TWI355275B - Novel carbamylated epo and method for its producti - Google Patents

Description

1355275 ^ 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 -4Γ 本發明係關於一種新穎的化合物，.以及生產該化合物 ' 的方法。該新穎化合物，胺曱醯化的促紅血球生成素 .(CEP〇) ’特徵在其分子之離胺酸上的所有或大部分一級胺 和N-端胺基酸被胺曱醯化，且另外此化合物在分子中其他 胺基酸的一級胺之胺曱醯化水平係低的。而且，此種新賴 化合物不含集結的蛋白質和聚合物，並且適用於醫藥組成 ® 物以治療發生在例如在中央或周圍神經系統或在其他表現 中央EPO受體的組織中之疾病。本生產方法之另一項令人 驚奇的優點是’與其他敘述用於對促紅血球生成素之已知 的胺曱醯化方法所得的產物相比，該方法提供包含較少集 結蛋白質和較少聚合物之產物。· ^ 【先前技術】 胺甲醯化EPO之生物造血活性受損業已經由Satake，R 等人（1990年）在《生物化學與生物物理雜誌》（Bi〇chimica et

• Biophsica Acta) ’ 第 1038 期：第 125-129 頁，和 Muii,K-C 和Colper，Τ·Α·(2000年）在《血液純化》，第a期：第13_17 頁顯示過。Brines等人’ 2003年，美國專利申請案 20030072737顯示造血活性喪失並不會影響Ep〇的組織保 護性質。 蛋白質的胺曱醯化普遍被知道是使用尿素純化蛋白質 的副作用’以及血漿高尿素濃度的結果。這是由尿素自發 分解成氰酸鹽引起的。氰酸鹽負責將蛋白質的一級胺（^ · 5 ⑧ 1355275 土年£胺基）胺曱酸化’因此蛋白質的N-端末尾和離释 . 酸容易被胺甲醯化（圖1)。此外其他容易被胺甲醯化的可 能之胺基酸殘基是例如精胺酸、半胱胺酸、酪胺酸、天冬 . 胺酸、楚胺酸和組胺酸，然而其反應是與pH相依的並且 • 不若與N-端和離胺酸殘基進行得那麼容易。 0 [N=C=〇]_ + h3N+-~ 氰酸鹽 N-端/離胺酸殘 H2N-C-NH — 胺甲醯化的蛋白質 圖1.氰酸鹽與蛋白質之Ν-端和離胺酸殘基之反應 對於揭露蛋白質的胺甲醯化能夠增進或損害蛋白質生 物活性的研究已經被H0rkkd，S等人（1992年）在《國際腎 臟學期刊》，第41期：第1175-1181頁；Plapp，B.V.等人（1971 籲年）在《生物化學期刊》，第246期（4):第939-945頁；Satake，R. 等人（1990年）在《生物化學與生物物理雜誌》（Biochimica et

Biophsica Acta)，第 1038 期：第 125-129 頁，&Mun，K-C. 和Colper，τ·Α·(2000年）在《血液純化》，第18期：第13-17 頁進行過。他們採用KCNO作為氰酸鹽的來源研究蛋白質 被'胺甲醯化的生物效應❶他們全部都發現因為增加的胺甲 醯化作用所造成的生物活性衰退或改變。對於胺曱醯化程 度的評估是根據兩項分析方法： 1 ·利用三硝基苯磺酸（TNBS)檢驗測量自由胺基的衰落 1355275 ·> ^ i i. 和 • 2·胺基酸分析以測定轉變成的高瓜胺酸（homocitrulline) 殘基的離胺酸》 • Η·δ，”Α(1992 年）用 2MKCN0 在 37t 胺甲醯化 '低密度的脂蛋白經最多6小時，但是以TNBS檢驗測量並 未獲得完全胺曱酿化的蛋白質。 PUPP，B.V.等人〇971年）研究時間的效應並且在37。〇 用1MKCNO處理24小時以後獲得幾乎完全胺甲醯化的牛 姨臟去氧核糖核酸酶A。

