CN204086278U - 用于检测外周血循环肿瘤细胞的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本实用新型公开了一种用于检测外周血循环肿瘤细胞的试剂盒，包括盒体(1)、盒盖(3)和设置在盒体(1)内的衬垫(2)，所述衬垫(2)上设有小孔，装有hCTC缓冲液的试剂管(4)、装有hCTC非血源性细胞分离介质的试剂管(5)、装有免疫磁珠的试剂管(6)、装有固定液的试剂管(7)，装有消化酶的试剂管(8)、装有FISH消化酶稀释液的试剂管(9)、装有FISH磷酸缓冲液的试剂管(10)，装有CEP-8探针的试剂管(11)，装有抗体洗涤液的试剂管(12)、装有抗体配制液的试剂管(13)、装有抗人角蛋白18单克隆抗体CK18的试剂管(14)、装有抗人CD45的试剂管(15)、装有DAPI荧光保存液的试剂管(16)被设置在所述小孔内。本实用新型结构简单、设计合理，检测步骤简便，检测速度快，便于在临床推广应用。

Description

用于检测外周血循环肿瘤细胞的试剂盒

技术领域

本发明属于分子细胞生物学领域，涉及一种用于检测外周血循环肿瘤细胞的试剂盒。

背景技术

利用现代免疫和分子技术，恶性肿瘤患者外周血中的肿瘤细胞根据其细胞学特征可以被检测出来。能够方便的检测和定位这样的细胞将会对恶性肿瘤早期诊断，化疗调整，早期复发的预防和靶向治疗产生深远的影响。当1889年StevenPaget发表了关于“种子和土壤”的学说后，血液播散细胞的想法应运而生。一个多世纪以后，随着分子技术的成熟，新的临床发现解释了曾经不能解释的现象，比如远处器官出现另外和原位瘤同样病理特征的肿瘤，对于上皮细胞起源的实体瘤，许多病人的外周血中都可以检测到循环肿瘤细胞。循环肿瘤细胞不仅存在于已经发生肿瘤远处转移的患者，同样也存在于那些肿瘤尚局限的患者。特别值得注意的是，这种方法在恶性肿瘤化疗调整的风险评估和利用循环肿瘤细胞的分子学特征研究新的靶向治疗具有很重要的意义。

研究目前所存在的检测技术大多是在大剂量化治疗前，抽取骨髓或提取单个核细胞来检测微小转移是否发生。抽取骨髓耗时较长，而且对患者而言有一定的痛苦，事实上，现在临床对于乳腺癌的治疗已经很少用到大剂量的化疗了。因此，现阶段很多研究都比较关注外周血循环肿瘤细胞的检测，不过检测的基本原理几乎还是相同的。用于检测循环肿瘤细胞的方法大体上可以分为两类，一类是细胞计数分析，一类是核酸检测。细胞计数法是根据免疫细胞化学技术来鉴定和确定个体肿瘤细胞的特征。核酸检测技术是通过检测肿瘤细胞和正常人细胞中不同个体肿瘤细胞的特征。核酸检测技术是通过检测肿瘤细胞和正常人细胞中不同表达的DNA或RNA序列来实现的。

细胞计数法为通过提取和计数个体细胞来实现。该方法的一个优势在于可以通过其表达的关键的生物标志，如人上皮生长因子受体-2(HER2)和上皮生长因子受体(EGFR)，进一步分析细胞分子水平的生物学特征。尽管如此，即便是在已经发生转移的肿瘤患者外周血中也只能检测到很少数量的上皮细胞(小于10个细胞/ml)，所以在这些细胞从血液成分中分离出来前需要进行富集。

许多研究者已经通过免疫磁珠的方法来进行细胞富集。通常市面上可以买到的试剂盒或常规方法包括磁性吸引细胞分选系统(MACS系统)、磁珠、以及铁磁流体系统。MACS系统和磁珠系统都通过抗体连接到顺磁体磁珠上，通过不同的磁性吸引来分选特定的细胞。磁珠可以连接到阳性选择的抗上皮细胞抗体上(如HEA125，cytokeratin7/8,BerEP4)或者直接连接到单克隆抗体CD45，来选定阴性表达的白细胞。从发生转移的乳腺癌患者外周血中分离得到的cytokeratin阳性细胞。通过免疫磁性法富集分离血细胞，染上抗cytokeratin8/18,生物素，异硫酸氢盐荧光素(绿色荧光)。细胞核用碘化丙啶染色(红色荧光)。其他的富集方法包括密度梯度离心和滤器滤过方法。滤器滤过是根据白细胞直径大小，允许较小的白细胞通过，而较大的肿瘤细胞留在了滤器内。

