CN1997665A - 新型的氨基甲酰化epo及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了制备新型的氨基甲酰化促红细胞生成素的方法，和包含该新型的氨基甲酰化促红细胞生成素的组合物和包含它的药物组合物及其用途。

Description

新型的氨基甲酰化EPO及其制备方法

引言

本发明涉及一种新型的化合物，以及制备所述化合物的方法。该新型的化合物，氨基甲酰化促红细胞生成素(CEPO)，其特征是，在赖氨酸的全部或大部分伯胺上以及在分子的N-末端氨基酸上被氨基甲酰化，此外，在该化合物分子其它氨基酸的伯胺具有低水平的氨基甲酰化。此外，该新型的化合物无聚集蛋白质和聚合物，而且适合于在疾病治疗的药物组合物中应用，例如中枢和周围神经系统，及其它表达重要的EPO受体的组织。本制备方法的另一个异常惊人的优点是，该方法提供了一种产品，与从其它已知的述及促红细胞生成素氨基甲酰化方法获得的产品相比，其含有较少的聚集蛋白质和较少的聚合物。

发明背景

氨基甲酰化EPO的生物造血活性的减弱已揭示于Satake，R.等.(1990)Biochimica et Biophysica Acta；1038：125-129，以及Mun，K-C.和Golper，TA.(2000)Blood Purif.；18：13-17。Brines等2003，美国专利申请20030072737揭示造血活性的丧失并不干扰EPO的组织保护性能。

作为在蛋白质纯化中使用尿素的副反应和作为高尿素血清水平的结果，蛋白质的氨基甲酰化是广为人知的。这是由于尿素自然分解为氰酸盐而引起的。氰酸盐是造成蛋白质伯胺的氨基甲酰化的原因，从而蛋白质的N-末端和赖氨酸易受氨基甲酰化的影响(图1)。此外，易受氨基甲酰化影响的其它潜在的氨基酸残基为精氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、门冬氨酸、谷氨酸和组氨酸，然而反应是pH依赖型的，并且不像N末端和赖氨酸残基那样容易地发生。

对揭示蛋白质的氨基甲酰化是否能够改善或损伤蛋白质的生物活性的研究，其已由Hrkk，S.等(1992)Kidney International；41：1175-1181，Plapp，B.V.等(1971)Jour.Bio1.Chem.；246(4)：939-945，Satake，R.等(1990)Biochimica et Biophysica Acta；1038：125-129以及Mun，K-C.和Golper，T.A.(2000)Blood Purif.；18：13-17进行。通过使用KCNO作为氰酸盐的来源，他们研究了蛋白质氨基甲酰化的生物学作用。他们都发现，由于氨基甲酰化增加而使生物学活性降低或改变。氨基甲酰化的程度的评价是根据两个分析方法：

1、使用三硝基苯磺酸(TNBS)分析法测定游离氨基的降低，和

2、氨基酸分析法测定赖氨酸转化成高瓜氨酸残基。

Hrkk，S.等(1992)以2M KCNO于37℃下最大6小时氨基甲酰化低密度脂蛋白，但是，以TNBS测定法测定，没有获得完全氨基甲酰化的蛋白质。

Plapp，B.V.等(1971)研究了时间的影响，并且以1M KCNO于37℃下处理24小时后，获得几乎完全氨甲酰基化的牛胰脱氧核糖核酸酶A。

Mun，K-C.和Golper，T.A.(2000)使用2M KCNO以最大6小时的反应时间研究了时间的影响。他们还研究了于37℃下6小时全部反应中增加KCNO浓度的影响。根据该试验设计，Mun，K-C.和Golper，T.A.(2000)未能验证氨基甲酰化的确切程度(请参考16页33-35行)。

在本发明中，我们现已发现，EPO的氨基甲酰化产生聚合物和聚集物，从而使它不适合于生物制药。此外，我们发现这些聚合物和聚集物的产生依赖于氨基甲酰化的方法条件。因此，需要开发具有涉及pH、时间、氰酸盐浓度、温度、蛋白质浓度和最重要的蛋白质聚合程度的最佳参数的方法。本发明包括氨基甲酰化的最佳方法，生成具有低度聚合和聚集的产品，此外，令人惊讶地，我们发现获得了针对N-末端和全部赖氨酸残基(后者发生于特定的pH范围)的完全氨基甲酰化的EPO。进行了本发明方法的随后步骤，目的在于除去所生成的聚集物和聚合物。所得的氨基甲酰化纯EPO是一种新型的化合物，并连同包括该化合物的药物组合物一起被要求于本申请中。

前已说明，氨基甲酰化程度依赖于氰酸盐浓度和时间。然而，并未描述如何获得生物制药生产的能规模化的氨基甲酰化的方法。

未达最佳标准的产品的聚集物的存在伴随抗体的诱导作用。并且因此聚集物的存在造成生物制药产品不适合用于人。

在本发明中描述的氨基甲酰化和纯化方法引导出一种蛋白质，其特征在于完全氨基甲酰化的，具有尽可能最低生成量的聚合物或聚集物，和最小损失量的终产物。从而使之成为经济可行的步骤。

对氨基甲酰化蛋白质的进一步处理提供了一种对生物制药有用的产品，其仅具有由于聚集物和聚合物对蛋白质产生免疫应答的最低风险。

完全氨基甲酰化评价的分析方法是除氨基酸分析以外的；TNBS对游离伯胺基团和产品的最终特征，以及通过MALDI-TOF消化的产品。

本发明的新型化合物，其为在分子的N-末端和赖氨酸的游离基团完全氨基甲酰化的促红细胞生成素，并且进一步的，其未聚集和未聚合至高于2.5％的量，以及含有最小量的过-或次-氨基甲酰化促红细胞生成素，可用于制备药物组合物，以治疗对天然促红细胞生成素的神经保护作用响应的疾病。

发明概述

本发明涉及一种用于生物制药生产的可规模化的蛋白质氨基甲酰化过程。而且，其涉及该方法的产品，和包含该化合物的药物组合物，以及该组合物的用途。

本申请中描述的氨基甲酰化和纯化方法产生一种蛋白质，其特征在于完全氨基甲酰化的，具有尽可能最低地形成聚合物或聚集物，和最小量的终产物的损失。

该氨基甲酰化方法优选地产生具有最低量的聚合物和聚集物的氨基甲酰化蛋白质，使之成为一种经济可行的方法。该终产物还包含有限量的过-和/或次-氨基甲酰化促红细胞生成素的异型(每分子少于或多于9个氨基甲酰化)。次-氨基甲酰化EPO含有少于9个氨甲酰基残基，即，不是全部的8个赖氨酸和N-末端被氨基甲酰化。次-氨基甲酰化EPO可以具有少量的5个氨甲酰基残基，并且仍然不具有经典的促红细胞生成素活性，使之适用于在本发明中使用。过-氨基甲酰化EPO具有多于9个氨甲酰基残基，并且在除8个赖氨酸和N-末端以外的氨基酸上氨基甲酰化。CEPO可以具有15个之多的氨甲酰基残基，并且仍然具有期望的效果，即，无经典的促红细胞生成素活性。至少约90％，并且极有可能为95％的CEPO异型在8个赖氨酸残基和唯一的N-末端被氨基甲酰化。

氨基甲酰化蛋白质的进一步处理，除去聚集的和聚合的产物，至最高3％或2.5％的水平，使产品仅有最小限度的由于聚集物和聚合物对蛋白质的免疫应答的风险发生，从而可作为生物制药使用。

对氨基甲酰化评价的分析方法是除氨基酸分析以外的；TNBS对游离伯胺基团和产品的特征，以及通过MALDI-TOF和LC-MS/MS消化的产品。

发明详述

制备方法

蛋白质氨基甲酰化的方法由6步组成：

1.超滤浓缩

2.氨基甲酰化修饰

3.凝胶过滤脱盐

4.阴离子交换纯化

5.通过超-和透析过滤的浓缩和缓冲液交换

6.0.22μm过滤

本氨基甲酰化方法的起始材料较好的是纯化的人EPO，但可以是任意的动物或人种的EPO型，非限制性实例是合成的、重组人EPO或者生物学或化学修饰的人EPO，例如缺乏唾液酸基的EPO，人EPO的突变体，即，被引入氨基酸序列变化的分子，EPO碎片，EPO的肽，其它蛋白质，或假如有多个蛋白质需要氨基甲酰化时的蛋白质的混合物。

该方法的第一步包括通过超滤调节蛋白质浓度，其中蛋白质浓度是以保持低处理容积为目的的调节。0.05-10mg/ml或0.05-8mg/ml的蛋白质浓度是优选的实施方案。更优选的实施方案为0.05-7mg/ml，并且最优选的为2-5mg/ml。如果浓度增加则聚集物的形成增加。超滤优选的通过BioMax(Millipore)以5kDa的MWCO的方式。其它滤器也可以使用。此外，蛋白质的溶解度可以通过加入稳定剂调节。

在完成浓缩步骤后，该蛋白质溶液与K-硼酸盐四水合物、K-氰酸盐以pH7-11或pH7-10混合。在优选的实施方案中，pH为8-10，并且最优选为9.0。温度范围为0°-60℃或0°-50℃或0°-40℃或0°-＜37℃，但一个优选的实施方案为30-34℃的温度区间，优选为32℃，时间窗为10分钟-30天或30分钟-30天或1小时-30天或1小时-20天或1小时-10天或1小时-5天或1小时-2天或1小时-26小时或18-26小时或优选的22小时-26小时，最优选的24小时。然而，如果其它方法参数即温度、氰酸盐浓度和蛋白质浓度改变，这些优选的区间也可以改变。

如果温度低于该限度，产率将降低，因为氨基甲酰化将放慢并且效率低。如果温度限度超出，由于聚集增加而使产率降低。另一个决定性的参数是时间，如果时间减少氨基甲酰化将不完全，或如果时间增加就可观测到形成聚集物，从而得到较低的产率。

因此，提出了一种具有相关参数的方法，即，如果温度降低，减少的氨基甲酰化反应可以通过增加氰酸盐浓度和/或反应时间而补偿。此外，如果反应时间减少，减少的氨基甲酰化反应可以通过增加温度和/或氰酸盐浓度而补偿。最后，在减少氰酸盐浓度的方法中，减少的氨基甲酰化反应可以通过增加反应时间和/或温度而补偿。

因此，总之，为了获得具有生成较低聚集物和聚合物的完全氨基甲酰化的分子，一个重要参数(时间、温度、氰酸盐浓度和蛋白质浓度)的明显改变将意味着一个或多个其它重要参数改变。

在质子摄取和缓冲能力不足导致溶液的pH值漂移之下，由于氰酸盐固有的水解和聚合，硼酸盐缓冲液的浓度可以是0.05-2M，但在优选的实施方案中为0.1-1M，并且最优选0.5M。

此外氰酸盐浓度优选范围为0.05-10M或0.05-8M或0.05-6M或0.05-4M或0.05-2M，优选的实施方案为0.05-1M并且最优选0.5M。

0.5M硼酸盐缓冲液溶液的浓度是需要的，以控制由使用0.5M氰酸盐浓度的质子摄取引起的pH值漂移。可以使用应用其它氰酸盐和硼酸盐的方法。另外，可以使用除硼酸盐外的其它反应缓冲液，例如，碳酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液。

蛋白质和氰酸盐的反应混合物的脱盐通过色谱凝胶过滤的方式进行。使用G-25 Fine(Amersham Biosciences)基质。控制给柱上样之前的死时间(hold up time)并且不应超过2小时，因为这将引起进一步的氨基甲酰化和聚合物形成。蛋白质的脱盐和更换缓冲液可通过透析、透析-超滤或通过色谱凝胶过滤的方式进行。可以使用其它凝胶过滤基质例如交联多糖或交联混合多糖、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯的基质或者天然陶瓷的基质。此外，在该步骤中柱高是可以改变的。

可以调节氨基甲酰化步骤，以获得具有小于40％聚集物和聚合物的产品，或小于30％或小于25％或小于20％或小于15％或小于12.5％或小于10％或小于8％或小于7％。

聚集物和聚合物的去除是通过使用阴离子交换的纯化步骤进行的。观测到可以从起始材料的残余物中或从聚集物/聚合物中分离氨基甲酰化EPO。流动缓冲液(running buffer)A为：0.3％Tris(25mM)，0.3％(50mM)NaCl，pH8.5±0.2，洗脱缓冲液B：0.3％Tris(25mM)，5.8％(1M)NaCl，pH8.5±0.2。梯度以0-30％进行，超过20柱体积产生理想的分离。纯化步骤可产生小于3％聚集物和聚合物的产品，或小于2.5％或小于2％或小于1.5％或小于1％或小于约0.5％。

