管、进液管、出液管、注气注射器、注液注射器和收集装置。本实用新型制备的生物反应器实现了气液界面复杂的培养模式，而且减少了因频繁更换培养液带来的染菌风险，提高培养成功率。本实用新型制备的气液界面灌注式生物反应器用于人工皮肤组织培养。
Description
技术领域
本发明涉及一种人工皮肤组织培养的气液界面生物反应器。
背景技术
皮肤是人体最大的器官，是人体阻碍水流失、紫外、机械伤害、毒性及细菌病毒伤害的一道重要防线。若大面积烧伤病人不能及时进行治疗，伤口就会发炎，导致死亡。针对大面积(直径大于1cm2)的皮肤缺失，治疗的黄金准则是“自体皮肤移植”。然而，大面积皮肤缺失者自体皮肤远不足以供应伤者所需。异体移植(如他人、尸体皮肤)不但数量少、价格昂贵，而且引入新的病毒而造成安全隐患。
组织工程被誉为“再生”之科学，随着其发展，人工皮肤的问世能部分解决上述问题。其价格虽然不足以匹敌真人皮肤，但其昂贵的价格使许多伤者无法负担而选择放弃治疗。造成人工皮肤成本较高的主要因素是人工皮肤培养周期长(4～6周)且需要气液界面(Air-LiquidInterface,ALI)复杂的培养模式。现今大多数公司采用悬挂式培养小室(Transwell)进行培养，这种培养方式需要大量操作员频繁更换培养液，且在更换过程中会因部分样品染菌导致实验失败。
发明内容
本发明的目的是为了解决常用的悬挂式培养小室需要大量操作员频繁更换培养液且在更换过程中部分样品会染菌的问题，提供了一种基于注射泵的闭合式连续灌注式生物反应器。
本发明用于人工皮肤组织培养的气液界面灌注式生物反应器包括上盖、下托盖、进气管、出气管、进液管、出液管、注气注射器、注液注射器和收集装置；
所述上盖的下表面有一个槽，槽的一端有一个通孔，槽的另一端有一个通孔；
所述的下托盖中间有一个盲孔，下托盖内部垂直于盲孔开有左侧通道和右侧通道，左侧通道的左端有一个通向上盖上表面的孔，右侧通道的右端有一个通向上盖上表面的孔；所述的盲孔的下半部设置有一个圆筒体，所述的圆筒体的侧壁均匀分布有多个通孔，圆筒体里面放置海绵，海绵上平面与左连通孔和右连通孔上平面及圆筒体的上开口水平；
所述的通孔与进气管连接、通孔与出气管连接、孔与进液管连接和孔与出液管连接；其中通孔通过进气管连接注气注射器，注气注射器通入CO2和空气；孔通过进液管连接注液注射器，注液注射器通入分化培养液；通孔通过出气管排出废气，孔通过出液管连接收集装置，收集装置收集废液；
所述上盖的下表面与下托盖的上表面之间为密封连接。
本发明相对于现有技术其优点在于：
1.本发明基于注射泵的闭合式连续灌注式生物反应器，实现了气液界面复杂的培养模式。相比于传统培养皿中的静态培养，一方面减少因频繁更换培养液带来的染菌风险，提高培养成功率；另一方面实现了模拟人体生理环境的灌注式培养，不仅为细胞提供了充足的营养，而且流体可冲走细胞有害代谢物，从而实现细胞高效培养。利用本发明制备的设备培养的人体皮肤细胞在1、4、7天的存活率分别可达84％～90％、90％～96％和90％～95％，而通常静态培养的在1、4、7天的存活率分别为73％～77％、70％～74％和77％～83％。相比之下本发明培养细胞的存活率较静态培养的总体提高了10％以上。细胞增殖方面也存在差异，本发明培养的人体皮肤细胞在1、4、7天细胞生长占总面积的20％～24％、72％～76％和94％～98％。在相同条件下比静态培养的分别提高了1％～2％、5％～10％和11％～15％。
2.利用本发明制备的设备培养的人体皮肤细胞在培养分化过程中较传统培养皿中静态培养的差别在于：本发明培养的细胞培养分化14、21、28及35天人工表皮厚度分别可达：22μm～26μm、40μm～46μm、48μm～52μm和56μm～60μm。相比之下本发明培养细胞的人工表皮厚度较静态培养的总体提高了2μm以上。14、21、28及35天人工表皮层数分别可达：2层～4层、4层～6层、6层～8层和7层～9层，较静态培养的总体提高了0.5层～1层。
3.本发明提供的制备气液界面灌注式生物反应器的方法，其换用不同的模具再与聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)薄板经螺栓固定就可以实现适用于不同孔道或者可以进行大规模细胞组织培养，可操作性强。
4.本发明使用的材料如：注射器、海绵等无毒且海绵吸水性好、不容易降解是放置种有皮肤细胞的水凝胶的最好方法，材料价格低更利于节约成本。
附图说明
图1为本发明气液界面灌注式生物反应器灌注系统的侧视截面图。