尽管对细胞进行富集，但上皮细胞仍然大大小于残留的白细胞的数量，因此，我们需要更进一步的检测到这些上皮细胞。免疫化学方法是建立在利用单克隆抗体抗各种上皮细胞抗原的基础上。利用免疫化学技术来扫描大量的细胞是相当耗时的；自动化成像分析系统或者半自动分选技术如流式或激光扫描细胞计数是比较适合的。本方法采用单一的肿瘤相关抗原的检测，特异性和灵敏性稍低。

采用核酸检测技术，即在肿瘤患者的血液中可以检测到与肿瘤相相关的关的DNA/mRNA，然后可以用采用PCR/RT-PCR的方法检测,方法学涉及到几个步骤，具体步骤为，首先采用密度梯度离心法从外周血中提取单个核细胞，或采用免疫磁性分离技术从外周血中富集上皮细胞，然后采用标准方法提取细胞中的核酸，最后通过特异性引物PCR扩增。该方法缺乏细胞形态的支持，特异性低。

实用新型内容

为了解决上述技术问题，本实用新型的目的在于提供一种用于检测外周血循环肿瘤细胞的试剂盒，可以快速、简便、准确地检测外周血循环肿瘤细胞。

为实现上述目的，本实用新型采取的技术方案是：一种用于检测外周血循环肿瘤细胞的试剂盒，其特征在于：包括盒体(1)、盒盖(3)和设置在盒体(1)内的衬垫(2)，所述衬垫(2)上设有小孔，装有hCTC缓冲液的试剂管(4)、装有hCTC非血源性细胞分离介质的试剂管(5)、装有免疫磁珠的试剂管(6)、装有固定液的试剂管(7)，装有消化酶的试剂管(8)、装有FISH消化酶稀释液的试剂管(9)、装有FISH磷酸缓冲液的试剂管(10)，装有CEP-8探针的试剂管(11)，装有抗体洗涤液的试剂管(12)、装有抗体配制液的试剂管(13)、装有抗人角蛋白18单克隆抗体CK18的试剂管(14)、装有抗人CD45的试剂管(15)、装有DAPI荧光保存液的试剂管(16)被设置在所述小孔内。

根据本实用新型的实施例，所述衬垫(2)上设有13个小孔，所述小孔在所述衬垫(2)上分成3排平行排列。

通过以上技术方案，本实用新型的有益效果如下：

采用本实用新型中传统细胞染色与免疫荧光技术和荧光原位杂交技术组合检测，提高了外周血循环肿瘤细胞检测的特异性和灵敏性。

附图说明

图1为本实用新型的结构示意图；

图中，1-盒体，3盒盖，2衬垫，4-装有hCTC缓冲液的试剂管，5-装有hCTC非血源性细胞分离介质的试剂管，6-装有免疫磁珠的试剂管，7-装有固定液的试剂管，8-装有消化酶的试剂管，9-装有FISH消化酶稀释液的试剂管，10-装有FISH磷酸缓冲液的试剂管，11-装有CEP-8探针的试剂管，12-装有抗体洗涤液的试剂管，13-装有抗体配制液的试剂管，14-装有抗人角蛋白18单克隆抗体CK18的试剂管，15-装有抗人CD45的试剂管，16-装有DAPI荧光保存液的试剂管。

具体实施方式

下面结合实施例对本实用新型的具体实施方式作进一步描述，本实用新型的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本实用新型的范围构成任何限制。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

如图1所示，本实用新型提供了一种用于检测外周血循环肿瘤细胞的试剂盒，其特征在于：包括盒体(1)、盒盖(3)和设置在盒体(1)内的衬垫(2)，所述衬垫(2)上设有小孔，装有hCTC缓冲液的试剂管(4)、装有hCTC非血源性细胞分离介质的试剂管(5)、装有免疫磁珠的试剂管(6)、装有固定液的试剂管(7)，装有消化酶的试剂管(8)、装有FISH消化酶稀释液的试剂管(9)、装有FISH磷酸缓冲液的试剂管(10)，装有CEP-8探针的试剂管(11)，装有抗体洗涤液的试剂管(12)、装有抗体配制液的试剂管(13)、装有抗人角蛋白18单克隆抗体CK18的试剂管(14)、装有抗人CD45的试剂管(15)、装有DAPI荧光保存液的试剂管(16)被设置在所述小孔内。

其中，所述衬垫(2)上设有13个小孔，所述小孔在所述衬垫(2)上分成3排平行排列。

检测步骤如下：

1.首先采集病人外周血7.5ml室温避光保存不超过24小时。

2.将采血管配平，头尾颠倒混匀后，室温下以800xg的转速离心7分钟，将棕红色沉淀上方5毫米处以上的上清液弃掉，然后头尾颠倒混匀沉淀细胞并倒入50ml离心管A中。每次采用2ml的1×hCTC缓冲液洗涤采血管2次。洗涤时，盖上黄色管帽，头尾颠倒混匀后将每次洗涤液沿管壁倒入离心管A中，混匀，共约9ml。