洗脱，收集以及氨基甲酰化EPO峰的混合集中影响被洗脱的蛋白质的不均匀性即异型的分布。换言之，过-和次-氨基甲酰化CEPO的量将会依赖于收集和混合集中的过程而改变。狭窄的集中混合会导致过-和/或次-氨基甲酰化促红细胞生成素的含量降低。增加梯度的长度，通过除去某些物质将会选择出更确切的产物。

以ESI-质谱法测定，具有小于约40％重量的过-和次-氨基甲酰化异型的氨基甲酰化EPO的混合物是本发明的一个实施方案。更优选的实施方案是，以ESI-质谱法测定，具有小于约35％重量的过-和次-氨基甲酰化异型的CEPO。甚至更优选的实施方案是，以ESI-质谱法测定，具有小于约30％重量的过-和次-氨基甲酰化异型的CEPO。甚至更优选的实施方案是，以ESI-质谱法测定，具有小于约25％重量的过-和次-氨基甲酰化异型的CEPO。甚至更优选的实施方案是，以ESI-质谱法测定，具有小于约20％重量的过-和次-氨基甲酰化异型的CEPO。甚至更优选的实施方案是，以ESI-质谱法测定，具有小于约15％重量的过-和次-氨基甲酰化异型的CEPO。甚至更优选的实施方案是，以ESI-质谱法测定，具有小于约10％重量的过-和次-氨基甲酰化异型的CEPO。甚至更优选的实施方案是，以ESI-质谱法测定，具有小于约5％重量的过-和次-氨基甲酰化异型的CEPO。甚至更优选的实施方案是，以ESI-质谱法测定，具有小于约2％重量的过-和次-氨基甲酰化异型的CEPO。最优选的实施方案是，以ESI-质谱法测定，具有小于约1％重量的过-和次-氨基甲酰化异型的CEPO。

除了影响全部异型的含量，EPO氨基甲酰化峰的收集和混合集中还影响过-氨基甲酰化CEPO的分布。优选的以ESI-质谱法测定，过-氨基甲酰化CEPO异形的量小于约35％重量。甚至更优选的以ESI-质谱法测定，过-氨基甲酰化CEPO的量小于约30％重量，并且甚至更优选的以ESI-质谱法测定，过-氨基甲酰化CEPO的量小于约25％重量，并且甚至更优选的小于约20％，并且甚至更优选的小于约15％。最优选的以总CEPO重量计过-氨基甲酰化EPO不多于约10％、约5％或约1％。

可以使用其它运行和洗脱缓冲溶液，同样可以使用其它阴离子交换基质和电荷过滤器。非限制性的基质实例为交联多糖或交联混合多糖、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯或天然陶瓷基质。

此外，还可以使用聚苯乙烯、疏水作用色谱、反相色谱法、亲合色谱、分子排阻色谱纯化。

在下面的浓度和缓冲液调节的步骤中，使用透析-超滤正切流动过滤单元。氨基甲酰化EPO调节至浓度＞0.5mg/ml，缓冲溶液换成20mM柠檬酸盐、100mM NaCl缓冲液。浓度和缓冲溶液的变化是通过BioMax(Millipore)以5kDa的MWCO的方法进行的。其它过滤器也可以使用。

最后，纯化的生物制药的药品使用Millipak(Millipore)0.22μm过滤，以除去微生物。任何0.22μm过滤器均可使用。

使用该方法，获得了完全氨基甲酰化EPO，其经SEC-HPLC测定小于3％或优选小于2.5％的聚集物。使用氨基酸分析测定赖氨酸转化为高瓜氨酸，验证8个赖氨酸残基的完全氨基甲酰化。此外，氨基甲酰化接着使用TNBS分析测定伯胺，由此显示完全的氨基甲酰化的赖氨酸和N-末端。

此外，使用MALDI-TOF，充分的鉴定测定了对肽N糖苷酶处理的蛋白质和具有N-聚糖的蛋白质的完整质量(intact mass)的变化。另外，MALDI-TOF肽质量指纹分析/LC-MS/MS分析表明显示全部的8个赖氨酸和N-末端被氨基甲酰化。未检测到其它氨基甲酰化氨基酸，并且未检测到聚糖的修饰。而且，在终产物中获得了EPO的过-和次氨基甲酰化形式的量减少。该产物是新型的并被要求其权利。

本发明的一个实施方案为氨基甲酰化后阴离子交换纯化前获得的混合物，包括氨基甲酰化EPO，其小于约40％重量的聚集物和聚合物、或小于约30％、或小于约25％、或小于约20％、或小于约15％、或小于约12.5％、或小于约10％、或小于约8％、或小于约7％，和一定量的氰酸盐。

本发明进一步的实施方案为阴离子交换纯化后获得的混合物，包括氨基甲酰化EPO，其小于约3％重量的聚集物和聚合物、或小于约2.5％、或小于约2％、或小于约1.5％、或小于约1％、或小于约0.5％。进一步的，该混合物包括含有过-或次-氨基甲酰化EPO的异型，其量为小于约40％总氨基甲酰化EPO的重量、或者更优选小于约35％、或者小于约30％、或者小于约25％、或者小于约20％、或者小于约15％、或者小于约10％、或者小于约7.5％、或者小于约5％、或者小于约2％，并且最优选小于约1％。进一步的，混合物中过-氨基甲酰化EPO的量为小于约35％总氨基甲酰化EPO的重量、或更优选的小于约30％、或小于约25％、或小于约20％、或小于约15％、或小于约10％、或小于约7.5％、或小于约5％、或小于约2％，并且最优选小于约1％。

本发明的药物组合物

本发明的一方面是本发明化合物在制备药物组合物中的用途，用于人或哺乳动物以治疗下述症状。

本发明的一个实施方案为药物组合物，包括治疗有效量的氨基甲酰化EPO，其具有小于约3％重量的聚集物和聚合物、或更优选小于约2.5％、或小于约2％、或小于约1.5％、或小于约1％并且最优选小于约0.5％，并且进一步的，该组合物包括含有过-或次-氨基甲酰化EPO的异型，为小于约40％总氨基甲酰化EPO的重量、或者更优选小于约35％、或者小于约30％、或者小于约25％、或者小于约20％、或者小于约15％、或者小于约10％、或者小于约5％、或者小于约3％、或者小于约2％，并且最优选小于约1％。进一步的，组合物中过-氨基甲酰化EPO的量小于约35％总氨基甲酰化EPO的重量、或更优选的小于约30％、或小于约25％、或小于约20％、或小于约15％、或小于约10％、或小于约5％、或小于约3％、或小于约2％，并且最优选小于约1％。

在本发明一方面的实施中，如上述包含本发明化合物的药物组合物可以任意途径给哺乳动物施用，其在血管系统中提供了本发明化合物足够的浓度，以容许穿过上皮细胞屏障易位，并对易感细胞产生有益作用。当以灌注组织或器官为目的使用时，预期有相似的结果。在当细胞或组织是非血管化和/或给药是通过以本发明组合物沐浴(bath)细胞或组织时，在该实例中，该药物组合物提供了有效应答细胞一有益量的本发明化合物。本发明化合物穿过而可以易位的上皮细胞屏障，其包括存在于哺乳动物中的紧密连接、突破连接、有孔连接和任意其它类型的上皮屏障。优选的屏障为上皮细胞紧密连接，但本发明不限于此。

本发明的前述化合物广泛用于治疗或预防处理人类的中枢神经系统或周围神经系统疾病，其主要有神经或精神症状，眼科疾病，心血管疾病，心肺性疾病，呼吸系统疾病，肾脏、泌尿和生殖疾病，胃肠道疾病以及内分泌和代谢疾病。特别是，这些症状和疾病包括低氧症状，其不利地影响可兴奋组织，例如在中枢神经系统组织、周围神经系统组织或心脏中的可兴奋组织，或者视网膜组织，诸如，例如，脑、心或视网膜/眼。因此，本发明的化合物可用于治疗或预防对可兴奋组织的损伤，其起因于在多种症状和状况下的低氧症状。该症状和状况的非限制性举例提供于下述的表中。

在根据本发明的可治疗的神经元组织病理学保护的实施例中，该病理包括那些由于神经元组织的氧合减少产生的。任何减少给予神经元组织可利用的氧的情况，其导致应激、损害及最终神经元细胞死亡，可通过本发明的方法治疗。通常所说的低氧和/或局部缺血，这些症状产生于或包括，但不限于，中风、血管闭塞、产前或产后缺氧、窒息、气哽、近乎溺死、一氧化碳中毒、烟吸入、包括外科和放射的创伤、昏厥、癫痫、低血糖、慢性阻塞性肺病、肺气肿、成人呼吸窘迫综合征、低血压晕厥、败血症性休克、过敏性休克、胰岛素休克、镰状细胞危象、心搏停止、节律障碍、氮麻醉以及由心肺分流术引起的神经缺损。

在一个实施方案中，例如，包含本发明的组合物的特定的药物组合物可用于预防损伤或组织损伤，其产生于手术操作期间的损伤或组织损伤的危险，例如，举例，肿瘤切除术或动脉瘤修复。低血糖引起或起因于它的其它可通过描述于此的方法治疗的病状，包括胰岛素过量，还指医源性高胰岛素血症、胰岛素瘤、生长激素缺乏、肾上腺皮质功能减退、药物过量和某些肿瘤。

起因于可兴奋神经元组织损伤的其它病状包括癫痫疾患，例如癫痫、惊厥或慢性癫痫疾病。其它可治疗的症状和疾病包括，但不限于，疾病例如中风(缺血性中风、蛛网膜下腔出血、大脑内出血)、多发性硬化症、低血压、心搏停止、阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、脑性麻痹、脑或脊髓创伤、爱滋病痴呆、年龄相关性认知功能丧失、记忆丧失、肌萎缩侧索硬化、癫痫疾患、酒精中毒、视网膜缺血、青光眼引起的视神经损伤、神经元损耗。

本发明的特定的组合物和方法可用于治疗由疾病症状或各种创伤引起的炎症，例如物理或化学引起的炎症。该创伤可包括脉管炎、慢性支气管炎、胰腺炎、骨髓炎、类风湿性关节炎、肾小球肾炎、视神经炎、颞动脉炎、脑炎、脑脊膜炎、横贯性脊髓炎、皮肌炎、多发性肌炎、necrotizing fascilitis、肝炎和坏死性小肠结肠炎

证据表明，活化的星形胶质细胞可通过产生神经毒素而对神经元产生细胞毒作用。氧化亚氮、活性氧簇和细胞因子是从神经胶质细胞中释放的，以适应脑缺血(见Becker，K.J.2001.Targeting the centralnervous system inflammatory response in ischemic stroke.Curr OpinionNeurol 14：349-353以及Mattson，M.P.，Culmsee，C.，和Yu，Z.F.2000.Apoptotic and  Antiapoptotic mechanisms in stroke.Cell TissueRes301：173-187.)。研究进一步证明，在神经变性模型中，神经胶质的活化和随后炎性细胞因子的产生依赖于初级神经元的损伤(见Viviani，B.，Corsini，E.，Galli，C.L.，Padovani，A.，Ciusani，E.和Marinovich，M.2000.Dying neural cells activate glia through the release of a protease product.Glia 32：84-90和Rabuffetti，M.，Scioratti，C.，Tarozzo，G.，Clementi，E.，Manfredi，A.A.，和Beltramo，M.2000.Inhibition of caspase-1-likesactivity by Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-chloromethyl ketone includes longlasting nenroprotection in cerebral ischemia through apoptosisreduction and decrease of proinflammatory cytokines. J Neurosci20：4398-4404)。炎症和神经胶质活化通常是神经变性疾病的不同形式，包括脑缺血、脑外伤和实验性过敏性脑脊髓炎，在这些疾病中促红细胞生成素产生神经保护作用。促红细胞生成素产生的细胞因子的抑制作用能够，至少部分地，介导它的保护作用。然而，与“典型的”抗炎细胞因子例如IL-10和IL-13不同，其直接地抑制肿瘤坏死因子的生成，促红细胞生成素仅在神经元出现死亡时显示出活性。

虽然不希望被任何特别的理论束缚，该抗炎活性似乎可能被假想地由多种非限制性理论解释。首先，由于促红细胞生成素抑制细胞凋亡，由细胞凋亡引起的发炎可以被预防。此外，促红细胞生成素可以防止分子信号从濒死的神经元中释放，该神经元刺激神经胶质细胞或者直接地作用于神经胶质细胞减少其对这些产物的反应。另一可能性是促红细胞生成素靶向于更多邻近的引起细胞凋亡和炎症的炎症级联反应成员(例如，半胱天冬酶1(caspase 1)、活性氧或氮媒介物)。