Mun，K.C·和 Golper，T.A.(20〇〇 年）利用 2M KCN〇 以最 多6小時的反應時間研究時間效應。他們也研究在6小時 . 裡KCNO濃度增加的效應，所有反應都是在37<t進行的。 • Mun，KX> GolPer，T.A.(20〇〇年）無法從實驗設計證明胺曱 醯化的確切f呈度（請參考第頁第Pd5頁）。 現在吾人已在本發明中發現Ερ〇的胺曱醯化會產生聚 φ 合物和集結物，因而使其不適合用作為生物醫藥品。此外 〇人發現些聚合物和集結物的形成視胺曱醯化作用的方 法條件而冑。因此需要研發一種考慮ρΗ、時間、氰酸鹽濃 度、溫度、蛋白質濃度、與最重要的是蛋白質的聚合程度 之最佳參數的方法月包括一種產生具有低度聚合生 之最佳的胺甲醯化方法，而且令人驚 冴的疋吾人已發現獲得在—和所！離$酸殘基(後者發 生在特火的pH範圍)被完全胺甲。進行本發明 之緊接的步驟是為了要移除形成的集結物與'聚合物。所得 、--——------— 7 ⑧ 1355275 .到之胺甲醯化的純粹EPO是一種新穎的化合物，並且與包 含該化合物的醫藥組成物在本申請案之申請專利範圍中主 張。 先前已說明胺甲醯化的程度視氰酸鹽濃度與時間而 定。然而如何獲得可量測的胺甲醯化方法以生產生物醫藥 品卻尚未做說明。 在次佳生產方法中存在的集結物與抗體的誘導有關 胳。因此集結物的存在會產生不適用於人類的生醫產物。 本發明所說明的胺曱醯化作用與純化方法會產生一種 蛋白質，其特徵在於完全被胺甲醯化而形成儘可能最少的 聚合物或集結物，並且具有最少的終產物損失。因此使其 成為一項在經濟上可利用的步驟。 胺甲醯化蛋白質的進一步加工會產生有用於作為生物 醫藥的產物，其僅具有因為集結物和聚合物而對該蛋白質 產生免疫反應的最小風險。 除了胺基酸分析外尚有評估完全胺甲醯化作用的分析 方法，對自由一級胺基進行TNBS，以及最終用maldi t〇F 對產物和分解產物進行特徵鑑認。 本發明的新穎產物是促紅血球生成素，其在分子的N_ 端以及離胺酸殘基之自由胺基上被完全胺曱醯化，並且未 被集結或未被聚合至高於2.5%之含量，且其為包含最少之 過度或低度胺f醯化之促紅血球生成素，其可用於生產醫 藥組成物以治療對天然促紅血球生成素的神經保護作用具 反應之疾病。 ⑧ 1355275 ι - λΙ - ::=- 【發明内容】 一 .. 本發明係關於用於生產生物醫藥品之可測量量蛋白質 ‘ 胺甲醯化程序。而且’其亦關於該方法之產物，以及包含 . 該化合物的醫藥組成物，和這些組成物的用途。 - 本申請案所說明的胺曱醯化作用與純化方法導引出一 種蛋白質，其特徵為完全被胺甲酿化且具有儘可能最低的 聚合物或集結物形成，且其終產物損失最少。 胺甲醯化作用的方法已經被最佳化以產生具有最低量 聚合物和集結物之胺甲醯化的蛋白質，這使其成為經濟上 可^用的方法。最終產物另外包含有限量的過度和/或低度 (每刀子在9個胺甲醯化以下或以上）胺甲醢化促紅血球生 . 成素的異構形式。低度胺曱醯化的EPO包含少於9個胺曱 ‘醯基的殘基，亦即並非全部的8個離胺酸和N_端都被胺甲 ^化低度^ 化EpC)可具有少至5個胺甲醯基殘基並 仍…丨不具有傳統的促紅血球生成素活性，這使其適用於 籲本發月的用途。過度胺甲酿化的Ep〇包含多於9個胺甲醯 土的殘基，並且可在8個離胺酸和N-端以外的其他胺基酸 上有fee曱gi化作用。CEP〇可具有多達15個胺甲醯化殘基 並且仍然具有所希望的作用，亦即不具有傳統的促紅血球 生成素活性。至少大約9G%，並且最可能是95%的CEPO 八構形式僅在8個離胺酸和N —端被胺甲醯化。 月安曱醯化蛋白質的進一步加工移除集結的和聚合的產 物至曰士 7 0/ 、 医#取大或2.5%程度，因此使得產物有用於作為生物 ^藥。。’其僅具有因為集結物和聚合物而對該蛋白質產生 1355275 免疫反應的最小風險β 除了胺基酸分析外有評估胺甲醯化作用的分析方法； 對自由一級胺基進行TNbs，以及利用MALDI-TOF與LC-MS/MS對於產物和分解產物進行特徵鑑認。 【實施方式】 製造方法 以下六個步驟構成該蛋白質胺曱醯化的方法： 1.用超離心作用濃縮

2 ·用胺甲醯化作用修飾 3. 用膠體過據法除去鹽分 4. 用陰離子交換純化 5. 用超過濾和透析過濾法進行濃縮和緩衝液的交換 6.0.22微米過濾

本胺甲醯化方法的起始物質係以經過純化的人類EPC 為有利，但是可為任何動物的或人類類型的Ep〇形式，在 非限制性的實财其為人玉合成的、重組的人類Ep〇或是 經由生物學或化學修飾之人類 .