3.将3ml非血源性细胞分离介质加入50ml离心管B中，使用电动移液器将离心管A中的血细胞沿离心管B管壁液面处缓慢加到分离介质顶层，不能将血细胞加入到分离介质中。叠加后可见清晰的分界面，少量红细胞慢慢沉降至管底。使用1ml1×hCTC缓冲液洗涤离心管A，并将洗涤液转移至离心管B的溶液顶层，然后在室温下以450xg转速离心7分钟。

4.离心后可见三层液体，上层为黄色液体，中间层为透明液体，底层为棕红色沉积红细胞。将B管中底层沉积红细胞上的所有液体转移至50ml离心管C中(使用1ml加样器先从上层和中间层的液面交界处吸取液体，上清剩2ml时从液面处吸取上清，切勿吸取到底层红细胞)，竖直摇匀液体。

5.按每管150μl的比例添加免疫磁珠，将洗涤后的免疫磁珠缓慢加入离心管C中，边加边摇动离心管，然后将离心管C以35-40°角倾斜固定于摇床上，在室温以125rpm摇动10分钟。

6.将3ml非血源性细胞分离介质加入50ml离心管D中，将管C中的磁珠混悬液沿离心管D管壁液面处缓慢加到分离介质顶层，不能将磁珠混悬液加入到分离介质中。配平后，室温以450xg离心7分钟。

7.将离心管D中底层沉积磁珠上的液体转移至50ml离心管E中，保留磁珠上方100μl溶液，勿吸取到底层磁珠。于离心管E管中加入1×hCTC缓冲液至45ml，配平，颠倒混匀，室温下以700xg离心3分钟，弃上清液至1ml，加入0.5ml1×hCTC缓冲液，使用1ml加样器轻柔吹打混匀沉淀，避免气泡产生，然后转移至2ml离心管中。

8.将上述2ml离心管置于磁力架上3分钟以彻底吸附磁珠。第2分钟后使用上述保存的1ml枪头沿磁珠对侧管壁轻轻吹打液体1-2次，并旋转离心管15°，1分钟后将置于磁力架上的管内液体小心转移至50ml离心管F中。

9.于离心管F中加入1×hCTC缓冲液至45ml，将上述加样器枪头于液面处洗涤吹打三下，配平，颠倒混匀，室温下以650xg离心3分钟。弃上清至1ml，将离心管竖直沿顺时针方向轻柔快速晃动以混匀沉淀细胞。于离心管F中加入1×hCTC缓冲液至35ml，配平，颠倒混匀，室温下以650xg离心3分钟，弃上清至100μl。

10.取适量常规细胞固定液(100μl固定液/玻片/人份)于1.5ml离心管中，立即盖上管盖。

11.将100μl细胞液轻轻吹打混匀(保留加样器枪头)后加入100μl固定液，并使用加样器枪头轻柔吹打混匀。将每管标本液体分别涂于载玻片标本框内(1人份/玻片)。

12.标本干燥与保存：将标本30℃干燥箱放置16小时(全程不开鼓风，打开顶置通风口)，第二天关闭干燥箱温度后将标本继续静置于干燥箱中30分钟冷却至室温，立即进行后续检测。

细胞学传统染色

可以是HE染色，也可以是巴-氏染色，按照标准流程操作。

FISH检测

13.配制混合液：取消化酶溶液管，按每张玻片计算取液：5μl消化酶+240μl消化酶稀释液，于振荡器上充分振荡混匀。混合液配制好后立即置于标本上(等待时间不超过1分钟)，沿载玻片标本框内侧一角轻柔滴加全部240μl混合液覆盖标本框，不要将液体滴于标本框外，如液体不能覆盖整个标本框，使用枪头平推液体，但枪头不要触碰玻片上的细胞，室温避光静置10分钟。

14.将载玻片微斜，使用真空泵吸头沿标本框外围吸弃混合液。沿标本框内侧一角轻柔滴加200μl室温预热的1×FISH磷酸缓冲液后，立即吸弃溶液，共重复2次。沿标本框内侧一角轻柔滴加200μl于室温预热的1×FISH磷酸缓冲液，室温静置2分钟，吸弃溶液。

15.将玻片插入已预热至37℃的染色缸Ⅰ中静置15分钟，之后取出玻片，竖立在滤纸上，轻轻磕动，以快速吸取玻片残留液，但勿使玻片干燥。

16.将玻片依次在缸Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ中静置1分钟。缸Ⅱ及缸Ⅲ换缸时，取出玻片，竖立在滤纸上，轻轻磕动，快速吸干玻片残留液至无液体流下即可，但勿使玻片干燥。将玻片从缸Ⅳ中取出后，竖立在滤纸上完全吸干玻片流下残留液，并使用微型吹风机将玻片轻柔吹至完全干燥。