此外，促红细胞生成素显示提供抗炎保护作用，而没有典型地与其它抗炎化合物例如地寒米松伴随的反弹作用。另一方面，不希望被任何特别的理论束缚，看来这是由于促红细胞生成素对多功能神经毒素例如氧化亚氮(NO)的作用。尽管活化的星形胶质细胞和小神经胶质产生NO的神经毒性量相应于不同的创伤，NO在体内用于许多目的，包括基本生理功能的调节。这样，尽管使用抗炎药可能通过抑制NO或其它神经毒素而减轻炎症，如果该抗炎药具有太长的半衰期，它还可能干扰其它化学药物在修复起因于引发炎症创伤的损伤中的作用。假设本发明的化合物能够减轻炎症，而不防碍神经毒素例如NO的康复能力。

本发明的特定组合物和方法可用于治疗视网膜组织的和对其损伤的症状。这些障碍包括，但不限于视网膜缺血、黄斑变性、视网膜剥离、视网膜色素变性、动脉硬化性视网膜病、高血压性视网膜病、视网膜动脉阻断、视网膜静脉阻断、低血压和糖尿病性视网膜病。

在另一实施方案中，本发明的方法和原理可用于保护或治疗损伤，其起因于辐射损伤或化学诱导对可兴奋组织的损伤。在非限制性实例中，保护免受由化合物如紫杉烷类、顺铂和其它具有潜在诱发周围神经病变的其它化学治疗引起的损伤。本发明方法的进一步的应用是治疗神经毒素中毒，例如软骨藻酸蛤贝中毒、山黧豆中毒和关岛病(Guam disease)、肌萎缩性侧索硬化和帕金森氏病。

如上所述，本发明也涉及一种在哺乳动物中通过外周给予本发明上述化合物以增强可兴奋组织的功能的方法。多种疾病和症状适合于使用该方法治疗，并且进一步的，该方法可用于增强在任何症状或疾病的缺失下的认知功能。本发明的这些应用在下面进一步的详细描述，并包括在人和非人类哺乳动物中促进学习和训练。

针对于中枢神经系统，可通过本发明这方面的方法治疗的症状和疾病包括，但不限于，心境障碍、焦虑症、抑郁症、孤独症、注意缺陷障碍伴多动和认知机能障碍。增强神经功能对这些症状是有益的。根据本发明教导的可治疗的其它障碍包括例如，睡眠中断，睡眠性呼吸暂停和行走相关障碍；蛛网膜下和动脉瘤出血，血压过低休克，震荡性损伤，败血症性休克，过敏性休克和各种脑炎和脑脊膜炎的后遗症，例如，结缔组织疾病相关性cerebritides例如狼疮。其它用途包括预防或保护来自神经毒素的中毒，例如软骨藻酸蛤贝中毒、山黧豆中毒和关岛病、肌萎缩性侧索硬化、帕金森氏病；术后治疗血栓或局部缺血的损伤；全脑辐射；镰状细胞危象和惊厥。

本发明的方法进一步治疗的症状组包括遗传性或后天性的线粒体机能障碍，其为以神经元损伤或死亡为表征的多种神经性疾病的起因。例如，以进行性视力丧失和由于神经元脱离造成的脑病和肌病为特征的利氏(Leigh)病(亚急性坏死性脑病)。在这些病例中，不完整的线粒体代谢未能提供足够高的能量基础给可兴奋细胞的代谢供应燃料。促红细胞生成素受体调节器使在多种线粒体疾病中的缺损功能得以完善。如上所述，低氧症状不利地影响可兴奋组织。该可兴奋组织包括，但不限于，中枢神经系统组织、周围神经系统组织和心脏组织。除上述的症状外，本发明的方法还可用于吸入中毒的治疗，例如一氧化碳和烟吸入，重度哮喘，成人呼吸窘迫综合征，气哽和近乎溺死。产生低氧症状或被其它方式诱发的可兴奋组织损伤的更多症状包括低血糖症，其可能发生于胰岛素使用剂量不当，或胰岛素产生的赘生物(胰岛素瘤)。

被认为是源发于可兴奋组织损伤的各种神经心理症状可通过瞬时的方法治疗。与神经元损伤有关的和以本发明所提供的治疗的慢性疾病包括与中枢神经系统和/或周围神经系统相关的疾病，其包括年龄相关性认知功能丧失和老年性痴呆，慢性癫痫疾患，阿耳茨海默氏病，帕金森氏病，痴呆，记忆丧失，肌萎缩性侧索硬化，多发性硬化症，结节性硬化症，大脑威尔逊氏病(Wilson’s Disease)和进行性核上性麻痹，关岛病，Lewy体痴呆(Lewy body dementia)，蛋白酶传染性因子疾病，例如海绵状脑病，例如，克罗伊茨费尔特-雅各布病(Creutzfeldt-Jakob disease)，亨延顿氏舞蹈病(Huntington′s disease)，肌强直性营养不良，夏科-马里-图思病(Charcot-Marie-Tooth Disease)，佛里德里希氏(Freidrich′s)共济失调和其它共济失调，以及，基尔-德-拉-图雷特(氏)综合征(Gilles de Ia Tourette′s syndrome)，癫痫疾患例如癫痫和慢性癫痫疾患，休克，脑或脊髓创伤，艾滋病痴呆，酒精中毒，孤独症，视网膜缺血，青光眼，自发性功能障碍例如高血压和睡眠障碍，以及神经精神疾病包括，但不限于，精神分裂症，情感分裂性精神障碍，注意力缺陷障碍性兴奋过度，情绪恶劣性障碍，严重的抑郁性障碍，躁狂症，强制性障碍，应用精神作用物质所致精神障碍，焦虑症，惊恐性障碍，以及单相和双相感情失常。其它神经精神和神经变性疾病包括，例如，在最新版本IV的American PsychiatricAssociation′s Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders(DSM)中列出的，其整体在此引入作为参考。

在另一实施方案中，包含本发明化合物的重组嵌合性毒素分子可用于毒素投递的治疗，以治疗增殖性疾病，例如癌症或病毒性疾病如亚急性硬化性全脑炎。

表1列举了其它的代表性的、非限制性的适应症，作为通过本发明前述化合物可治疗的各种症状和疾病。

表1

细胞、组织或器官	机能障碍或病状	症状或疾病	类型
				心脏	局部缺血	冠状动脉疾病	急性、慢性稳定型、不稳定型
心肌梗塞	Dressler’s综合征
		心绞痛
先天性心脏病	瓣膜性心肌症
		变异型心绞痛
心脏破裂	动脉瘤中隔穿孔
		脉管炎

细胞、组织或器官	机能障碍或病状	症状或疾病	类型
				心脏	心律失常	快-，慢性心律失常室上性，室性传导异常	稳定，不稳定型过敏性颈动脉窦结
充血性心力衰竭	左，右，两室性，收缩期，舒张期	心肌疾病，例如原发性家族性，传染性，代谢性，贮藏性疾病，缺乏，结缔组织障碍，浸润和肉芽肿，神经血管
			心肌炎		自身免疫性，传染性，原发性
	肺源性心脏病
			钝性和穿透性创伤
毒素	可卡因中毒
			血管		高血压	原发性，继发性
减压病
				纤维肌性增生
动脉瘤	解剖，破裂，扩大
				肺	梗塞	哮喘慢性支气管炎，肺气肿和气道梗塞
局部缺血性肺病	肺动脉栓塞，肺动脉血栓形成，脂肪栓
			外周性肺病
局部缺血性肺病	肺动脉栓塞肺动脉血栓形成
			间质性肺病		特发性肺纤维变性
先天性的	囊性纤维病

细胞、组织或器官	机能障碍或病状	症状或疾病	类型
				肺	肺源性心脏病
创伤
			肺炎和pneumonitides		传染性，寄生性，中毒性，创伤性，烧伤，误吸
结节病
			胰脏		内分泌	糖尿病，I和II型	β细胞衰竭，机能障碍糖尿病性神经病变
胰脏的其它内分泌细胞衰竭
		外分泌		外分泌胰脏衰竭		胰腺炎
骨	骨量减少				原发性继发性		性腺机能减退固定术经绝后的年龄相关的甲状旁腺功能亢进甲状腺功能亢进钙，镁，磷和/或维生素D缺乏
		骨髓炎
	无血管性坏死
		创伤
	Paget’s病
		皮肤	秃发症	簇状的全部的(totalis)			原发性继发性男性型秃发
白斑病	局部的全身的				原发性继发性

细胞、组织或器官	机能障碍或病状	症状或疾病	类型
				皮肤	糖尿病性溃疡
周围血管疾病
			烧伤
自身免疫性疾病	红斑狼疮，Sjiogren，类风湿性关节炎，肾小球肾炎，脉管炎
			Langerhan’s组织细胞增多病
	眼	视神经炎
钝性和穿透性创伤，感染，结节病，镰状细胞病，视网膜剥离，颞动脉炎
		视网膜缺血，黄斑变性，视网膜色素变性，动脉硬化性视网膜病，高血压性视网膜病，视网膜动脉阻断，视网膜静脉阻断，低血压，糖尿病性视网膜病和黄斑水肿
胚胎和胎儿异常			窒息
	局部缺血
			CNS	慢性疲乏综合征，急性和慢性低渗性和高渗性综合征，AIDS痴呆，触电致死

细胞、组织或器官	机能障碍或病状	症状或疾病	类型
					脑炎	狂犬病，疱疹
脑脊膜炎
			硬脑膜下血肿
尼古丁成瘾
			药物滥用和停药		可卡因，海洛因，crack，大麻，LSD，PCP，多药滥用，入迷，阿片类，镇静催眠药，安非他明，咖啡因
强制性障碍
			脊柱狭窄，横贯性脊髓炎，格林-巴利，创伤，神经根压迫，肿瘤压迫，中暑
ENT	耳鸣Meuniere’s综合征听力丧失
			跌打损伤，耳气压伤
	肾脏	肾衰竭				急性，慢性	血管性/局部缺血性，间质病，糖尿病性肾脏疾病，肾炎综合征，感染，创伤，造影剂诱发，化学治疗诱导，CPB-诱导或预防性
亨诺克氏紫癜

细胞、组织或器官	机能障碍或病状	症状或疾病	类型
				横纹肌	自身免疫性疾病	重症肌无力皮肌炎多发性肌炎
肌病	遗传性代谢的，内分泌的和中毒的
			中暑
挤压伤
			横纹肌溶解(Rhabdomylosis)
线粒体病
			感染		坏死性筋膜炎
性功能障碍	中枢性和外周性(例如勃起障碍)	对药物治疗的继发性性无能，(糖尿病)
			肝脏	肝炎	病毒性，细菌性，寄生性
局部缺血病
				肝硬化，脂肪肝
浸润性/代谢性疾病
				胃肠道	局部缺血性肠疾病
炎性肠病
			坏死性小肠结肠炎
器官移植	供者和受者的治疗
			生殖道	不育症	血管自身免疫子宫异常移植障碍
内分泌	腺机能过度和减退

如上所述，这些疾病、病症或症状仅仅是对于本发明化合物所提供的有益效果所列的例证。相应地，本发明广泛地提供了机械创伤的或人体疾病的结果的治疗或预防性治疗。对于CNS和/或周围神经系统的疾病、病症或症状的治疗或预防性治疗是优选的。提供了对具有精神病成分的疾病、病症或症状的治疗或预防性治疗。提供了对疾病、病症或症状的治疗或预防性治疗，其包括但不限于，眼、心血管、心肺、呼吸、肾脏、泌尿、生殖、胃肠、内分泌或代谢部位。

在一种实施方案中，包括本发明化合物的该药物组合物可以全身性地给药以保护或增强靶点的细胞、组织或器官。该给药可以是胃肠外的，通过吸入或粘膜穿透的，例如，经口、经鼻、经直肠、经阴道、舌下、粘膜下或经皮。优选的，是注射给药，例如，通过静脉或腹膜内注射，并且还包括，但不限于动脉内、肌内、真皮内和皮下给药。