图2为本发明气液界面灌注式生物反应器灌注系统的局部放大图。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式的一种用于人工皮肤组织培养的气液界面灌注式生物反应器，其特征在于：该生物反应器包括上盖1、下托盖2、进气管4-2、出气管4-3、进液管4-1、出液管4-4、注气注射器10-1、注液注射器10-2和收集装置8；
所述上盖1的下表面有一个槽1-3，槽1-3的一端有一个通孔1-1，槽1-3的另一端有一个通孔1-2；
所述的下托盖2中间有一个盲孔3，下托盖2内部垂直于盲孔3开有左侧通道2-3和右侧通道2-4，左侧通道2-3的左端有一个通向上盖1上表面的孔2-1，右侧通道2-4的右端有一个通向上盖1上表面的孔2-2；所述的盲孔3的下半部设置有一个圆筒体5-1，所述的圆筒体5-1的侧壁均匀分布有多个通孔5-2，圆筒体5-1里面放置海绵5-3，海绵5-3上平面与左侧通道2-3和右侧通道2-4上平面及圆筒体5-1的上开口水平；
所述的通孔1-1与进气管4-2连接、通孔1-2与出气管4-3连接、孔2-1与进液管4-1连接和孔2-2与出液管4-4连接；其中通孔1-1通过进气管4-2连接注气注射器10-1，注气注射器10-1通入CO2和空气；孔2-1通过进液管4-1连接注液注射器10-2，注液注射器10-2通入分化培养液；通孔1-2通过出气管4-3排出废气，孔2-2通过出液管4-4连接收集装置8，收集装置8收集废液；
所述上盖1的下表面与下托盖2的上表面之间为密封连接。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是，进气管4-2与注气注射器10-1之间连接过滤器9-1；进液管4-1与注液注射器10-2之间连接过滤器9-2；出气管4-3连接过滤器9-3；出液管4-4与收集装置8之间连接过滤器9-4；进一步防止外界细菌进入系统中污染系统内环境。其他步骤与参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是，所述的通孔1-1、通孔1-2、孔2-1和孔2-2的直径均为0.4mm～0.6mm。其他步骤与参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是，所述的进气管4-2、出气管4-3、进液管4-1和出液管4-4均为聚四氟乙烯，其其外径为0.75mm，内径为0.03mm。其他步骤与参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同的是，所述CO2的体积分数占CO2和空气总体系的4％～6％。其他步骤与参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一不同的是，所述的盲孔3直径为5mm～7mm，高度为7mm～9mm，左侧通道2-3和右侧通道2-4截面宽×高为(0.75mm～1.25mm)×(1.0mm～1.5mm)。其他步骤与参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一不同的是，所述的圆筒体5-1是可拆卸的，其直径为5mm～7mm，高度为2mm～4mm，用于放置海绵。其他步骤与参数与具体实施方式七相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一不同的是，所述的上盖1的下表面与下托盖2的上表面之间是由密封装置6密封的。其他步骤与参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式八不同的是，所述的密封装置6是由两片聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)薄板6-1和4套螺栓6-2组成，其中上面的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)薄板6-1有四个圆形通孔7。其他步骤与参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式九不同的是，所述的两片聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)薄板6-1的厚度为3mm～4mm。其他步骤与参数与具体实施方式十一相同。
具体实施方式十一：本实施方式与具体实施方式九不同的是，所述的通孔7的直径为3mm～5mm。其他步骤与参数与具体实施方式十一相同。
用以下试验验证本发明：
实施例1：