類 如 sialo-EPO,人類 EPC 的突變體，亦即在胺基酸序列 ^ w丄等入變化的分子，ΕΡ0片 段’ ΕΡΟ的肽，若有數種蛋 質破期望胺甲醯化則有其他 蛋白質或蛋白質混合物。 JL φ ^ ^ # ^ α峨明）芏贫白質濃度 具中蛋白質濃度經調整以保捭 . 得低的加工體積。蛋白質濃 為0.05-10毫克/毫升或〇〇5_8 _ ^ 宅兄/毫升，一項15#的 體實例為0.05-7毫克/毫升，最項較佳的 佳為2-5毫克/毫升。若 10 1355275 濃度增加則集結物的形成也會增加。該超過濾是利用豆 5kDa MWCO 之 Bi〇Max(Millipore 公司出品）進 订的。可廣 用/、他濾器。此外該蛋白質的溶解度亦藉由二 檨疋劑來

在元成濃縮的步驟之後，將蛋白質溶液與pH 7 "或 PH 7-1〇删酸钟四水合物、氮酸卸混合，在—項較佳的且 體貫例中PH是是8_1〇,最好是9·〇;在〇。到_或到 5〇t:或οι 40t:或〇i<3rc ’但是在一項較佳的且 例中溫度間隔A心代，較好是32t，經㊣1〇分鐘％ 天或30分鐘-30天或丨小時·3〇天或丨小時_2〇天或刀^日士 ，天或！小時·5天或i小時-2天或】小時心小時或、^ 26小時或較好是22小時·26小時’最好是24小時的時間 窗口。然而若是其他參數亦即溫度、氰酸鹽濃度和蛋白質 浪度發生改變，則這些較佳的時間間隔是可以改變的。 若是溫度低於限制則產率將會低，因為胺甲酿化作用 將會缓慢且沒有效率’·若是超過溫度限制則產率將會低， 因為集結作用增加。另_項重要的參數是時間，因為若使 時間減少胺^化作用將不完全或者若使時間增加則會觀 祭到集結物形成，因而造成較低的產率。 因此吾人提供具有一致性的參數的過程，亦即若是溫 度被降低’則可藉由增加氰酸鹽濃度和/或反應時間來補償 下降的胺甲醢化反應，，若是反應時間減少，則可增 加溫度和/或氰酸鹽濃度來補償下降的胺甲醯化反應。‘ 後，在具有減少之氰酸鹽濃度之過程中，藉由增加反應時

1355275 間和/或溫度可以補償下降的胺曱酿化反應。 因此，結論是明顯改變一項重要的參數（時間、溫度' 氰酸鹽濃度和蛋白質濃度）意味著改變一項或多於一項其他 • 重要的參數，以獲得完全胺曱醯化的分子與形成低量的集 . 結物與聚合物。 硼酸鹽緩衝異的濃度可為〇.〇5-2M，但在一項較佳的 具體實例中其為0.1-1M且最好是〇.5M，因為氰酸鹽在接 納質子和缺乏緩衝能力之下天性地會被水解和聚合而造成 _ 溶液的.pH偏移。 - 此外，氰酸鹽濃度較好是在0.05-10M或0.05-8M或 0.05-6M或0.05-4M或0.05-2M的範圍，較佳的具體實例 是 0.05-1M，最好是 0.5M。 濃度0·5M的硼酸鹽緩衝液被需要用於控制因使用之 ' 0.5M氰酸鹽濃度之質子攝取所造成的pH偏移。可採取利 用其他氰酸鹽和硼酸鹽的鹽類的方法。此外，可採用除了 硼酸鹽以外的其他反應緩衝液，例如碳酸鹽緩衝液或磷酸 籲鹽缓衝液。 蛋白質和氰酸鹽之反應混合物的脫鹽是利用色層分析 術的膠體過濾法進行的。G-25細粒（Amersham Bioscience 公司出品）基質被採用。在把試樣施用到管柱之前的停留等 待時間是經過控制的且不應超過2小時，因為這會引起進 一步的胺甲醯化作用並且會形成聚合物。蛋白質的脫鹽與 改變缓衝液可藉由透析作用、透析-超過濾或利用色層分析 術之膠體過濾法進行的。