JPH04173744A

JPH04173744A - 神経細胞保護剤

Info

Publication number: JPH04173744A
Application number: JP2298036A
Authority: JP
Inventors: Shinichi Kosaka; 高坂　新一; Yasushi Nakao; 裕史中尾
Original assignee: Kowa Co Ltd
Current assignee: Kowa Co Ltd
Priority date: 1990-11-02
Filing date: 1990-11-02
Publication date: 1992-06-22
Anticipated expiration: 2016-05-21
Also published as: JP3167714B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は神経細胞保護剤に関し、更に詳細には神経細胞
に対し成長栄養因子として作用することにより神経細胞
を障害等から保護し、各種神経機能障害の予防又は治療
に有用な医薬に関する。

〔従来の技術〕

中枢神経系細胞の分化、成長、及び機能維持に働く因子
が種々の組織や細胞の培養液及び抽出液より神経成長栄
養因子として見出されてきた。これらの因子は神経系の
発達過程で、神経細胞から軸索を伸長させ、神経支配さ
れるべき標的組織に適確に軸索を誘導したり、分裂増殖
した多数の細胞のうち必要なものだけを生存させ、最終
的にシナプス形成による神経支配を確立せしめる役割を
担っていると考えられる。

即ち、神経成長因子（ＮＧＦ）や脳由来神経栄養因子が
脳の中で生産され、それぞれ中枢のコリン作動性ニュー
ロン（神経細胞）とを髄後根神経節の知覚ニューロンの
機能維持に働いていると思われる。ＮＧＦに対する抗体
を、新生動物あるいは胎児期に投与すると、それぞれ交
感神経節の著しい萎縮と、知覚神経の崩壊が起こる。Ｎ
ＧＰを新生ラットの脳内に投与すると、神経線維が交感
神経節から伸長し、脳とを髄に侵入することが認められ
た。

更に、脳の中隔野のコリン作動性神経細胞に作用して細
胞内のコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）活
性やアセチルコリンエステラーゼ活性を上昇させること
が報告されている。

一方、アルツハイマー型痴呆症の原因としてマイネルト
基底核の障害によりコリン作動性神経障害が想定され、
大脳皮質でのＣＡＴやアセチルコリンエステラーゼ活性
の著しい低下が報告されている。従って、ＮＧＦがアル
ツハイマー病の治療に有効ではないかと期待される。実
際に、中隔野−海馬投射路の切断によって、約半分に減
じるコリン作動性神経細胞をＩＩＧＦの投与で防止でき
ることが知られている。更に、ＮＧＦの脳内投与により
老齢ラットにおけるコリン作動性ニューロンの萎縮や記
憶の障害が改善されたという報告もある。この様に、Ｎ
ＧＦは神経系の発生過程における分化促進因子としての
作用と成熟後の機能維持作用とを持っており、痴呆症な
どの予防・治療剤として有望である。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、このようなＮＧＦ等の神経成長栄養因子
は神経系の分化促進や機能維持等の神経細胞保護作用を
有するにもかかわらず、生体内に極めて微量存在するに
すぎず、単離は非常に困難であるため、これらの因子を
直接医薬として利用することはできなかった。

従って、本発明は大量に入手でき、神経系の成長栄養因
子として作用する新たな医薬を提供することを目的とす
る。

〔課題を解決するための手段〕

かかる実状において、本発明者らは上記課題を解決すべ
く鋭意研究を行なってきたところ、ヒト胎盤由来抗血液
凝固物質として知られているＣＰＢ−■が神経細胞成長
栄養因子として働き、優れた神経細胞保護作用を有する
ことを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明はヒトＣＰＢ−１又はリコンビナン）
　ＣＰＢ−Ｉを有効成分とする神経細胞保護剤を提供す
るものである。