使用本发明制备的气液界面灌注式生物反应器时将整个PDMS生物反应器浸入体积分数为70％的乙醇水溶液中灭菌1h；：再将整个装置置于无菌的细胞操作台内，打开紫外(UV)灯进行灭菌，灭菌时间为45min；然后用含有质量分数为1％的青霉素-链霉素(Penicillin-Streptomycin，P-S)的磷酸盐缓冲液(PhosphateBufferSolution，PBS)和培养基依次冲洗整个装置。三次灭菌后将海绵放置于灌注室内下方的圆柱形支架上，确保海绵上平面与下层通道上平面处于同一水平线，主要目的是用于支撑皮肤组织与水凝胶，将种有皮肤细胞的水凝胶放在海绵上；利用两片聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)薄板和4套螺栓将上层PDMS模型与键合好的中层PDMS模型和下层PDMS模型夹紧；用注射器向其中一个灌注入口通入分化培养液、另一个通入CO2的体积分数为5％的CO2和空气，两个出口利用软管连接过滤器，防止外界细菌进入系统中污染系统内环境，过滤器通过软管连接收集器。
为验证连续灌注组织培养的优势及水凝胶的毒性与粘附性，在生长期灌注培养1天以后取出灌注培养样品及静态培养样品用活-死细胞生存能力及毒性染色试剂进行染色分析，计算生长期细胞活性与生长率。
结果表明：利用本发明制备的设备培养的人体皮肤细胞的存活率为85％、细胞生长占总生长面积的22％，静态培养的存活率75％、细胞生长占总生长面积的20％；
经过分化期养殖14天后，用4％的多聚甲醛水溶液将各时期培养样品固定20min后，浸入15％的蔗糖(sucrose)水溶液常温浸泡4小时，接着浸入30％的蔗糖水溶液常温浸泡4小时。取出样品放入长×宽×高为10mm×10mm×5mm切片模具盒(CryomoldBiopsy)中，倒入浸泡切削液(OptimalCuttingTemperature，OCT)10分钟以后，将样品连同切片模具盒一起放入装有干冰和100％乙醇混合物上迅速冷却。带OCT完全凝固后，用冰冻切片机(LeicaCM3050)将皮肤组织切成5μm后的小片，用正电荷防脱载玻片吸附样品后，通过苏木精-伊红染色法染色，可测出传统静态模式培养与灌注模式培养下的皮肤生长情况。
结果表明：利用本发明制备的设备培养的人体皮肤细胞的人工表皮厚度为24μm、人工表皮层数为3层而静态培养的人工表皮厚度为22μm、人工表皮层数为2.5层。
实施例2：
使用本发明制备的气液界面灌注式生物反应器时将整个PDMS生物反应器浸入体积分数为70％的乙醇水溶液中灭菌1h；：再将整个装置置于无菌的细胞操作台内，打开紫外(UV)灯进行灭菌，灭菌时间为45min；然后用含有质量分数为1％的青霉素-链霉素(Penicillin-Streptomycin，P-S)的磷酸盐缓冲液(PhosphateBufferSolution，PBS)和培养基依次冲洗整个装置。三次灭菌后将海绵放置于灌注室内下方的圆柱形支架上，确保海绵上平面与下层通道上平面处于同一水平线，主要目的是用于支撑皮肤组织与水凝胶，将种有皮肤细胞的水凝胶放在海绵上；利用两片聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)薄板和4套螺栓将上层PDMS模型与键合好的中层PDMS模型和下层PDMS模型夹紧；用注射器向其中一个灌注入口通入分化培养液、另一个通入CO2的体积分数为5％的CO2和空气，两个出口利用软管连接过滤器，防止外界细菌进入系统中污染系统内环境，过滤器通过软管连接收集器。
将人体皮肤细胞在生长期灌注培养4天以后，取出灌注培养样品及静态培养样品用活-死细胞生存能力及毒性染色试剂进行染色分析，计算生长期细胞活性与生长率。
结果表明：利用本发明制备的设备培养的人体皮肤细胞的存活率为90％、细胞生长占总生长面积的74％，而静态培养的存活率76％、细胞生长占总生长面积的67％；
经过分化期养殖21天后，用4％的多聚甲醛水溶液将各时期培养样品固定20min后，浸入15％的蔗糖(sucrose)水溶液常温浸泡4小时，接着浸入30％的蔗糖水溶液常温浸泡4小时。取出样品放入长×宽×高为10mm×10mm×5mm切片模具盒(CryomoldBiopsy)中，倒入浸泡切削液(OptimalCuttingTemperature，OCT)10分钟以后，将样品连同切片模具盒一起放入装有干冰和100％乙醇混合物上迅速冷却。带OCT完全凝固后，用冰冻切片机(LeicaCM3050)将皮肤组织切成5μm后的小片，用正电荷防脱载玻片吸附样品后，通过苏木精-伊红染色法染色，可测出传统静态模式培养与灌注模式培养下的皮肤生长情况。