可使用其他膠體過濾法的基質， 12 ⑧ 1355275 例如交叉連接的多醣或交叉連接之混合多醣、聚丙醯胺、 聚笨乙烯，或是以陶瓷為本質的基質。而且在這項步驟中 管柱的高度可改變。 胺曱醯化作用可以被調整以獲得具有少於3〇0/〇集結物 和聚合物或少於25%或少於20%或少於15%或少於12.5% 或少於10%或少於8%或少於7%集結物和聚合物的產物。 集結物和聚合物的移除是利用陰離子交換的純化步驟 進行的。吾人觀察到該步驟可將胺曱醯化的EPO與剩餘的 起始物質和集結物/聚合物分離。流動緩衝液A是： 〇.3%Tris(25mM)，〇.3%(50mM)NaCl，PH8.5±0.2，洗提緩 衝液 B 是：0.3%Tds(25niM)，5.8%Tris(lM)NaC卜 ΡΗ8·5 + 〇·2。用0-30%經過20倍管柱體積進行梯度層析以產生所 需的分離作用。該純化步驟可產生具有少於3%集結物和 聚合物或少於2.5%或少於2%或少於1.5%或少於1%或少 於0.5%集結物和聚合物的產物。 胺曱醯化的ΕΡΟ尖峰的洗提和收集與匯聚會影響所洗 提蛋白質之異質性，亦即異構形式的分佈。換句話說過 度和低度胺甲醯化的CEPO的量將會視收集和匯聚的方法 而改變。一個窄範圍的匯聚會導致過度和/或低度胺甲醯化 的促紅血球生成素含量降低。增加梯度的長度則容許挑選 更為被定義的產物。在實例中即釋出了某些種類。 一種以ESI-質譜分析法測量具有少於佔重量之大約 40%之過度和低度胺甲醢化異構形式的胺甲㈣Ep〇的組 成物是本發明的一項具體實例。一項更佳的具體實例是以 ⑧ 13 1355275 ESI-質谱分析法測量具有少於佔重量之大約35%之過度和 低度胺曱醯化異構形式的CEp〇。一項甚且更佳的具體實 例是以ESI-質譜分析法測量具有少於佔重量之大約3〇%之 過度和低度胺曱醯化異構形式的CEp〇。一項甚且更佳的 具體實例是以ESI-質譜分析法測量具有少於佔重量之大約 25 %之過度和低度胺甲醯化異構形式的CEp〇。一項甚且更 佳的具體實例是以ESI-質譜分析法測量具有少於佔重量之 大約20%之過度和低度胺甲醯化異構形式的CEp〇。一項 甚且更佳的具體實例是以ESI-質譜分析法測量具有少於佔 重量之大約15%之過度和低度胺曱醯化異構形式的CEp〇 β 一項甚且更佳的具體實例是以ESI-質譜分析法測量具有少 於佔重量之大約10%之過度和低度胺曱醯化異構形式的 CEPO。一項甚且更佳的具體實例是以ESI_質譜分析法測 量具有少於佔重量之大約5%之過度和低度胺曱醯化異構 形式的CEPO。一項甚且更佳的具體實例是以ESI_質譜分 析法測量具有少於佔重量之大約2 %之過度和低度胺甲酿 化異構形式的CEPO。最佳的具體實例是以ESI_質譜分析 法測量具有少於佔重量之大約1 %之過度和低度胺甲醯化 異構形式的CEPO。 除了影響異構形式的總含量以外，收集與匯聚胺曱酿 化的EPO尖峄會影響過度胺甲醯化CEPO的分佈。較佳者 係過度胺甲醯化CEPO異構形式的量以ESI-質譜分析法測 量少於重量之大約35%。甚至更佳的是過度胺曱醯化cep〇 異構形式的量以ESI-質譜分析法測量少於重量之大約 I355275 - . - - - -- -z. 30%，且甚至更佳的是過度胺甲醯化CEPO異構形式的量 ' 少於重量之大約25%，且甚至更佳的是過度胺甲醯化CEP0 • 異構形式的量少於重量之大約20%，且甚至更佳的是過度 胺甲醯化CEPO異構形式的量少於重量之大約丨5%。