本発明神経細胞保護剤の有効成分であるＣＰＢ−１はヒ
ト胎盤をはじめとする生体内の組織及び分泌液に広く分
布しくＣｈｅｍ、　Ｐｈａｒｍａ、　Ｂｕｌｌ、　３８
．１９５７〜１９６０．１９９０）　、また細胞内では
細胞質に存在する抗血液凝固作用等の生理活性を有する
物質である。

［’ＦＢ−Ｉはヒトあるいは動物の臓器から抽出するこ
とができ（特開昭６２−１７４０２３号公報）、このよ
うにして得られたＣＰＢ−Ｉは以下の性質を有する。

■　分子量（ＳＯ３−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法、還元状！！り３４、０００±２．０００ ■　等電点（アンフオライトを用いる等電点カラム電気
泳動法）４．７±０．１ ■　安定性（イ）５０℃、３０分加熱処理で失活（ロ）ｐｉ（４〜ｌＯで安定（ハ）血漿中３７℃、３０分で安定 ■　血液凝固系に対する作用（イ）カルシウム回加凝固時間を延長（ロ）プロトロンビン時間を延長（ハ）活性化部分トロンボプラスチン時間を延長 ■　アミノ酸分析アミノ酸分析で、アスパラギン酸、スレオニン、セリン
、グルタミン酸、プロリン、グリシン、アラニン、ｌ／
２　シスチン、バリン、メチオニン、インロイシン、ロ
イシン、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、リ
ジン及びアルギニンの存在が認められる。

また、ＣＰＢ−Ｉはヒト又は動物のＣＰＢ−Ｉをコード
する遺伝子断片を用いて、遺伝子組換え技術により大腸
菌で発現させることができる（特開昭６４＝２００９５
号公報）。このように遺伝子組換えにより得られたＣＰ
Ｓ−Ｉ　　（以下、これを「リコンビナントＣＰＢ−Ｉ
　Ｊという）は下記のアミノ酸配列を有する。