结果表明：利用本发明制备的设备培养的人体皮肤细胞的人工表皮厚度为42μm、人工表皮层数为5层而静态培养的人工表皮厚度为38μm、人工表皮层数为4.5层。
实施例3：
使用本发明制备的气液界面灌注式生物反应器时将整个PDMS生物反应器浸入体积分数为75％的乙醇水溶液中灭菌1.5h；：再将整个装置置于无菌的细胞操作台内，打开紫外(UV)灯进行灭菌，灭菌时间为50min；然后用含有质量分数为1.5％的青霉素-链霉素(Penicillin-Streptomycin，P-S)的磷酸盐缓冲液(PhosphateBufferSolution，PBS)和培养基依次冲洗整个装置。三次灭菌后将海绵放置于灌注室内下方的圆柱形支架上，确保海绵上平面与下层通道上平面处于同一水平线，主要目的是用于支撑皮肤组织与水凝胶，将种有皮肤细胞的水凝胶放在海绵上；利用两片聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)薄板和4套螺栓将上层PDMS模型与键合好的中层PDMS模型和下层PDMS模型夹紧；用注射器向其中一个灌注入口通入分化培养液、另一个通入CO2的体积分数为6％的CO2和空气，两个出口利用软管连接过滤器，防止外界细菌进入系统中污染系统内环境，过滤器通过软管连接收集器。
将人体皮肤细胞在生长期灌注培养7天以后，取出灌注培养样品及静态培养样品用活-死细胞生存能力及毒性染色试剂进行染色分析，计算生长期细胞活性与生长率。
结果表明：利用本发明制备的设备培养的人体皮肤细胞的存活率为91％、细胞生长占总生长面积的96％，而静态培养的存活率80％、细胞生长占总生长面积的67％；
经过分化期养殖28天后，用4％的多聚甲醛水溶液将各时期培养样品固定20min后，浸入15％的蔗糖(sucrose)水溶液常温浸泡4小时，接着浸入30％的蔗糖水溶液常温浸泡4小时。取出样品放入长×宽×高为10mm×10mm×5mm切片模具盒(CryomoldBiopsy)中，倒入浸泡切削液(OptimalCuttingTemperature，OCT)10分钟以后，将样品连同切片模具盒一起放入装有干冰和100％乙醇混合物上迅速冷却。带OCT完全凝固后，用冰冻切片机(LeicaCM3050)将皮肤组织切成5μm后的小片，用正电荷防脱载玻片吸附样品后，通过苏木精-伊红染色法染色，可测出传统静态模式培养与灌注模式培养下的皮肤生长情况。
结果表明：利用本发明制备的设备培养的人体皮肤细胞的人工表皮厚度为50μm、人工表皮层数为6层而静态培养的人工表皮厚度为45μm、人工表皮层数为5层。
实施例4：
使用本发明制备的气液界面灌注式生物反应器时将整个PDMS生物反应器浸入体积分数为75％的乙醇水溶液中灭菌1.5h；：再将整个装置置于无菌的细胞操作台内，打开紫外(UV)灯进行灭菌，灭菌时间为50min；然后用含有质量分数为1.5％的青霉素-链霉素(Penicillin-Streptomycin，P-S)的磷酸盐缓冲液(PhosphateBufferSolution，PBS)和培养基依次冲洗整个装置。三次灭菌后将海绵放置于灌注室内下方的圆柱形支架上，确保海绵上平面与下层通道上平面处于同一水平线，主要目的是用于支撑皮肤组织与水凝胶，将种有皮肤细胞的水凝胶放在海绵上；利用两片聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)薄板和4套螺栓将上层PDMS模型与键合好的中层PDMS模型和下层PDMS模型夹紧；用注射器向其中一个灌注入口通入分化培养液、另一个通入CO2的体积分数为6％的CO2和空气，两个出口利用软管连接过滤器，防止外界细菌进入系统中污染系统内环境，过滤器通过软管连接收集器。
将人体皮肤细胞在生长期灌注培养7天以后，取出灌注培养样品及静态培养样品用活-死细胞生存能力及毒性染色试剂进行染色分析，计算生长期细胞活性与生长率。
结果表明：利用本发明制备的设备培养的人体皮肤细胞的存活率为91％、细胞生长占总生长面积的96％，而静态培养的存活率80％、细胞生长占总生长面积的67％；
经过分化期养殖35天后，用4％的多聚甲醛水溶液将各时期培养样品固定20min后，浸入15％的蔗糖(sucrose)水溶液常温浸泡4小时，接着浸入30％的蔗糖水溶液常温浸泡4小时。取出样品放入长×宽×高为10mm×10mm×5mm切片模具盒(CryomoldBiopsy)中，倒入浸泡切削液(OptimalCuttingTemperature，OCT)10分钟以后，将样品连同切片模具盒一起放入装有干冰和100％乙醇混合物上迅速冷却。带OCT完全凝固后，用冰冻切片机(LeicaCM3050)将皮肤组织切成5μm后的小片，用正电荷防脱载玻片吸附样品后，通过苏木精-伊红染色法染色，可测出传统静态模式培养与灌注模式培养下的皮肤生长情况。