最佳 • 的是過度胺甲醯化EPO的量應不超過總CEPO重量的大約 10%，大約5%，或大約ι〇/〇， 可使用其他流動和洗提緩衝液，且可使用其他陰離子 • 交換基質和帶有電荷的濾器。在非限制性實例中的基質為 交又連接的多醣或交又連接之混合多醣、聚丙醯胺、聚苯 乙稀，或是以陶瓷為本質的基質。 此外甚至可使用陽離子交換、厭水性交互作用的色層 ' 分析術、逆相色層分析術、親和性色層分析術、和以分子 - 大小排除之色層分析術於該純化作用。 下一個為求調整濃度和緩衝液之步驟中，使用一種透 析/超過;慮切線流動過攄單元。將胺甲醯化的Epo調整到 Φ >0·5毫克/毫升的濃度並且將緩衝液改變成20mM擰檬酸， lOOmMNaCl緩衝液。濃度和緩衝液的改變是利用配備5kDa MWCO之BioMax(Millipore公司出品）進行的。可以使用 其他濾器。 最後經純化的生醫藥物係利用Millipak(MiUip〇re公司 出。口）進行〇·22微米過濾以減少病菌。可應用任何〇 22微 米的遽器。 .利用s玄方法付到完全胺甲醯化的epo，其以seC-HPLC 測篁具有少於3%或較好是少於2 5%的集結物。8個離胺 15 !355275 * 酸殘基完全被胺曱醯化是利用胺基酸分析測定離胺酸經轉 • 變成高瓜胺酸來證明的。而且在胺甲醯化作用之後接著利 • 用TNBS檢驗測定一級胺從而顯示離胺酸與端被完全胺 曱酿化。 - 此外，利用MALDI_T〇F進行的完全特徵鑑認來測定 PNG酶（PNGase)處理過的蛋白和具有N_聚糖之蛋白質兩者 在其完整質量上的改變。此外MALDI_T〇F肽質量指紋分 _析/LC-MS/MS分析顯示所有8個離胺酸與N_端均胺被胺 曱醯化。未測到任何其他被胺甲醯化的胺基酸並且未測到 任何多醣被修飾。而且，在最終產物中獲得降低含量的過 度和低地胺甲醯化的EP0形式。這項產物是新穎的並且在 - 申請專利範圍主張。 • 本發明的一項具體實例是在胺曱醯化步驟之後但在陰 離子交換的純化作用之前所得到的組成物，其包含完全= 甲醯化的EPO而具有少於重量的大約4〇%之集結物和聚合 癱物，或少於重量的大約30% ’或少於重量的大約25%，或 =於重量的大約20%，或少於重量的大約15%，或少於重 量的大肖12.5%，或少於重量的大肖1〇%，或少於重量的 大約或少於重量的大約7%之集結物和聚合物和一 量的氰酸鹽。 本發明還有一項具體實例是在陰離子交換樹脂純化作 用之後所得到的組成物，其包含經胺甲醯化的Ep〇，具有 少於重量的大約3。/。之集結物和聚合物，或少於大約25%， 或少於大約2% ’或少於大约15%，或少於大約ι%，或少 36 1355275 於大約0.5 %之集結物和聚合物。而且，這種組成物包括含 有過度或低度胺甲醯化之EPO的異構形式，其量少於經胺 甲酿化Ε Ρ Ο之總重的大約4 0 % ’或更好是少於大約3 5 %， 或少於大約3 0 % ’或少於大約2 5 %，或少於大約2 〇 %，或 少於大約15% ’或少於大約1 〇%，或少於大約7.5%，或少 於大約5%，或少於大約2%，且最好是少於大約1%。而 且在該組成物中過度胺甲醯化EPO的量可能少於經胺甲酸 化EPO之總重的大約35%，或更好是少於大約3〇%，或少 於大約25%，或少於大約20% ’或少於大約丨5。/〇，或少於 大約10%，或少於大約7.5%，或少於大約5%，或少於大 約2%，且最好是少於大約1 %。 