对于其它给药途径，例如使用灌注液，注入器官中或其它局部地区给药，所提供的药物组合物会致使本发明化合物与上述相似的浓度。约0.01pM-30nM的浓度是优选的。

本发明的药物组合物可以包含治疗有效量的化合物和可药用的载体。在特定的实施方案中，术语“可药用的”意指被联邦或州政府管理机构批准的，或列于美国药典或其它通常认可的外国的用于动物并且更特别地用于人的药典。术语“载体”指稀释剂、辅剂、赋形剂或媒介物，以其治疗性的给药。这些药学载体可以是无菌液体，例如盐水溶液和油，包括石油、动物、植物或来源于人造的，例如花生油、大豆油、芝麻油等等。当该药物组合物经静脉给药时，盐溶液是优选的载体。盐溶液以及葡萄糖和丙三醇的水溶液也可以作为液体载体使用，特别是对于可注射的溶液。适宜的药学辅料包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、丙三醇、丙烯、丙二醇、水、乙醇等。如果需要，该组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂，或pH值缓冲剂。这些组合物可采取溶液剂、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、粉末剂、缓释制剂等的形式。该组合物可以以传统的粘合剂和载体例如甘油三酯配制成栓剂。本发明的化合物可以以中性的或盐的形式配制。可药用的盐包括那些与游离氨基形成的例如那些产生于盐酸的、磷酸的、乙酸的、草酸的、酒石酸的，等等，以及那些与游离羧基形成的例如产生于钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等等。适合的药学载体的举例如E.W.Martin在″Remington′s Pharmaceutical Sciences″中所述的。该组合物包含治疗有效量的优选以纯化形式的化合物与适宜量的载体，从而提供适合患者给药的形式。该制剂应当适合给药模式。

可提供适合于口服给药的药物组合物，如胶囊剂或片剂；如粉末剂或颗粒剂；如溶液剂、糖浆剂或混悬剂(在水性或非水性液体中)；如可食用的泡沫或whips；或如乳剂。片剂和硬胶囊剂可以包含乳糖、淀粉或其衍生物、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁、硬脂酸或其盐。软明胶胶囊可以包含植物油、蜡、脂肪、半固体或液体多元醇等。溶液剂和糖浆剂可以包含水、多元醇和糖。

用于口服给药的活性剂可以以延迟活性成分在胃肠道中崩解和/或吸收的材料包裹或混合(例如，可以使用单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯)。这样，活性剂的持续释放可以达到数小时以上并且，如果需要，该活性剂可以在胃中被保护而避免降解。供口服的药物组合物可以被配制，以促进活性剂在具有特定pH或酶环境的特定胃肠部位释放。

可供适合于经皮给药的药物组合物为不连续的贴片，以保持与受试者的表皮紧密结合，从而延长时间。可供适合于局部给药的药物组合物为软膏剂、乳膏剂、混悬剂、洗剂、粉末剂、溶液剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂或油剂。对于皮肤、口腔、眼或其它外部组织的局部给药，优选使用软膏剂或乳膏剂。当配制成软膏剂时，活性成分可以与石蜡或可与水混合的软膏基质使用。另选的，该活性成分可以与水包油基质或油包水基质配制成乳膏。适合于眼部局部给药的药物组合物包括滴眼液。在这些组合物中，活性成分可溶解或混悬于合适的载体中，例如，在水性溶剂中。适合于口腔局部给药的药物组合物包括锭剂(lozenges)、软锭剂(pastilles)和漱口剂。

适合于经鼻和经肺给药的药物组合物可以含有固体载体如粉末(优选粒度范围为20～500μm)。可以将粉末以鼻吸药的方式给药，即，从将靠近鼻子的粉末容器中经鼻迅速吸入。另选的，适合于经鼻给药的药物组合物可以含有液态载体，例如，鼻喷雾剂或滴鼻剂。另选的，直接进入肺中的吸入剂可以通过深吸入或经进入口咽的烟嘴装置而实现。这些组合物可以包括活性成分的水或油溶液。经吸入给药的组合物可以以特别适合的装置提供，包括但不限于，压力气雾剂、喷雾器或吸入器，它可以具有用于提供预定剂量的活性成分的构造。在优选的实施方案中，本发明的药物组合物直接进入鼻腔中或通过鼻腔或口咽进入肺中而给药。

可供适合于直肠给药的药物组合物为栓剂或灌肠剂。可供适合于阴道给药的药物组合物可以为阴道栓剂、棉塞剂(tampons)、乳膏剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾剂剂型。

适合于胃肠外给药的药物组合物包括水性或非水性无菌可注射的溶液或混悬液，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使组合物基本上与需要使用者的血液等渗的溶质。可以存在于该组合物中的其它组分包括，例如水、醇类、多元醇、丙三醇和植物油。适合于注射给药的药物组合物可以存在于单-剂量或多-剂量容器中，例如密封的安瓿和管形瓶，并且可以贮存在冷冻干燥的(低压冻干的)条件下，仅要求在使用前立即添加无菌液状载体例如注射用无菌盐水溶液。临时注射溶液和混悬液可以从无菌粉末、颗粒和片配制。在一种实施方案中，包括本发明化合物的可注射溶液的自动注射器可以在救护车、急诊室和战场情况下紧急使用，以及甚至在家庭环境下的自己使用，特别是可能发生外伤性切断的可能性时，例如鲁莽地使用割草机。通过在复置术后，甚至在医务人员到达现场之前，或遭受脚趾切断的个体到达急诊室之前，立即向切断部位的多个位置给予本发明的化合物，在已切断的脚和脚趾中的细胞和组织幸存的可能性可能增加。

在优选的实施方案中，该组合物根据可适合于向人静脉给药的药物组合物的常规程序配制。例如，静脉给药组合物是无菌等渗水性缓冲溶液。需要时，该组合物还可以包括增溶剂和局部麻醉剂例如利多卡因，以减轻注射部位的疼痛。一般的，各组分为分别的或共同混合的、以单剂量形式提供，例如，干燥的冷冻干燥粉末或在熔封容器如安瓿或sachette中的无水浓缩液，标示出活性剂的量。该组合物经输注给药时，它可以与含有无菌药用级的水或盐水的输注瓶调配。该组合物通过注射给药时，可以提供无菌盐水的安瓿，以便各成分可以在给药前预先混合。

栓剂通常含有0.5％～10％重量的活性成分；口服制剂优选含有10％～95％的活性成分。

可提供灌注液组合物以用于移植器官浴槽、原位灌注，或在器官采集前向器官供者的血管系统给药。该药物组合物可以包含不适用于给个体急性或慢性、局部或全身给予本发明的化合物的浓度，但是，在将该治疗器官或组织暴露或复原到正常循环之前，预先除去或减少包含于此的本发明化合物浓度之前，此时可预备用于尸体、器官浴、器官灌注或原位灌注。

本发明还提供了一种药物包装或药盒，其包括一个或多个填充了一种或多种本发明药物组合物的成分的容器。任选的与该容器结合，其可以是以管理药物制剂或生物制品的制备、使用或销售的政府机构规定的形式公告，该公告反映了经过人用药制备、使用或销售机构的批准。

在另一实施方案中，例如，本发明的该化合物可以以控释系统投递。例如多肽可以使用静脉输注、植入性渗透泵、透皮贴剂、脂质体或其它给药形式给予。在一种实施方案中，可以使用泵(见Langer，supra，Sefton，1987，CRC Crit.Ref. Biomed.Eng.14：201；Buchwald等，1980，Surgery 88：507；Saudek等，1989，N.Engl.J.Med.321：574)。在另一实施方案中，该化合物可以以泡囊投递，特别是脂质体(见Langer，Science 249：1527-1533(1990)；Treat等，于Liposomes in the Therapy ofInfectious Disease and Cancer，Lopez-Berestein and Fidler(eds.)，Liss，New York，pp.353-365(1989)；WO 91/04014；美国专利号4,704,355；Lopez-Berestein，同上，pp.317-327；通常出处同上.)。在另一实施方案中，可以使用聚合物材料(见Medical Applications of Controlled Release，Langer and Wise(eds.)，CRC Press：Boca Raton，Florida，1974；Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Design and Performance，Smolen and Bail(eds.)，Wiley：New York(1984)；Ranger and Peppas，J.Macromol.Sci.Rev.Macromoi.Chem.23：61，1953；还见Levy等，1985，Science 228：190；During等，1989，Ann.Neurol.25：351；Howard等，1989，J.Neurosurg.71：105)。

在再另一个实施方案中，控制释放系统可置于接近治疗靶点，即靶细胞、组织或器官，从而仅要求全身剂量的一部分(见，例如，Goodson，pp.115-138于Medical Applications of Controlled Release，vo1.2，supra，1984)。其它控制释放系统已由Langer(1990，Science 249：1527-1533)在综述中讨论。

在另一实施方案中，本发明的化合物通过适当的配制，可以经鼻、口、直肠、阴道或舌下给药。

在特定的实施方案中，期望将本发明的组合物向需要治疗的局部区域给药；这可以通过例如，并且不限于以下方式达到：在手术期间局部输注，局部给药，如与伤口敷料结合；注射；导管方式；栓剂方式；植入剂方式，所述的植入剂为多孔的、无孔的或明胶材料，包括薄膜，例如硅橡胶薄膜或纤维。

该优选有效剂量的选择由技术人员根据多种因素考虑决定，这对本领域的技术人员来说是已知的。这些因素包括本发明化合物的特定形式，以及其药代动力学参数例如生物利用度、代谢、半衰期等，它们在典型地用于获得药物化合物规定批准的常规开发过程中就已经确定。其它应考虑的剂量因素包括需要治疗的症状和疾病，或在正常个体中可达到的益处、患者体重、给药途径、给药是否为急性或慢性、联合用药及其它已知的影响给药效果的因素。因此应当根据医生和每名患者的状况的判断确定精确的剂量，例如，依靠每名患者的状况和免疫状态，并依照标准的临床技术。

本发明的另一方面，灌注液或灌注溶液是供灌注和移植器官贮存用的，该灌注溶液包括一定量的本发明化合物，有效地保护敏感细胞和相关的细胞、组织或器官。移植包括但不限于异种移植，其中器官(包括细胞、组织或其它身体部分)是从一个供体获得的，并移植到不同的受体上；以及自体移植，其中器官取自身体的一个部分并补充到另一处，包括实验台手术操作，其中一个器官可以被移除，然后离体切除、修复或其它操作，例如肿瘤切除术，再送回原始位置。在一种实施方案中，灌注溶液为Wisconsin大学(UW)溶液(美国专利号4798824)，其含有约1～约25U/ml促红细胞生成素、5％羟乙基淀粉(分子量为约200000～约300000，并且基本上无乙二醇、2-氯乙醇、氯化钠和丙酮)、25mM KH₂PO₄、3mM谷胱甘肽、5mM腺苷、10mM葡萄糖、10mMHEPES缓冲液、5mM葡萄糖酸镁、1.5mM CaCl₂、105mM葡萄糖酸钠、200000单位青霉素、40单位胰岛素、16mg地塞米松、12mg酚磺酞，并且pH为7.4-7.5及渗透压约320mOSm/l。该溶液用于在移植前维持尸体的肾脏和胰脏。使用该溶液，推荐用于尸体肾脏保存时，保存可延长到超过30小时的限度。该特殊灌注液只是许多目前适合使用的这种溶液的例证，其包含本发明有效量的化合物。在另一实施方案中，灌注溶液含有约0.01pg/ml～约400ng/ml的本发明化合物，或者约40～约300ng/ml的本发明化合物。

当本发明化合物贯穿于此处使用的优选受体为人时，此处使用的方法等同于其它哺乳动物，特别是家养动物、家畜、伴侣和动物园的动物。然而，本发明并不限于此，并且其益处可用于任何哺乳动物。

本发明化合物的治疗和预防应用

如下述实施例所述，在人类内皮的脑毛细管中，促红细胞生成素受体的存在表明本发明化合物的靶点为人脑，并且对本发明这些化合物的动物研究可直接转移到人类的治疗或预防上。

本发明的另一方面，通过将细胞、组织或器官直接向包含本发明化合物的药物组合物暴露，或将包含于药物组合物中的本发明化合物给予或接触组织或器官的血管系统，对于未被上皮细胞屏障与血管系统隔离的细胞、组织或器官，提供了提高它们的存活率的方法和化合物。积极效果突出的原因在于提高了治疗组织或器官中的敏感细胞的活性。

如上所述，本发明的一部分是基于这一发现，即促红细胞生成素分子可以从腔表面转运到与上皮细胞紧密连接的器官毛细血管上皮细胞的基底膜表面，包括，例如，脑、视网膜和睾丸。这样，对于本发明化合物的有益效果，敏感细胞通过的该屏障是敏感的靶点，而且对于本发明的方法而言，包含和全部或部分地依赖于此处的敏感细胞的其它细胞类型或组织或器官也是靶点。当不希望被任何特定的理论束缚时，本发明化合物跨细胞作用后，本发明的该化合物可以干扰敏感细胞上的促红细胞生成素受体，例如，神经元、视网膜、肌肉、心脏、肺、肝、肾、小肠、肾上腺皮质、肾上腺髓质、毛细管内皮、睾丸、卵巢、胰腺、骨、皮肤或子宫内膜细胞，并且受体结合能够引发信号传导串联，致使敏感细胞或组织之内的基因表达程序的激活，导致细胞或组织或器官免受例如毒素、化学治疗剂、放射治疗、缺氧等的损伤的保护作用。这样，保护含有敏感细胞的组织避免损伤或缺氧应激以及增强这些组织的功能的方法在下文进行了详细描述。如上所述，本发明的方法同样适用于人以及其它动物。