结果表明：利用本发明制备的设备培养的人体皮肤细胞的人工表皮厚度为58μm、人工表皮层数为7层而静态培养的人工表皮厚度为52μm、人工表皮层数为6层。
本发明使用的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)(8560K171，McMasterCarr公司，新泽西州，美国)经激光切割机切制而成。
本发明选用惰性的PTFE管，其外径为0.75mm，内径为0.03mm。
Claims (7)
1.一种用于人工皮肤组织培养的气液界面灌注式生物反应器，其特征在于：该生物反应器包括上盖(1)、下托盖(2)、进气管(4-2)、出气管(4-3)、进液管(4-1)、出液管(4-4)、注气注射器(10-1)、注液注射器(10-2)和收集装置(8)；
所述上盖(1)的下表面有一个槽(1-3)，槽(1-3)的一端有一个通孔(1-1)，槽(1-3)的另一端有一个通孔(1-2)；
所述的下托盖(2)中间有一个盲孔(3)，下托盖(2)内部垂直于盲孔(3)开有左侧通道(2-3)和右侧通道(2-4)，左侧通道(2-3)的左端有一个通向上盖(1)上表面的孔(2-1)，右侧通道(2-4)的右端有一个通向上盖(1)上表面的孔(2-2)；所述的盲孔(3)的下半部设置有一个圆筒体(5-1)，所述的圆筒体(5-1)的侧壁均匀分布有多个通孔(5-2)，圆筒体(5-1)里面放置海绵(5-3)，海绵(5-3)上平面与左侧通道(2-3)和右侧通道(2-4)上平面及圆筒体(5-1)的上开口水平；
所述的通孔(1-1)与进气管(4-2)连接、通孔(1-2)与出气管(4-3)连接、孔(2-1)与进液管(4-1)连接和孔(2-2)与出液管(4-4)连接；其中通孔(1-1)通过进气管(4-2)连接注气注射器(10-1)；孔(2-1)通过进液管(4-1)连接注液注射器(10-2)；通孔(1-2)通过出气管(4-3)排出废气，孔(2-2)通过出液管(4-4)连接收集装置(8)，收集装置(8)收集废液；
所述上盖(1)的下表面与下托盖(2)的上表面之间为密封连接。
2.根据权利要求1所述的用于人工皮肤组织培养的气液界面灌注式生物反应器，其特征在于：进气管(4-2)与注气注射器(10-1)之间连接过滤器(9-1)；进液管(4-1)与注液注射器(10-2)之间连接过滤器(9-2)；出气管(4-3)连接过滤器(9-3)；出液管(4-4)与收集装置(8)之间连接过滤器(9-4)。
3.根据权利要求1或2所述的用于人工皮肤组织培养的气液界面灌注式生物反应器，其特征在于：所述的通孔(1-1)、通孔(1-2)、孔(2-1)和孔(2-2)的直径均为0.4mm～0.6mm。
4.根据权利要求1或2所述的用于人工皮肤组织培养的气液界面灌注式生物反应器，其特征在于：所述的进气管(4-2)、出气管(4-3)、进液管(4-1)和出液管(4-4)均为聚四氟乙烯，其其外径为0.75mm，内径为0.03mm。
5.根据权利要求1或2所述的用于人工皮肤组织培养的气液界面灌注式生物反应器，其特征在于：所述的盲孔(3)直径为5mm～7mm，高度为7mm～9mm，左侧通道(2-3)和右侧通道(2-4)截面宽×高为(0.75mm～1.25mm)×(1.0mm～1.5mm)。
6.根据权利要求1或2所述的用于人工皮肤组织培养的气液界面灌注式生物反应器，其特征在于：所述的圆筒体(5-1)是可拆卸的，其直径为5mm～7mm，高度为2mm～4mm。
7.根据权利要求1或2所述的用于人工皮肤组织培养的气液界面灌注式生物反应器，其特征在于：所述上盖(1)的下表面和下托盖(2)的上表面是由密封装置(6)密封的；所述的密封装置(6)是由两片聚甲基丙烯酸甲酯薄板(6-1)和4套螺栓(6-2)组成；所述的两片聚甲基丙烯酸甲酯薄板(6-1)的厚度为3mm～4mm，其中上面的聚甲基丙烯酸甲酯薄板(6-1)有四个圆形通孔(7)，其中通孔(7)的直径为3mm～5mm。
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
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Granted publication date: 20160224 Termination date: 20181020 |