本發明的醫藥組成物 本發明的一方面是本發明的化合物用於生產使用在人 類或哺乳動物以治療以下說明病狀之醫藥組成物的用途。 本發明的一項具體實例是一種包含醫療上有效量之胺 曱醯化的EPO的醫藥組成物’其具有少於重量的大約3% 之集結物和聚合物，或少於大約2.5%，或少於大約2%， 或少於大約1.5 % ’或少於大約1 % ’且最好是少於大約〇. 5 〇/〇 以及更進一步之集結物和聚合物’且此種組成物包括含有 過度或低度胺曱醯化之EPO的異構形式，其量少於經胺甲 醯化EPO之總重的大約40%，或更好是少於大約35%，或 少於大約30%，或少於大約25%，或少於大約2〇%，或少 於大約15% ’或少於大約10%，或少於大約5%，或少於 大約3% ’或少於大約2%，且最好是少於大約1%。而且 17 1355275 在該組成物中過度胺曱醢化EPO的量可能少於經胺甲醯化 EPO之總重的大約35%，或更好是少於大約30%，或少於 大約25%，或少於大約20% ’或少於大約15%，或少於大 約1 0%，或少於大約5%，或少於大約3%，或少於大約2%， 且最好是少於大約1%。

在本發明一方面的實行中’如以上所說明含有本發明 之化合物的醫藥組成物可藉由任何能在血管中提供充分浪 度之本發明化合物，以容許其穿過上内皮細胞障礙轉移而 對反應細胞產生有利效果的途徑投藥於哺乳動物。當用於 灌流某種耝織或器官的目的時’吾人希望得到相似的結 果。在細胞和組織是非血管化的和/或投藥方式是藉著把細 胞或組織用本發明的組成物浸浴的情形中，該醫藥組成物 提供有效之對於反應細胞有利的本發明化合物量。本發明 化合物可能轉移穿透的内皮細胞障礙包括緊的銜接點、有 孔的銜接點、具窗孔的銜接點、和存在於哺乳動物之其他 任何型式的内皮障礙。一種較佳的障礙係内皮細胞緊的銜 无則提到之本發 ϋ 3卬於冶療十 預防性治療具有主要神經學或精神病學症狀之人類卜 經系統或周圍神經系統疾病、眼科疾病、心血管疾/ 肺疾病、呼吸疾病、腎、泌尿和生殖疾病、疾 2與代謝異常。尤其’此種病狀和疾病包括缺氧= :負向影響可刺激的組，織，如在中央神"統 神經糸統組織、或心臟或視網膜組織中的可刺激組織: 18 1355275 或視網膜/眼。因此’本發明的化合物可用於治療 或預防由於各種病狀和情況’、 、土忐认4。士 蜗孔届狀對於可刺激組織 二广。此種病狀和情況的非限制性實例提供於本說 明曰之以下表中。 在可依照本發明治療的神經元組織病理之保護實例 打降：：病理包括因神經元組織的充氧降低所造成者。任 神心组織的氧氣可獲性、造心力、損害且最終 :成相I細胞的死亡之狀況均可藉由本發明的方法來治 療。一般稱為缺氧症或局部缺血者，這些病況是由包括作 ::於：：者所引起··中風、…閉、產前或產後氧氣 …。更塞、顏臨溺繁、一氧化碳中毒、吸入煙霧、 創傷，包括手術和放射療法、窒息'癲癇、低血糖、慢性 阻塞性肺疾病、肺氣腫、成人呼吸箸迫徵候群、低血壓休 t'敗血：休克、過敏性休克、騰島素休克、鐮刀細胞危 [二心臟农竭、心律不整、氮氣麻醉現象、和由心肺繞道 手術所引起的神經學上之不足。 例如，在-項具體實例中，可投藥包含本發明組成物 之特定的醫藥組成物以防止外科手術例如腫瘤切除或動脈 瘤修補的期間由於損傷或組織損傷之危險所造成的損傷或 組織損傷。其他可藉由本發明所說明的方法治療之因低血 糖：引起或造成的病理包括胰島素劑量超過，亦稱為醫源 性南姨島素血症、陆會主 ^ 胰島素瘤、生長激素缺乏、可體酮低下 症、藥物過量、和某些腫瘤。 