17.在避光条件下操作，于4℃的环境中取出分装好的CEP8探针液，于标本框中央滴加10μl肿瘤相关探针液后，探针液不能起泡，立即使用镊子将盖玻片平放在探针液上，使液体向四周蔓延至整个标本框，探针液仍然不能起泡。如果需要，可轻按盖玻片以使探针液覆盖整个标本框。

18.封片：剪去1ml加样器尖头，每张玻片使用350μl封片胶(RubberCement)封住盖玻片四边边缘，将其直接放入杂交仪，无需等待封片胶干燥。

19.杂交：在78℃变性7分钟；在37℃杂交1.5小时。

配制抗体：于杂交结束前10分钟进行抗体配制。从冰箱取出抗体保存管于1.5ml离心管台式离心机中高速离心5秒钟。4℃条件下吸取CK18、CD45抗体，按每张玻片计算，人血液标本：200μl抗体配制液+1μl抗CD45抗体+1μl抗CK18抗体；使用加样器轻柔吹打10次以充分混匀抗体，抗体不能起泡。将配制后的抗体混合液置于冰箱4℃避光保存。抗体母液管放回4℃避光保存。

20.杂交完毕，取出玻片。用手轻按盖玻片一角，使用镊子撕去RubberCement(切勿掀动盖玻片！)，将玻片置于已冷却至室温的缸Ⅰ中，静置1分钟后轻柔晃动缸Ⅰ，直至盖玻片脱落，若盖玻片不易脱落，使用镊子轻推至盖玻片松动，继续晃动缸Ⅰ。盖玻片脱落后，将盖玻片继续在缸Ⅰ中室温静置1分钟后取出，使用滤纸吸干玻片流下的残留液，并擦干标本框外围液体。

21.沿标本框内侧一角轻柔滴加200μl1×FISH磷酸缓冲液溶液后，静置1分钟，吸弃FISH磷酸缓冲液，共重复2次。

抗体染色：

22.沿载玻片标本框内侧一角轻柔滴加200μl抗体洗涤液后，将载玻片微斜，使用真空泵吸头沿标本框外围吸弃抗体洗涤液共重复2次。沿载玻片标本框内侧一角轻柔滴加200μl抗体洗涤液，室温静置2分钟，吸弃。

23.将玻片置于湿盒中，沿标本框内侧一角轻柔滴加200μl配制好的CK18、CD45抗体混合液，室温避光孵育2小时，勿使玻片干燥。

24.吸弃抗体混合液后，沿标本框内侧一角轻柔滴加200μl抗体洗涤液，立即吸弃，共重复2次。沿玻片标本框内侧一角轻柔滴加200μl抗体洗涤液，室温静置2分钟，吸弃抗体洗涤液。

25.高速离心DAPI荧光保存液管5秒钟。取5μl荧光保存液滴加于标本框中央，置放盖玻片后，一手用镊子轻按盖玻片中央防止其滑动，另一手用真空泵吸头从盖玻片中央向四周轻轻滑动挤压并吸干溢出的多余液体。

26.立即在荧光显微镜下观察或于4℃下避光保存。为避免FISH信号及抗体染色荧光减弱，标本应在一周内完成检测。在荧光显微镜上反复观察标本会使荧光淬灭，需要在第一次读片时储存细胞图片。

上面已经举例说明了本实用新型的实施例，本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本实用新型的精神和范围下可以对本实用新型技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本实用新型的保护范围内。

Claims (2)

1.一种用于检测外周血循环肿瘤细胞的试剂盒，其特征在于：包括盒体(1)、盒盖(3)和设置在盒体(1)内的衬垫(2)，所述衬垫(2)上设有小孔，装有hCTC缓冲液的试剂管(4)、装有hCTC非血源性细胞分离介质的试剂管(5)、装有免疫磁珠的试剂管(6)、装有固定液的试剂管(7)，装有消化酶的试剂管(8)、装有FISH消化酶稀释液的试剂管(9)、装有FISH磷酸缓冲液的试剂管(10)、装有CEP-8探针的试剂管(11)，装有抗体洗涤液的试剂管(12)、装有抗体配制液的试剂管(13)、装有抗人角蛋白18单克隆抗体CK18的试剂管(14)、装有抗人CD45的试剂管(15)、装有DAPI荧光保存液的试剂管(16)被设置在所述小孔内。

2.按照权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述衬垫(2)上设有13个小孔，所述小孔在所述衬垫(2)上分成3排平行排列。