在本发明的一个实施方案的实施中，哺乳动物的患者经历了癌症治疗的全身化学治疗，包括放射治疗，其通常具有不良反应例如神经、肺、心脏、卵巢或睾丸损伤。如上所述的包含本发明化合物的药物组合物的给药是在化学治疗和/或放射治疗之前或期间完成的，以保护各种组织和器官避免化学治疗剂的损伤，例如保护睾丸。可以连续进行治疗，直至化学治疗剂的循环浓度下降到低于对哺乳动物身体的潜在危险的浓度以下。

在本发明的另一实施方案的实施中，有计划地从汽车事故的受害者中采集不同的器官以移植到多个接受者，其中一部分需要长距离和时间的运输。在器官采集之前，将包含本发明此处所述化合物的药物组合物灌注给受害者。需要运输的采集器官用包含本发明此处所述化合物的灌注液灌注，并贮存在含有本发明化合物的浴槽中。利用根据本发明的含有本发明化合物的灌注液，以搏动灌注装置连续地灌注某些器官。在运输和移植以及器官原位再灌注期间，器官功能发生最低限度的衰退。

在本发明的另一实施方案中，修复心瓣膜的手术操作需要临时的心脏停搏和动脉闭塞。手术之前，患者每kg体重灌注本发明化合物4μg。这样处理防止了低氧局部缺血的细胞损伤，特别是在再灌注之后。

在本发明的另一实施方案中，在任意手术操作例如在心肺旁路手术中可以使用本发明的化合物。在一种实施方案中，在旁路手术之前、期间和/或之后，给予包含本发明化合物的药物组合物，以保护脑、心脏和其它器官的功能。

在上述本发明化合物离体使用或治疗敏感细胞例如神经元组织、视网膜组织、心脏、肺、肝、肾、小肠、肾上腺皮质、肾上腺髓质、毛细管内皮、睾丸、卵巢或子宫内膜细胞或组织的实例中，本发明提供了适合于保护或增强敏感细胞、组织或器官远端至血管系统的单元剂量形式的药物组合物，每一单元剂量包含有效、非毒性量的范围为约0.01pg～5mg、1pg～5mg、500pg～5mg、1ng～5mg、500ng～5mg、1μg～5mg，500μg～5mg或1mg～5mg的本发明化合物和可药用的载体。在优选的实施方案中，本发明化合物的量的范围为约1ng～5mg。

本发明的另一方面，在经历脑外伤的动物中，发现EPO给药可恢复认知功能。预期本发明的化合物具有与EPO相同的细胞保护功能。在延迟5天或30天之后，与模拟治疗动物相比，EPO仍然能够恢复功能，显示出EPO对再生或恢复脑活性的能力。这样，本发明还涉及本发明化合物在制备治疗脑外伤和其它认知机能障碍的药物组合物中的用途，包括损伤后的康复治疗(例如，3天、5天、1周、1月或更久)。本发明还涉及治疗损伤后认知机能障碍的方法，其通过施用有效量的本发明化合物。此处所述的本发明的任意化合物可用于本发明的这一方面。

此外，本发明的该康复性方面涉及此处的本发明的任意化合物在制备用于细胞、组织或器官机能障碍的恢复的药物组合物中的用途，其中治疗是始发之后和康复之后，该始发的创伤由机能障碍所致。此外，使用本发明化合物的治疗可以跨越疾病或症状的急性期及慢性期的病程。

在具有红细胞生成活性的化合物的实例中，该化合物可以全身给药，每次给药剂量为约1μg～约100μg/kg体重，优选约5μg～50μg/kg体重，最优选约10μg～30μg/kg体重。在化合物给药后，该有效剂量足以使化合物的血清浓度达到大于约10000、15000或20000mU/ml血清。该血清浓度可以在给药后约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10小时达到。该剂量可以根据需要重复。例如，只要临床需要，可以每天重复给药，或者在适当的间隔之后，例如，每隔1～12周，但优选的，每隔1～3周。有效量的化合物和可药用的载体可以被包裹在单剂量管形瓶或其它容器中。然而，本发明的该化合物为非红细胞生成的，即，它能产生此处所述的活性而不引起血红蛋白浓度或血细胞比容的增加。在本发明该方法期望长期地提供的实例中，这种非红细胞生成的化合物是特别优选的。在另一实施方案中，本发明的化合物是以高于天然促红细胞生成素相应剂量(W/W)给予的，这对于最大地刺激红细胞生成是必需的。如上所述，本发明的化合物不具有红细胞生成活性，因此上述以单元表示的剂量对于天然促红细胞生成素相应剂量仅仅是示范性的；在此提供了上述摩尔当量的剂量，其适用于本发明的任意化合物。

实施例

通过参考以下提供的作为本发明示范的非限制性实施例可以更好地理解本发明。以下提供的实施例目的在于更完全地说明本发明的优选的实施方案。然而，它们决不是解释为限制本发明的范围。

实施例1

氨基甲酰化促红细胞生成素的制备

在本实施例中，方法的起始材料为纯化的重组人EPO。

首先，为了保持低处理容积的目的，通过超滤调节蛋白质的浓度。将蛋白质浓度调节到3mg/ml。通过BioMax(Millipore)以5kDa的MWCO进行超滤。

完成浓缩步骤后，将EPO溶液与pH9.0的0.5M K-硼酸盐四水合物0.5M K-氰酸盐的溶液混合。该溶液在32℃下孵化24小时。

通过凝胶过滤法将EPO和氰酸盐的反应混合物进行脱盐。蛋白质脱盐至25mM Tris、50mM NaCl、pH8.5的缓冲液中。使用G-25Fine(Amersham Biosciences)树脂。

在大约15cm高的柱子上使用90cm/h流量，应用约20％柱体积的样品负荷。

收集脱盐的氨基甲酰化EPO用于进一步处理。

●在此情况下，聚合物/聚集物含量为7.3％。

下一步是通过使用阴离子交换纯化步骤将聚集物和聚合物除去。使用SOURCE 30Q(Amersham Biosciences)树脂进行纯化。大约4.5mg/ml的氨基甲酰化EPO上柱。流动缓冲液A为25mM Tris、50mMNaCl、pH8.5，洗脱缓冲液B为25mM Tris、1M NaCl、pH8.5。以超过20倍柱体积0-30％执行梯度，收集并混合氨基甲酰化EPO的主峰。

用透析/超滤正切流动过滤装置，将纯化步骤的混合物调节至浓度＞0.5mg/ml，并将缓冲液转换为20mM枸橼酸、100mM NaCl的缓冲液。该浓缩和缓冲液转换是以5kDa的MWCO在0.1m² BioMax(Millipore)上进行。

使用Millipak过滤器(Millipore)，将最后纯化的生物制药的药品经0.22μm过滤，以除去微生物。

该方法产生了具有使其作为生物制药使用的性质的氨基甲酰化EPO；

●以SEC-HPLC测定，聚合物/聚集物的含量为0.5％

●以氨基酸分析仪测定，氨基甲酰化赖氨酸为100％

●浓度＞0.5mg/ml

使用MALDI-TOF，对肽N糖苷酶处理的蛋白质和具有N-聚糖的蛋白质的完整质量的变化进行定性测定。此外，MALDI-TOF肽质量指纹图谱分析/LC-MS/MS分析操作如下：

1.将CEPO和EPO在POROS R1柱(POROS R1反相柱填料，PerSeptive Biosystems(1-1259-06))上纯化。该柱填料在使用前保存在供HPLC VWR 152525R的50％HiPerSolv中。将R1柱平衡并以5％甲酸(33015，Riedl de Haёn)洗。以安捷伦MALDI HCCA质量基质溶液(G2037A)将样品从柱上洗脱。通过在Bruker Reflex IV MALDI-TOF仪上分析测定完整质量。

2.以1单位的肽N糖苷酶F和肽N糖苷酶F/O-糖苷酶，将0.3pmol的CEPO和/或EPO处理过夜。使用MALDI-TOF测定总质量。

3.CEPO和EPO(1.5pmol)在50μl 10mM DTT、50mM NH₄CO₃的溶液中还原，随后在50μl 55mM碘乙酰胺、50mM NH₄CO₃中烷基化。在胰蛋白酶消化之前，在POROS R1柱上纯化样品。在MALDI-TOF分析(POROS 50 R2 PerSeptive Biosystems(1-1159-05))之前，将一部分消化的样品在POROS R2柱上纯化。平衡R2柱，并以0.1％三氟乙酸洗脱(99+％光谱级，Aldrich 302031-100ml)。以安捷伦MALDIHCCA质量基质溶液(G2037A)将样品从柱上洗脱。将胰蛋白酶消化获得的肽混合物用肽N糖苷酶F处理，再在POROS R2柱上纯化，并经MALDI-TOF表征。

4.CEPO和EPO在DTT的溶液中还原，并与碘乙酰胺烷基化。在Glu-C消化之前，在POROS R1柱上纯化样品。在MALDI-TOF分析之前，将一部分消化的样品在POROS R2柱上纯化。将Glu-C消化获得的肽混合物用肽N糖苷酶F处理，再在POROS R2柱上纯化，并经MALDI-TOF表征。

5.为了排除部分氨基甲酰化CE PO的可能性，将完整的EPO和CEPO用Lys-C消化。样品用MALDI-TOF分析。

结论是该8个赖氨酸和该N-末端被氨基甲酰化。未检测到其它氨基甲酰化的氨基酸，开且未检测到修饰的聚糖。

参考文献：

总体蛋白质的MS鉴定：

Mann M，Hojrup P，Roepstorff P.(1993)Use of mass spectrometricmolecular weight information to identify proteins in sequence databases，Biol Mass Spectrom 22，338-345。

Yates，J R，Speicher S，Griffin P R，Hunkapiller T.(1993)Peptidemass maps：a highly informative approach to protein identification，AnalBiochem 214，397-408。

完整质量：

Laugesen S，Roepstorff P.(2003)Combination of two matricesresults in improved performance of MALDI MS for peptide mass mappingand protein analysis.J Am Soc Mass Spectrom.14(9)，992-1002。

消化/接枝：

Larsen MR，Hojrup P，Roepstorff P.(2005)Characterization of gel-separated glycoproteins using two-step proteolytic digestion combinedwith sequential microcolumns and mass spectrometry.Mol CellProteomics.4(2)，107-19。

为了确定EPO氨基甲酰化的程度和均一度、氨基甲酰化的专一性和氨基甲酰化位置的鉴定、以及由于氨基甲酰化的副反应和纯化过程的潜在的不确定修饰的出现率，还进行了其它研究。样品分析是如下进行的：通过去糖基化蛋白质样品的总质量分析，以及通过使用内切蛋白酶LysC和胰蛋白酶消化的肽图及LC/MS分析对肽进行评价。

实施例2

总质量分析

使用实施例1的方法，对3个氨基甲酰化的EPO样品进行分析。在氨基甲酰化反应后，全部的3个样品使用阴离子交换纯化，如实施例1所述。一个CEPO样品(命名为CEPO-CMC)由CMC Biotech以1g的生产规模(浓度0.82mg/ml；缓冲液：20mM枸橼酸钠、0.3mM枸橼酸、0.1M NaCl、pH6.9-7.3)制备。其余两个样品命名为CEPO-1和CEPO-2，以70mg实验室生产规模(浓度：1.1mg/ml；缓冲液：25mMTris、0.2M NaCl、pH8.3-8.7)制备。这些CEPO样品与未修饰的或初始的EPO(浓度0.82mg/ml；缓冲液：2mM枸橼酸钠、0.3mM枸橼酸、0.1M NaCl、pH6.9-7.3)和模拟的CEPO(经过不加K-氰酸盐的氨基甲酰化过程的EPO)(浓度：0.38mg/ml；缓冲液：20mM枸橼酸钠、0.3mM枸橼酸、0.1M NaCI、pH6.9-7.3)进行比较。

ESI-质谱法

在总质量分析之前，将样品经酶去糖基化。在蛋白质浓度0.5mg/ml下，各样品与50μg来自A.ureafaciens的重组神经氨酸酶的N-糖苷酶F(来自Glyko的Prozyme)和O-糖苷酶孵化过夜。将每个样品向12％的Tris-甘氨酸凝胶中加载3μg，通过SDS-PAGE检查去糖基化反应的完全性。各样品的剩余物用于质量分析。