其他由可刺激的神經元組織損傷所造成之病理包括發 19 作型病症，如癲癇、抽拉 '二汰 彳"或忮性的發作性病症。其他可 >0療的病況和疾病包括但不眼 不限於疾病如中風（局部缺血性中 風、蜘蛛網膜下腔出血、腦內屮品、々於 蔽 舳内出血）' 多發性硬化症、低血 麼、心臟衰竭、阿茲海f夫戌、戌 从人士 <<t ”大氏症、帕金森氏症、腦性麻痺、 恥或脊索創傷、AIDS貞呆症、與年齡有關的認知功能喪 失、記憶喪失、肌萎縮性脊髓侧索硬化症、發作型病症、 酒精上瘸、視網膜缺氧、由軎 月光眼所造成的視神經損傷、 和神經元喪失。 本發明的特定組成物和方法可用於治療疾病病況或各 種創傷所造成的炎症，如物理或化學誘導的炎症。此種創 傷可包括血管炎、慢性支氣管炎、胰腺炎、骨髓炎、類風 濕性關節、腎小球炎、視神經炎、顳動脈炎、Μ炎、腦膜 炎、橫貫性脊髓炎、皮肌炎、多發性肌炎、壞死性筋膜炎、 肝炎、和壞死性小腸結腸炎。

證據已顯示活化的星狀細胞可藉由生產神經毒素以對 神經元施展其細胞毒性的角色。一氧化氮、反應性氧類、 和組織介素從膠質細胞中釋出以回應腦局部缺血（請參考 Becker’K.J·，2001年，〈目標導向局部缺血性中風的中央 神經系統發炎反應〉，《現代神經學見解》，第丨4期： 第 349-353 頁；和 Mattson, M. P_、Culmsee C、和 Yu Z F 2000年’〈中風之細胞调亡與抗細胞凋亡機制〉，《細胞 組織研究》，第301期·第173-187頁）。研究尚已證明在 神經退化的模型之中’膠質活化與緊接的發炎組織介素之 生產視主要神經元損傷而定（請參考Viviani，B.、 20 1355275

Corsini,E_，Galli、Galli，C.L.、Padovani，A.、Ciusani，E.、 和Marinovich，M，在2000年，〈垂死的神經細胞經由釋 出蛋白酶產物而活化膠質〉，《膠質》，第32期：第84- 90 頁和 Rabuffetti，M.、Scioratti，C.、Tarozzo，G·.、 Clementi，E.、Manfredi，A.A.、和 Beltramo，M.在 2000 年， 〈以Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-氯曱基酮抑制似半胱胺酸天冬胺 酸蛋白酶-1的活性包括經由細胞凋亡降低和前發炎組織介 素減少而在腦部局部缺血時提供持久的神經保護〉，《神 經科學雜言志》，第20期：4398-4404頁）。發炎和膠質活 化作用對於不同形式的神經退化疾病，包括腦部局部缺 血、腦創傷和實驗性的過敏腦脊髓炎、促紅血球生成素在 其中施展神經保護作用的病症而言是常見的。藉由促紅血 球生成素抑制組織介素的生產能夠至少是部分地調節其保 護作用。然而，不像會直接抑制腫瘤壞死因子生產的「典 型的」抗發炎組織介素如IL-i0和IL-13 —般’促紅血球 生成素只有在神經元死亡時才顯得有活性。 雖然吾人不希望受限於任何特殊的理論，但是顯然這 種抗發炎活性可用數種非限制性的理論作假設性的解釋。 首先，因為促紅血球生成素會防止細胞凋亡，所以可預防 由細胞凋亡所引起的發炎狀況。此外，促紅血球生成素可 預防分子信號從顏死的神經元釋出，肖&子信號會刺激膠 貝細胞或者直接作用於膠質細胞而上降低它們對於這些產 物的反應。另一種可能性就是促紅血球生成素會目標導向 發炎級聯中會引起細胞凋亡和發炎之更接近的成員⑼如天 21 1355275 ;胺自文特異性半胱胺酸蛋白酶-1 (caspase-l)、反應性氧或 氮的中間體）。 