以下余白Ａｌａ−Ｇｉｎ−Ｖａｌ−Ｌａｕ−＾ｒｇ−Ｇ　１ｙ−
Ｔｈｒ−Ｖａ　１−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−
Ｇ　ｌ　ｙ−Ｐｈａ−＾ｓｐＧｌｕ−Ａｒｇ−八１ａ−
Ａｓｐ−Ａｌへ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−＾ｒｇ−１
ｙｓ−＾１ａ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＬｅｕＧｌｕ
−Ｔｈｒ−＾５ｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−３ｅｒ−１１ｅ−
Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−３ｅｒ−＾
ｒｇ−３ｅｒＡｓｎ−Ａｌａ−Ｇｉｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ
−Ｇｌｕ−１１ｅ−３ｅｒ−＾１ａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−
Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−ＰｈｅＧ］ｙ−Ａｒｇ−Ａｓ
ｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ
−３ｅｒ−ＧＩｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−ＬｙｓＰ
ｈｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−１１ｅ−ＶａＩ−ＡＩ
ａ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−＾ｒｇ
−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ＾ｓｐ−＾１ａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｌ
ｅｕ−Ｌｙｓ−ｌ（ｉｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇ
ｌｙ−Ａｌａ−ＧＩｙ−Ｔｈｒ−ＡｓｎＧｌｕ−Ｌｙｓ
−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｉ　１ｅ−１１ｅ
−Ａｌａ−３ｅｒ−＾ｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−
Ｇｌｕしｅｕ−Ａｒｇ−Ａｌａ−１１ｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌ
ｎ−シａｌ−Ｔｙｒ−ＧＩｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ
−Ｇｌｙ−３ｅｒ−３ｅｒＬｅｕ−Ｇｌｕ−＾５ｐ−Ａ
ｓｐ−Ｖａｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−八５ｐ−Ｔｈｒ−３ｅ
ｒ−ＧＩｙ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−ＧＩｎ−八ｒｇＭｅｔ−
Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａ
ｌａ−＾ｓｎ−Ａｒｇ−＾５ｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｌ
ａ−Ｇｌｙｌｌｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｉｎ−
Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−＾１ａ−Ｇｌｎ−Ａ
ｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ＧｌｎＡｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ
−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−＾５ｐ−
Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−［１ｅ−Ｔｈｒｌｌ
ｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−＾ｒｇ−３ｅｒ−Ｖａｌ
−３ｅｒ−ｆｌｉｓ−Ｌｅｕ−八ｒｇ−Ｌｙｓ−ＶａＩ
−Ｐｈｅ−ＡｓｐＬｙｓ−Ｔｙ　ｒ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−
１１ｅ−３ｅｒ−Ｇ　１　ｙ−Ｐｈｅ−Ｇ　１　ｎ−１
１ｅ−Ｇ　１　ｕ−Ｇ　１　ｕ−Ｔｈｒ−１１ｅ−＾ｓ
ｐ＾ｒ　ｇ−Ｇ　］　］ｕ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇ１ｙ−
Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇ　１ｕ−Ｇ　１ｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ
−Ｌｅｕ−＾１ａ−Ｖａ　１−Ｖａ　ｌしｙｓ−３ｅｒ
−１１ｅ−Ａｒｇ−３ｅｒ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−
Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔ
ｙｒＴｙｒ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ
−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−＾ｓｐ−＾５ｐ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−
Ｌｅｕ−１１ｅ−ＡｒｇＶａｌ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−３ｅ
ｒ−Ａｒｇ−３ｅｒ−ＧＩｕ−１１ｅ−八５ｐ−Ｌａｕ
−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｉ　Ｉｅ−Ａｒｇ−ＬｙｓＧｌｕ−
Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｔ
ｈｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−３ｅｒ−Ｍｅｔ−１１
ｅ−ＬｙｓＧｌｙ−へ５ｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−
八５ｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌ
ｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＣｙｓＧｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ
−Ａｓｆ＋なお、本発明で用いるヒトＣＰＢ−Ｉ又はリコンビナン
トＣＰＢ−Ｉは、必ずしも上記と同じアミノ酸配列であ
る必要はない。すなわち、ＣＰＢ−ＩのＮ末端又はＣ末
端より１個もしくは複数個アミノ酸を付加あるいは切断
された構造を有するもの、及び天然型ＣＰＢ−Ｉの構造
中の１個もしくは複数個のアミノ酸が他のアミノ酸に置
換された構造を有するものも、ＣＰＢ−１の活性を有す
る限り、用いることができる。

かかるＣＰＢ−Ｉ及びリコンビナントＣＰＢ−Ｉは、後
記実施例に示すように神経細胞に対し成長栄養因子とし
て働き、神経細胞の機能障害に基づく種々の疾患、例え
ばアルツハイマー型痴呆症等の老人性痴呆や脳血管障害
等の予防及び治療に有用である。ＣＰＢ−Ｉは生体由来
の蛋白であり、マウスの静脈内投与におけるＬＤ、。値
は２００■／　ｋｇ以上であり、人体に対しても殆ど毒
性を示さない、極めて安全性の高い薬物である。

本発明神経細胞保護剤の投与方法としては、動脈、静脈
の血管内投与のほか、筋肉内投与及び機能障害部位への
直接投与が挙げられる。また投与量は、年齢、体重、症
状及び投与方法によって異なるが通常、成人１日あたり
ＣＰＢ−Ｉ又はリコンビナントＣＰＢ−Ｉとして０．０
００１〜１００ｍｇが好ましい。

本発明神経細胞保護剤の投与にあたっては、ＣＰＢ−Ｉ
又はリコンビナン）　ＣＰＢ−Ｉをそのまま、あるいは
血清アルブミン、ゼラチン、人工脳を髄液、マンニトー
ル、リン酸緩衝液、食塩水等と混合して用いてもよく、
その形態は凍結乾燥品、液状のいずれでもよい。