通过加入适宜体积的盐酸胍贮备溶液，将该去糖基化样品导入4-5M的盐酸胍浓缩液中，随后在含有2％甲酸和40％acenitril的缓冲液中脱盐。为了保证去糖基化EPO和CEPO质谱分析的高回收率而加入盐酸胍。用具有离子化ESI-纳米喷雾源的Waters ESI-Q-Tof-或WatersESI-LCT-质谱仪进行质量测定。通过自动反褶积法并通过使用MassLynx 4.0软件人工评价感兴趣的特征峰对数据进行评价。根据在m/z光谱上记录的信号强度，通过计算相对比，对不同的氨基甲酰化CEPO物质的相对比进行定量。

样品去糖基化致使N-连接糖完全除去。然而，O-连接糖的释放不完全，特别是对于CEPO样品。

正如所预期的，由于该氨基甲酰化，与EPO和模拟-CEPO样品相比，CEPO样品显示出不同的质谱。如表2所示，对于不同的样品，如理论上所预期的，光谱反褶积导致主峰聚集。在全部的CEPO样品中，仅发现高度氨基甲酰化的CEPO分子，其主要异型为具有8个赖氨酸和N-末端的完全氨基甲酰化的完全氨基甲酰化异型，即，9个氨甲酰基残基。CEPO样品显示出不均匀性，其含有与连接于CEPO的8、10和11个氨甲酰基残基相应的其它异型。含有8个氨甲酰基残基的物质命名为次-氨基甲酰化，缺少至少一个氨甲酰基残基。含有10和11个氨甲酰基残基的物质命名为过-氨基甲酰化，其中额外连接的氨甲酰基残基将以非特异性的方式与除赖氨酸以外的氨基酸结合。在所有样品的光谱上有一些较小的信号，但没有一个被认为是非-特异性地修饰的物质。在EPO和CEPO样品中发现一些较小的信号，并认为是已存在于初始EPO中的污染物。

表2

总质量分析获得的去糖基化CEPO-和EPO-样品的反褶积质量

样品	理论预计质量	测得质量	注释
				初始EPO	18239	18237	符合
模拟-CEPO	18239	18239	符合
				CEPO-CMC	18626(9x carb)	1858318626186691871118991	8x carb9x carb10x carb11x carb9x carb+O-糖
CEPO-1	18626(9x carb)	1858318626186691871118989	8x carb9x carb10x carb11x carb9x carb+O-糖
				CEPO-2	18626(9x carb)	1858418626186691871218992	8x carb9x carb10x carb11x carb9x carb+O-糖

表3显示不同异型的相对比。依据样品的总CEPO，次-氨基甲酰化CEPO的范围为约1.5～5.5％；并且依据样品，过-氨基甲酰化CEPO的范围为约11～22％。CEPO-1和CEPO-2具有相似的异型分布，而与其它两个样品相比，CEPO-CMC具有较少的次-氨基甲酰化物质。不同的制备规模所得的产品具有不同的分布，但如表3所示，对于实验室制备规模，可以以相似的结果重复制备。如前面讨论的，对任意给定的制备规模，通过调节来自阴离子交换柱的混合物而可以调节分布。

表3中的数表示次-和过-氨基甲酰化CEPO的最小比率。其原因是，氨基甲酰化的程度(8倍～11倍)可能不能指明次、完全和过-氨基甲酰化CEPO的准确程度。例如，根据质量分析测定的含有8个氨基甲酰基残基的CEPO分子可能仅有7个氨基甲酰基残基特异性地与赖氨酸结合，而剩余的氨基甲酰基残基将非特异性地与另一个氨基酸连接。即使有非特异性地结合的氨基甲酰基，仅认为这种情况是次-氨基甲酰化的。相反，含有10个氨基甲酰基残基的CEPO分子可能仅8个残基特异性地结合，2个非特异性结合。在这种情况下，尽管全部赖氨酸没有被氨基甲酰化，该CEPO异型只认为是过氨基甲酰化。

表3

氨基甲酰化的程度和不均匀性：不同氨基甲酰化CEPO物质的相对比

No.		相对含量
						氨基甲酰化的程度	CEPO-CMC*	CEPO-1*	CEPO-2**
1	8x carb	1.5％	5.1％	5.5％
					2	9x carb	77％	83.3％	83.6％
3	10x carb	19.8％	10.9％	10.2％
					4	11x carb	1.7％	0.7％	0.7％
5	∑No.2-4(＞9x)	98.5％	94.9％	94.5％
					6	∑No.3+4(过carb.)	21.5％	11.6％	10.9％

^*n＝2^**n＝1

实施例3

LysC肽图

使用内切蛋白酶LysC和胰蛋白酶裂解进行EPO和CEPO样品的肽图分析。所有肽图分析均以去糖基化肽进行。完成肽的酶去糖基化，同时以内切蛋白酶消化。

将EPO和CEPO样品(各约150μg)变性并通过与盐酸胍和DTT孵化而还原。游离的巯基与碘乙酸烷基化。使用单一凝胶过滤柱，将烷基化样品脱盐，并将缓冲液交换成适合的缓冲液。

将内切蛋白酶、N-糖苷酶和神经氨酸酶同时加至烷基化的EPO和CEPO样品中。样品在37℃下孵化过夜。孵化后，各消化液约5μg用于RP-HPLC/MS分析，使用Jupiter，Phenomenix的C18 RP-柱，配合Waters的ESI-LCT。记录220nM处的紫外信号和质谱仪上的总离子计数(TIC)。对于所得的肽的鉴别和定量，对该TIC进行评价。由于LysC不能裂解氨基甲酰化赖氨酸，可以预计，如果所有的赖氨酸被氨基甲酰化，以LysC消化将不会形成碎片，显示了氨基甲酰化的专一性。在次-氨基甲酰化的情况下，将形成特异性的CEPO碎片。表4列出了LysC消化EPO、完全和过-氨基甲酰化CEPO以及次-氨基甲酰化CEPO理论上形成的碎片。

表4

LysC肽图：肽/LysC消化EPO、完全或过-氨基甲酰化CEPO以及次-氨基甲酰化CEPO理论上形成的碎片的列表。

EPO

肽名称	氨基酸，从～到	质量	氨基酸序列
				K1	1-20	2399.3	APPR LIDSRVLER YLLEAK
K2	21-45	2804.2	EANITTGCAEHCSLNENEITVPDDTK
				K3	46-52	926.5	VNFYAWK
K4	53-97	5022.7	RMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHVDK
				K5	98-116	1954.2	AVSGLRSLTTLLRALGAQK
K6(+O-糖)	117-140	2863.3	EAISPPDAASAAPLR TITADTFR K
				K7	141-152	1498.8	LFR VYSNFLRGK
K8	153-154	259.2	LK
				K9	155-165	1242.5	LYTGEACRTGD

CEPO(完全氨基甲酰化和过-氨基甲酰化)

碎片名称	氨基酸，从～到	质量
			CEPO(9x carb)	1-165	19227
CEPO(10x carb)	1-165	19270
			CEPO(11x carb)	1-165	19313

次-氨基甲酰化CEPO(8x氨基甲酰化)

非-氨基甲酰化氨基	N-末端碎片的预期质量	C-末端碎片的预期质量
			无(9×氨基甲酰化)	19227	--
N-末端	19184	--
			Lys20	2443.9	16755.9
Lys45	5274.9	13924.8
			Lys52	6227.0	12972.7
Lys97	11276.8	7923.0
			Lys116	13257.1	5942.6
Lys140	16147.2	3052.4
			Lys152	17672.0	1527.5
Lys154	17956.4	1244.3

正如所预期的，对于用LysC消化的EPO和CEPO样品的LysC肽图完全不同。以LysC消化的起始EPO和模拟-CEPO得到的肽图与预期的一样。在两种样品中，全部的肽K1～K9均可以被鉴别。在EPO和模拟-CEPO中，肽K5和K1部分的以不确定的方式裂解。与初始EPO相比，在模拟-CEPO的LysC图中，未鉴别到明显的附加峰，也没有峰丢失。从这些数据可以得出结论，即在氨基甲酰化和纯化过程期间，没有发生明显的EPO蛋白质的非特异性共价修饰。

CEPO样品肽图与初始EPO肽图不同。其有一个单一的主峰和有一些小峰。如表5所示，对于未裂解CEPO或从LysC裂解的次-氨基甲酰化CEPO的碎片，从峰测得的质量与预期质量有良好的相关性。主峰(A)包含完整的、去糖基化的、完全氨基甲酰化CEPO(9x氨甲酰基)和过-氨基甲酰化CEPO(10x氨甲酰基)(表5)。4个较小峰(B-E)包含次-氨基甲酰化CEPO(8x氨甲酰基)，含有次-氨基甲酰化CEPO的不同峰在某些赖氨酸上未氨基甲酰化。峰B和C含有尤其在Lys45处氨基甲酰化不足的次-氨基甲酰化CEPO，而峰D和E含有尤其在Lys97处氨基甲酰化不足的次-氨基甲酰化CEPO(表5)。

表5

LysC肽图：实验测得质量与次-氨基甲酰化CEPO理论所得CEPO碎片的归属

峰号	测得质量	注释	预期质量
				A	1922819271	CEPO(9x carb+O-糖)CEPO(10x carb+O-糖)	1922719270
B	1886713926	CEPO(9x carb w/oO-糖)CEPO-碎片(aa46-165)	1886213924.3
				C	5276	CEPO-碎片(aa1-45)	5274.8
D	7924	CEPO-碎片	7922.4
						(aa98-165)
E	11279	CEPO-碎片(aa1-97)	11276.6

不同的CEPO样品峰的相对比之间有一定的差异。与CEPO-CMC相比，CEPO样品1和2具有更多的主峰D和E，表明它们含有更多的次-氨基甲酰化CEPO物质。

由于技术局限，与主峰一样，对较小峰进行定量是困难的。然而，使用UV-检测的峰面积作为不同种的相对比的原始指标，可以估计出，次-氨基甲酰化CEPO占样品中CEPO异型的量可能小于10％，并且与CEPO-CMC相比，CEPO-1和CEPO-2有2倍量的的次-氨基甲酰化异型。使用与用于总质量分析相同的方法，位于峰A中的过-氨基甲酰化物质的测定量为CEPO-CMC中约21％，CEPO-1和CEPO-2中约12％。

总的来说，LysC肽图数据与实施例2所述的总质量分析相当一致。CEPO-CMC含有较少的次-氨基甲酰化CEPO异型，而CEPO-1和CEPO-2含有更多的过-氨基甲酰化CEPO异型。该肽图还表明，赖氨酸45和赖氨酸97表示次-氨基甲酰化的位置。

实施例4

胰蛋白酶肽图

应用胰蛋白酶消化样品描述于实施例3。

用胰蛋白酶消化的EPO和模拟CEPO产生了预期的肽图。在两个样品中，如胰蛋白酶消化所预期的，除了一些小的二-和三-肽(例如T 21)以外，大部分的肽(T1～T 21)可以被鉴别。见表6。在以LysC消化的情况下，与初始EPO相比，无明显的附加峰，也没有峰从模拟-CEPO中丢失。从这些数据可以得出结论，即在氨基甲酰化和纯化过程期间，没有非特异性的EPO蛋白质共价修饰。

CEPO样品的肽图与未修饰EPO不同。胰蛋白酶通常在赖氨酸和精氨酸处裂解，这样，可以预期，在完全氨基甲酰化EPO的情况下，仅通过精氨酸的裂解而发生碎片。因此，以胰蛋白酶获得肽图后，可以鉴别出特异性氨基甲酰化的位置和非特异性氨基甲酰化的肽。假定仅在精氨酸(R)处裂解，由CEPO分子的胰蛋白酶消化的预期肽列于表6。

表6

以胰蛋白酶消化EPO和CEPO的预期肽列表

EPO

肽名称	氨基酸，从-到	质量(MH)	氨基酸序列
				T1	1-4	439.3	APPR
T2	5-10	763.4	LICDSR
				T3	11-14	513.3	VLER
T4	15-20	735.4	YLLEAK
				T5	21-45	2806.2	EANITTGCAEHCSLNENITVPDDTK
T6	46-52	926.5	VNFYAWK
				T7	53-53	174.1	R
T8	54-76	2525.3	MEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLR

T9	77-97	2359.2	GQALLVNSSQPWEPLQLHVDK
				T10	98-103	601.4	AVSGLR
T11	104-110	802.5	SLTTLLR
				T11	111-116	586.3	ALGAQK
T13(+O-糖)	117-131	1829.8	EAISPPDAASAAPLR
				T14	132-139	923.5	TITADTFR
T15	140-140	146.1	K
				T16	141-143	434.3	LFR
T17	144-150	897.5	VYSNFLR
				T18	151-152	203.1	GK
T19	153-154	259.2	LK
				T20	155-162	969.4	LYTGEACR
T21	163-165	291.1	TGD

CEPO(假定由于完全的氨基甲酰化，仅在Arg(R)处裂解)

肽名称	氨基酸，从-到	质量(MH)	氨基酸序列
				R1(1x carb)	1-4	482.3	APPR
R2	5-10	763.4	LICDR
				R3	11-14	515.3	VLER
R4(3x carb)	15-53	4717.2	YLLEAKEANITTGCAEHCSLNENITVPDDTKVNFYAWKR
				R5	54-76	2525.3	MEVGQAVEVWQGLALLSEAVLR
R6(1x carb)	77-103	2985.3	GQALLVNSSQPW

			EPLQLHVDKAVSGLR
				R7	104-110	802.5	SLTTLLR
R8(1x carb)(+O-糖)	111-131	2441.1	ALGAQKEAISPPDAASAAPLR
				R9	132-139	923.5	TITADTFR
R10(1x carb)	140-143	605.4	KLFR
				R11	144-150	897.5	VYSNFLR
R12(2x carb)	151-162	1481.7	GKLKLYTGEACR
				R13	163-165	291.1	TGD

除了C-末端肽R13以外，如同所有CEPO样品主峰一样，预期由胰蛋白酶裂解的全部肽被鉴别。也没有在初始EPO或模拟-CEPO中发现这种肽。仅由精氨酸特异性裂解产生的R1～R12峰占CEPO样品检测出的肽的绝大部分。此外，所有含有赖氨酸的肽几乎仅在完全氨基甲酰化形式中被检测出。这些数据表明在赖氨酸和N-末端的高度特异性氨基甲酰化。

除了主要的肽以外，在全部CEPO样品中还检测出了6个较小的肽。3个较小的肽通过质量分析被鉴别，其为过-氨基甲酰化CEPO胰蛋白酶裂解的产物，其余3个由次-氨基甲酰化CEPO产生。

表7列表分析了在3个CEPO样品胰蛋白酶图中鉴别的全部肽。由完全的和特异性的氨基甲酰化EPO形成的大量的肽R1～R12为正体字母，正确的氨基甲酰化EPO另以粗体表示。极有可能由次-氨基甲酰化CEPO裂解形成的肽以斜体表示，由过-氨基甲酰化CEPO裂解形成的肽以下划线表示。

表7

胰蛋白酶肽图：CEPO的胰蛋白酶肽图鉴别的肽列表

肽	质量	相对离子数(％)*CEPO-1	相对离子数(％)*CEPO-2	相对离子数(％)*CEPO-CMC
					R1_1xcarb	482.25	1.28	1.09	1.15
R2	763.35	7.87	8.49	8.15
					R3	515.31	2.78	2.58	2.66
R4_b1_1xcarb(T6+T7_1xcarb	1125.6	0.17	0.2	0.15
					R4_3xcarb	4717.2	1.5	0.80	1.32
R5	2525.34	11.44	9.56	9.54
					R5_ox	2541.34	0.15	0.15	0.21
R5_Na	2547.32	0.15	0.13	0.14
					R5_a1	1869.97	0.17	0.17	0.16
R5_b1	673.38	0.29	0.27	0.25
					T9＝R6_a1	2359.24	0.62	0.54	0.26
T10＝R6_b1	602.35	0.95	0.8	0.65
					R6_1xcarb	2985.60	15.36	14.48	15.78
R7	802.49	7.16	7.28	7.05
					R7_1xcarb	845.49	+1	+1	+1
R8_1xcarb	2076.10	0.16	0.15	0.16
					R8_1xcarb	2076.10	0.5	0.44	0.63
R8_SA0_1xcarb	2441.1	9.19	9.34	9.20

R9	923.47	9.85	11.11	10.58
					R10_1xcarb	605.37	5.17	5.40	5.43
R10_2xcarb	648.37	0.02	0.03	0.03
					R11	897.47	9.82	10.70	10.30
R12_a1_2xcarb	806.46	0.20	0.22	0.17
					R12_2xcarb	1481.73	7.91	7.90	7.84
R12_3xcarb	1524.74	0.28	0.26	0.59
					R13	291.11	--	--	--

^*-与TIC中总数目相关的强度

1-人工评价测得；信号证实为特异性的

参照表7，较小峰T9和T10分别含有肽R6_a1和R6_b1，极有可能来自次-氨基甲酰化CEPO分子的裂解，其在Lys97未氨基甲酰化。如果Lys45氨基酸未氨基甲酰化则形成肽R4_b1+1xcarb。在CEPG-1和CEPO-2样品中的肽R6_a1(峰T9)比CEPO-CMC中的量更大，表明前者有双倍量的次-氨基甲酰化CEPO。在所有CEPO样品中，肽R6_b1和R4_b1+1xcarb具有相等的量。

由于技术局限，从这些数据计算次-氨基甲酰化CEPO的相对含量是困难的。然而，将所有观察结果放在一起，可估算出次-氨基甲酰化物质为约10％，它是从总质量分析和LysC肽图推论的。

由于含有一个额外的氨甲酰基残基即过-氨基甲酰化CEPO，与其它肽共同被洗脱的另外3个较小的肽通过质量来说明。肽R10_2xcarb和R7_1xcarb检测出痕量，而R12_3xcarb测出具有明显的信号强度。如同CEPO-1和CEPO-2，CEPO-CMC具有2倍高的过-氨基甲酰化CEPO物质的含量。这与由总质量分析所得的结果一致。从这些数据还可以推断，EPO的151-62的氨基酸序列是一个非特定的氨基甲酰化的位置。

此外，与次-氨基甲酰化的定量原因相同，过-氨基甲酰化物质的定量也是困难的。然而，假定肽的离子化效率是相似的，仅在氨基甲酰化程度方面不同，通过R12-衍生物的相对离子数，可以计算出约3-7％的CEPO是过-氨基甲酰化物质。其低于通过总质量分析计算的过-氨基甲酰化异型的量。

根据EPO和CEPO的总质量分析和肽图数据，大体上可以得出以下结论。

根据总质量分析，CEPO样品呈现相当高程度的氨基甲酰化。约全部分子的95-98％完全氨基甲酰化，并含有至少9个氨甲酰基残基(见表3)。LysC和胰蛋白酶图谱证实了在特定位置的高度氨基甲酰化，并且极有可能超过95％的CEPO分子是在8赖氨酸和N-末端完全氨基甲酰化。

该数据还显示发现4个CEPO的异型。在CEPO样品分析中发现具有8、9、10和11个氨甲酰基残基的物质，9氨甲酰基异型为优势种(dominant species)。小部分CEPO分子含有8个氨甲酰基残基，而不是9个，并认为是次-氨基甲酰化。对于CEPO-1和CEPO-2，这些异型约为总体的5％，对于CEPO-CMC，该异型约为总CEPO分子的1.5％。

CEPO分子的更重要部分是过-氨基甲酰化的，即，含有10或11个氨甲酰基残基。过-氨基甲酰化CEPO范围为，从CEPO-1和CEPO-2的约11％，至CEPO-CMC的约22％。

由肽图的数据说明在8赖氨酸和N-末端氨基甲酰化的高度专一性。此外，肽图一般性地证明了总质量分析的结果。在全部赖氨酸和N-末端，至少约90-95％的CEPO分子显示被氨甲酰基残基特异性地修饰。然而，该数据还显示了次-和过-氨基甲酰化CEPO物质。由于某些技术限制，次-氨基甲酰化物质的准确比率是难以测定的，但是估计其范围高达约10％，这与在总质量分析中测得的数一致。此外，在EPO上的两个不同的位置，Lys45和Lys97被认为是极有可能发生氨基甲酰化不足的一个。

在两套肽图中还发现了过-氨基甲酰化物质。此外，由于技术的限制，过-氨基甲酰化物质的准确量是难以测定的。根据获得的数据，可以推测，在肽图中可检测出太少的过-氨基甲酰化物质。与总质量分析相比，过-氨基甲酰化物质仅有三分之一到二分之一的量通过肽图被鉴定。该偏差的合理解释是，并非全部的过-氨基甲酰化肽以全部或以适宜量被鉴定。在LysC谱图中，检测出显著量的含有10个氨甲酰基残基的未裂解CEPO物质，而且在胰蛋白酶图谱中检测出三个肽，其包含一个额外的氨甲酰基残基。其中两个碎片仅检测出痕量。接近于C-末端的第三个肽，CEPO肽氨基酸152-162，显示其占过-氨基甲酰化的三分之一，并且可能是EPO中一个非特异性氨基甲酰化的位置。

在CEPO样品或在模拟CEPO样品中，通过任何分析过程，未检测出显著量的其它非特异性(与氨甲酰基无关)修饰。

Claims (126)

1.一种制备通过ESI-质谱法测定具有小于约40％的聚集蛋白质和小于约40％重量的过-和次-氨基甲酰化蛋白质的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质的方法，所述方法包括，在一定温度、pH下和一定时间内，将一定量的促红细胞生成素与一定量的氰酸盐接触，上述条件足以使促红细胞生成素的赖氨酸上的氨基和N-末端氨基酸变成至少约90％的氨基甲酰化。

2.权利要求1的方法，其中所述的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质是人促红细胞生成素。

3.权利要求1的方法，其中所述的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质具有小于约30％的聚集蛋白质。

4.权利要求1的方法，其中所述的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质具有小于约20％的聚集蛋白质。

5.权利要求1的方法，其中所述的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质具有小于约10％的聚集蛋白质。

6.权利要求1的方法，其中所述的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质具有小于约30％重量的过-和次-氨基甲酰化蛋白质。

7.权利要求1的方法，其中所述的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质具有小于约20％重量的过-和次-氨基甲酰化蛋白质。

8.权利要求1的方法，其中所述的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质具有小于约10％重量的过-和次-氨基甲酰化蛋白质。

9.权利要求1的方法，其中所述的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质具有小于约30％重量的过-氨基甲酰化蛋白质。

10.权利要求1的方法，其中所述的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质具有小于约20％重量的过-氨基甲酰化蛋白质。

11.权利要求1的方法，其中所述的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质具有小于约10％重量的过-氨基甲酰化蛋白质。

12.权利要求1的方法，其中所述的与氰酸盐接触的促红细胞生成素蛋白质的浓度是约0.05mg/ml～约10mg/ml。

13.权利要求1的方法，其中所述的与氰酸盐接触的促红细胞生成素蛋白质的浓度是约2mg/ml～约5mg/ml。

14.权利要求1的方法，其中所述的氰酸盐的浓度是约0.05M～约10M。

15.权利要求1的方法，其中所述的氰酸盐的浓度是约0.05M～约2M。

16.权利要求1的方法，其中所述的温度是约0℃～约60℃。

17.权利要求1的方法，其中所述的温度是约30℃～约34℃。

18.权利要求1的方法，其中所述的pH是约7约11。

19.权利要求1的方法，其中所述的pH是约8约10。

20.权利要求1的方法，其中所述的时间是约10分钟～约30天。

21.权利要求1的方法，其中所述的时间是约1小时～约5天。

22.权利要求1的方法，其中所述的促红细胞生成素蛋白质是在缓冲液的存在下与氰酸盐接触。

23.权利要求22的方法，其中所述的缓冲液是硼酸盐。

24.权利要求22的方法，其中所述的缓冲液的浓度是约0.05M～约2M。

25.权利要求22的方法，其中所述的缓冲液的浓度是约0.1M～约1M。

26.权利要求22的方法，其中所述的缓冲液的浓度是约0.5M。

27.权利要求1的方法，其中所述的与氰酸盐接触的促红细胞生成素蛋白质的浓度是约0.05mg/ml～约10mg/ml，所述的氰酸盐的浓度是约0.05M～约10M，所述的温度是约0℃～约60℃，所述的pH是约7约11，并且所述的时间是约10分钟～30天。

28.权利要求1的方法，其中所述的与氰酸盐接触的促红细胞生成素蛋白质的浓度是约2mg/ml～约5mg/ml，所述的氰酸盐的浓度是约0.05M～约2M，所述的温度是约30℃～约34℃，所述的pH是约8约10，并且所述的时间是约1小时～5天。

29.权利要求1的方法，其中所述的与氰酸盐接触的促红细胞生成素蛋白质的浓度是约3mg/ml，所述的氰酸盐的浓度是约0.5M，所述的温度是约32℃，所述的pH是约9.0，并且所述的时间是约24小时。