〔発明の効果〕

本発明の神経細胞保護剤は、有効成分であるＣＰＢ−Ｉ
又はリコンビナントＣＰＢ−Ｉが神経細胞に対し、成長
栄養因子として働き、かつ大量入手が容易であり、神経
細胞の機能障害に基づく種々の疾患、例えばアルツハイ
マー型痴呆症等の老人性痴呆や脳血管障害等の予防及び
治療に有用である。

〔実施例〕

次に実施例を挙げて本発明の詳細な説明するが、本発明
は何らこれに限定されるものではない。

なお、本実施例においてＣＰＢ−Ｉは特開昭６２−１７
４０２３号の実施例１で得られたものを、またリコンビ
ナントＣＰＢ−Ｉは特開昭６４−２００９５号の実施例
４で得られたものを使用した。

実施例１（１）胎児期のラット大脳皮質の初代培養大脳半球を１
６日口のラット胎児より取出し、細切後、トリプシン（
０，１％）とＤＮａｓｅ　（０，０１％）で消化し、組
織をステンレスメツシュ（２５０，ｃｍ）を通過させる
。細胞を５　Ｘ　１０２ｃｅｌｌｓ／ｍｍ２の濃度でポ
リーＬ−’Ｊジンでコートした２４穴のプレートに播種
した。培地は１％胎児ウシ血清、０．５■／ｒｎｌの重
炭酸ソーダ、５■／ｍｆ！のグルコース、５０ｔｌ／ｒ
ｄのペニシリン、１００μｇ／−のストレプトマイシン
、１０μｇ／ｍｊ！のインシュリン、１０μｇ／−のト
ランスフェリン、１０％ｇ／ｍｊ！のセレン（ＩＴＳ　
ｐｒｅＩＩＩｉｘ、Ｃｏ１ａｂ）、そして１００μ賛の
プトレッシン（Ｍｉｌｅｓ）を含むＭｉｎｉｍｕｍ　Ｂ
ｓ５ｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＢＭ）を用いた。

播種２４時間後に、ＣＰＢ−Ｉを加え、更に４日間培養
を続け、生存している神経細胞を顕微鏡下に測定した。

（２）　ヒ）　ＣＰＢ−Ｉの神経細胞栄養因子活性上記
測定系に１０−’　〜ｔｏ−’　ｇ／　ｍｌ！のＣＰＢ
−Ｉを添加し、その生存神経細胞数を測定したところ、
第１図の如く、３　Ｘ　１０−’　ｇ／ｍ１以上ノＣＰ
Ｂ−１ノ添、ｍで神経細胞延命効果が観察された。特に
１０−１〜３Ｘ１０−’　ｇ／ｍｌ！でその効果が顕著
に認められた。

この系にヒトｃｐｅ−■に対するウサギポリクローナル
抗体を添加したところ、この神経細胞栄養因子活性は消
失した。

なお、神経栄養因子活性測定は胎児期のラット大脳皮質
の初代培養を用いて測定した。

実施例２局所注射用製剤：［：ＰＢ−Ｉ　　　　　　　　　　　　１〜１００ｍｇ
全量　　　　　　　　　　１０ａｔＪ実施例３静脈注射用製剤：ＣＰＢ−Ｉ　　　　　　　　　　　　１〜１００ｍｇリ
ンゲル液　　　　　　　　　適量全量　　　　　　　　　　１０ｄ

【図面の簡単な説明】

第１図はＣＰＢ−１の添加量と生存神経細胞数（ｃｅ　
ｌ　Ｉｓ／＋ｎ＋ｎ２）との関係を示す図面である。以　　上

Claims

【特許請求の範囲】１、ヒトＣＰＢ−Ｉ又はリコンピナントＣＰＢ−Ｉを有
効成分とする神経細胞保護剤。２、抗痴呆剤として用いるものである請求項１記載の神
経細胞保護剤。