30.一种制备通过ESI-质谱法测定具有小于约3％的聚集蛋白质和小于约40％重量的过-和次-氨基甲酰化蛋白质的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质的方法，包括使用阴离子交换、阳离子交换、疏水交换色谱、反相色谱、亲合色谱或分子排阻色谱纯化所述的氨基甲酰化促红细胞生成素。

31.权利要求30的方法，其中所述的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质是人促红细胞生成素。

32.权利要求30的方法，其中至少约90％的促红细胞生成素的赖氨酸和N-末端氨基酸上的胺基残基被氨基甲酰化。

33.权利要求30的方法，其中所述的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质具有小于约2.5％的聚集蛋白质。

34.权利要求30的方法，其中所述的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质具有约0.5％或更少的聚集蛋白质。

35.权利要求30的方法，其中所述的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质具有小于约30％重量的过-和次-氨基甲酰化蛋白质。

36.权利要求30的方法，其中所述的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质具有小于约20％重量的过-和次-氨基甲酰化蛋白质。

37.权利要求30的方法，其中所述的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质具有小于约10％重量的过-和次-氨基甲酰化蛋白质。

38.权利要求30的方法，其中所述的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质具有小于约30％重量的过-氨基甲酰化蛋白质。

39.权利要求30的方法，其中所述的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质具有小于约20％重量的过-氨基甲酰化蛋白质。

40.权利要求30的方法，其中所述的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质具有小于约10％重量的过-氨基甲酰化蛋白质。

41.一种制备通过ESI-质谱法测定具有小于约3％的聚集蛋白质和小于约40％重量的过-和次-氨基甲酰化蛋白质的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质的方法，该方法包括：

(a)在一定温度、pH下和一定时间内，将一定量的促红细胞生成素蛋白质与一定量的氰酸盐接触，上述条件足以使促红细胞生成素的赖氨酸上的氨基残基和N-末端氨基酸的至少约90％变成氨基甲酰化；和

(b)使用阴离子交换、阳离子交换、疏水交换色谱、反相色谱、亲合色谱或分子排阻色谱纯化所述的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质。

42.权利要求41的方法，其中所述的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质是人促红细胞生成素。

43.权利要求41的方法，其中所述的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质具有小于约2.5％的聚集蛋白质。

44.权利要求41的方法，其中所述的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质具有约0.50％或更少的聚集蛋白质。

45.权利要求41的方法，其中所述的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质具有小于约30％重量的过-和次-氨基甲酰化蛋白质。

46.权利要求41的方法，其中所述的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质具有小于约20％重量的过-和次-氨基甲酰化蛋白质。

47.权利要求41的方法，其中所述的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质具有小于约10％重量的过-和次-氨基甲酰化蛋白质。

48.权利要求41的方法，其中所述的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质具有小于约30％重量的过-氨基甲酰化蛋白质。

49.权利要求41的方法，其中所述的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质具有小于约20％重量的过-氨基甲酰化蛋白质。

50.权利要求41的方法，其中所述的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质具有小于约10％重量的过-氨基甲酰化蛋白质。

5 1.权利要求41的方法，其中所述的与氰酸盐接触的促红细胞生成素蛋白质的浓度是约0.05mg/ml～约10mg/ml。

52.权利要求41的方法，其中所述的与氰酸盐接触的促红细胞生成素蛋白质的浓度是约2mg/ml～约5mg/ml。

53.权利要求41的方法，其中所述的与氰酸盐接触的促红细胞生成素蛋白质的浓度是约3mg/ml。

54.权利要求41的方法，其中所述的氰酸盐的浓度是约0.05M～约10M。

55.权利要求41的方法，其中所述的氰酸盐的浓度是约0.05M～约2M。

56.权利要求41的方法，其中所述的氰酸盐的浓度是约0.5M。

57.权利要求41的方法，其中所述的温度是约0℃～约60℃。

58.权利要求41的方法，其中所述的温度是约30℃～约34℃。

59.权利要求41的方法，其中所述的温度是约32℃。

60.权利要求41的方法，其中所述的pH是约7约11。

61、权利要求41的方法，其中所述的pH是约8～约10。

62.权利要求41的方法，其中所述的pH是约9。

63.权利要求41的方法，其中所述的时间是约10分钟～约30天。

64.权利要求41的方法，其中所述的时间是约1小时～约5天。

65.权利要求41的方法，其中所述的时间是约24小时。

66.权利要求41的方法，其中所述的促红细胞生成素蛋白质是在缓冲液的存在下与氰酸盐接触。

67.权利要求66的方法，其中所述的缓冲液是硼酸盐。

68.权利要求66的方法，其中所述的缓冲液的浓度是约0.05M～约2M。

69.权利要求66的方法，其中所述的缓冲液的浓度是约0.1M～约1M。

70.权利要求66的方法，其中所述的缓冲液的浓度是约0.5M。

71.权利要求41的方法，其中所述的与氰酸盐接触的促红细胞生成素蛋白质的浓度是约0.05mg/ml～约10mg/ml，所述的氰酸盐的浓度是约0.05M～约10M，所述的温度是约0℃～约60℃，所述的pH是约7约11，并且所述的时间是约10分钟～30天。

72.权利要求41的方法，其中所述的与氰酸盐接触的促红细胞生成素蛋白质的浓度是约2mg/ml～约5mg/ml，所述的氰酸盐的浓度是约0.05M～约2M，所述的温度是约30℃～约34℃，所述的pH是约8约10，并且所述的时间是约1小时～5天。

73.权利要求41的方法，其中所述的与氰酸盐接触的促红细胞生成素蛋白质的浓度是约3mg/ml，所述的氰酸盐的浓度是约0.5M，所述的温度是约32℃，所述的pH是约9.0，并且所述的时间是约24小时。

74.氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质，通过ESI-质谱法测定，其具有赖氨酸伯胺和氨基末端氨基酸的至少约90％的氨基甲酰化，小于约3％的聚集蛋白质以及小于约40％重量的过-和次-氨基甲酰化蛋白质。

75.权利要求74的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质，其中所述的促红细胞生成素蛋白质是人促红细胞生成素。

76.权利要求74的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质，其具有小于约2.5％的聚集蛋白质。

77.权利要求74的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质，其具有约0.5％或更少的聚集蛋白质。

78.权利要求74的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质，其中所述的聚集蛋白质的量是通过SEC-HPLC测定。

79.权利要求74的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质，其具有小于约30％重量的过-和次-氨基甲酰化蛋白质。

80.权利要求74的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质，其具有小于约20％重量的过-和次-氨基甲酰化蛋白质。

81.权利要求74的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质，其具有小于约10％重量的过-和次-氨基甲酰化蛋白质。

82.权利要求74的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质，其具有小于约30％的过-氨基甲酰化蛋白质。

83.权利要求74的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质，其具有小于约20％的过-氨基甲酰化蛋白质。

84.权利要求74的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质，其具有小于约10％的过-氨基甲酰化蛋白质。

85.一种化合物，包括氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质，其具有赖氨酸伯胺和氨基末端氨基酸的至少约90％的氨基甲酰化，小于约40％的聚集蛋白质和一定量的氰酸盐。

86.权利要求85的化合物，其中所述的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质是人促红细胞生成素。

87.权利要求85的化合物，其中所述的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质具有小于约30％的聚集蛋白质。

88.权利要求85的化合物，其中所述的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质具有小于约20％的聚集蛋白质。

89.权利要求85的化合物，其中所述的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质具有小于约15％的聚集蛋白质。

90.权利要求85的化合物，其中所述的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质具有小于约10％的聚集蛋白质。

91.权利要求85的化合物，其中所述的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质具有约7％或更少的聚集蛋白质。

92.权利要求85的化合物，其中所述的聚集蛋白质的量是通过SEC-HPLC测定。

93.一种氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质，通过ESI-质谱法测定，其具有赖氨酸伯胺和氨基末端氨基酸的至少约90％的氨基甲酰化，小于约3％的聚集蛋白质和小于约40％重量的过-和次-氨基甲酰化蛋白质，其为包括以下步骤的方法的产品：

(a)在一定温度、pH下和一定时间内，将一定量的促红细胞生成素蛋白质与一定量的氰酸盐接触，上述条件足以使促红细胞生成素的赖氨酸氨基残基和N-末端氨基酸的至少约90％变成氨基甲酰化；和

(b)使用阴离子交换、阳离子交换、疏水交换色谱、反相色谱、亲合色谱或分子排阻色谱纯化所述的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质。

94.权利要求93的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质，其中所述的促红细胞生成素蛋白质是人促红细胞生成素。

95.权利要求93的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质，其具有小于约2.5％的聚集蛋白质。

96.权利要求93的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质，其具有约0.5％或更少的聚集蛋白质。

97.权利要求93的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质，其中所述的聚集蛋白质的量是通过SEC-HPLC测定。

98.权利要求93的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质，其具有小于约30％重量的过-和次-氨基甲酰化蛋白质。

99.权利要求93的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质，其具有小于约20％重量的过-和次-氨基甲酰化蛋白质。

100.权利要求93的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质，其具有小于约10％重量的过-和次-氨基甲酰化蛋白质。

101.权利要求93的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质，其具有小于约200％重量的过-氨基甲酰化蛋白质。

102.权利要求93的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质，其具有小于约10％重量的过-氨基甲酰化蛋白质。

103.权利要求93的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质，其具有小于约5％重量的过-氨基甲酰化蛋白质。

104.权利要求93的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质，其中所述的方法包括，所述的与氰酸盐接触的促红细胞生成素蛋白质的浓度是约3mg/ml，所述的氰酸盐的浓度是约0.5M，所述的温度是约32℃，所述的pH是约9.0，并且所述的时间是约24小时。

105.一种药物组合物，包括治疗有效量的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质，其具有赖氨酸伯胺和氨基末端氨基酸的至少约90％的氨基甲酰化，小于约3％的聚集蛋白质以及小于约40％重量的过-和次-氨基甲酰化蛋白质，和可药用的载体。

106.权利要求105的药物组合物，其中所述的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质是人促红细胞生成素。

107.权利要求105的药物组合物，其中所述的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质具有小于约2.5％的聚集蛋白质。

108.权利要求105的药物组合物，其中所述的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质具有约0.5％或更少的聚集蛋白质。

109.权利要求105的药物组合物，其中所述的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质具有小于约30％重量的过-和次-氨基甲酰化蛋白质。

110.权利要求105的药物组合物，其中所述的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质具有小于约20％重量的过-和次-氨基甲酰化蛋白质。

111.权利要求105的药物组合物，其中所述的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质具有小于10％重量的过-和次-氨基甲酰化蛋白质。

112.权利要求105的药物组合物，其中所述的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质具有小于约30％重量的过-氨基甲酰化蛋白质。

113.权利要求105的药物组合物，其中所述的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质具有小于约20％重量的过-氨基甲酰化蛋白质。

114.权利要求105的药物组合物，其中所述的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质具有小于约10％重量的过-氨基甲酰化蛋白质。

115.权利要求105的药物组合物，其中所述的氨基甲酰化促红细胞生成素蛋白质具有小于约5％重量的过-氨基甲酰化蛋白质。

116.权利要求105的药物组合物，其中所述的载体是稀释剂、辅助剂或赋形剂。

117.一种治疗慢性症状或疾病的方法，包括给予权利要求105的药物组合物。

118.一种治疗亚慢性症状或疾病的方法，包括给予权利要求105的药物组合物。

119.一种治疗急性症状或疾病的方法，包括给予权利要求105的药物组合物。

120.一种治疗中枢神经系统或周围神经系统的疾病的方法，包括给予权利要求105的药物组合物。

121.权利要求120的方法，其中所述的疾病是休克、局部缺血事件、脊髓损伤、外伤性脑损伤、多发性硬化症、肌萎缩性侧索硬化、阿耳茨海默氏病、精神分裂症或化学治疗诱发的神经病。

122.根据权利要求74的化合物在制备包含所述化合物的药物组合物中的用途，用于治疗慢性症状或疾病。

123.根据权利要求74的化合物在制备包含所述化合物的药物组合物中的用途，用于治疗亚慢性症状或疾病。

124.根据权利要求74的化合物在制备包含所述化合物的药物组合物中的用途，用于治疗急性症状或疾病。

125.根据权利要求74的化合物在制备包含所述化合物的药物组合物中的用途，用于治疗中枢神经系统或周围神经系统的疾病。

126.根据权利要求125的用途，其中所述的疾病是休克、局部缺血事件、脊髓损伤、外伤性脑损伤、多发性硬化症、肌萎缩性侧索硬化、阿耳茨海默氏病、精神分裂症或化学治疗诱发的神经病。

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