而且’促紅jk球生成素顯然能提供抗發炎保護而沒有 、尘上與其他抗發炎化合物如地塞米松（dexamethasone)關 聯之反彈效果。再次地，吾人不希望受限於任何特殊的理 淪，但是顯然這可能是因為促紅血球生成素對於多重目標 神經毒素如一氧化氮（N0)的影響所致。雖然活化的星狀細 7和小神經膠質會產生神經毒性量的N〇來回應各種創 知’ NO在身體内擔負許多目的包括調節重要的生理功能。 因此’雖然使用抗發炎劑可以I!由抑帝】N〇和其他神經毒 素L發炎’但是若該抗發炎劑有太長的半生期，其亦 :能干擾這些化學劑在修復由該導致發炎的創傷所造成之 損壞上的角色。吾人假設本發明的化合物能減輕發炎而不 干擾神經毒素如NO的修復能力。 本發明的特定組成物與方法可用於治療視網膜組織的 病狀與損傷。此種病症包括但不限於視網膜局㈣血、黃 斑變性、視網膜剝離、著色性葫 ' ★ 視網膜炎、動脈硬化性視網 m南血壓的視網膜病變、視網膜動脈阻塞、視網膜 靜脈阻塞、低血壓、和糖尿病 > >目 視，.罔膜 $椐尿病之視網膜病變。 在另-項具體實例中，本發明的方法和原理可用於保 護或治療由輻射損傷或化學治 ' η ㈣發的損傷對可激發組織 所把成的知傷。本發明方法還有—項用途是治療神經毒素 中毒，如多莫酸（d〇m〇ic扣⑷貝中毒、一、:主:、 (neurolathyrism)、和關島症， .，丑？ ！毋症 肌萎縮性脊髓側索硬化症、 22 «*- 和帕金森氏症。 如以上所提到的，本發明亦導向如以上說明藉由周圍 才又藥本發明的化合物在哺乳動物體内增進可激發組織功能 的方法。各種疾病和病狀都可順服於利用本方法的治療， 而^本方法有用於在沒有任何病狀或疾病存在下增進認知 功能。本發明的這些用途更詳細的說明在下方並且包括增 進人類與非人類哺乳動物的學習與訓練。 可藉由本發明的此方面導向中央神經系統之方法治療 的病狀和疾病包括但不限於情緒性病症、焦慮性病症、憂 鬱、孤僻、注意力短础之過動症、和認知功能不良。這些 病症會受益於神經元功能的增進。其他可以照本發明的教 =治療的疾病包括例如睡眠中斷、睡眠呼吸暫停、和與旅 遊相關的疾病：蜘蛛膜下腔和動脈瘤出血、低血壓休克、 震鱼性損傷、敗血性休克、過敏性休克 '和各種腦炎和腦 膜炎的後遺症’例如與結締組織疾病相關的大腦炎如狠 瘡。其他用途包括預防或保護其免於受神經毒素造成之中 毒，如多莫酸（d〇moic acid)貝中毒、山黨豆神經中毒症、 和關島症，肌萎縮性脊髓側索硬化症、和帕金森氏症；栓 基性或局部缺血性損傷的手術後治療；全腦放射處理、鐮 刀細胞疾病危機、和驚厥。 還有-組可藉由本發明的方法治療的病狀包括由於遺 傳或後天本質之粒線體功能不良，其為許多以神經元損傷 和死亡為代表之神經學疾病的肇因。例如，Leigh疾病（次 急性壞死腦病）的特徵為漸㈣視覺喪，㈣為神 23 1355275 出’和肌病。在这些情形中，缺損的粒線體代謝無 .2提供充分的高能量受質以供給可激發細胞代謝的燃料。 -種促紅血球生成素的受體活性調節劑在許多粒線體疾病 中能最佳化使衰退的功能。如以上所提到的’缺氧狀況會 •貞面的影響可激發之組織。可激發組織包括但不限於中央 .申.7<系統且織、周圍神經系統組織、和心臟組織。除了以 j所說明的病狀之外，本發明的方法有用於治療吸入性中 毋’如一氧化碳和煙霧中毒、嚴重的氣喘、成人之呼吸窘 追徵候群、受塞和顏臨溺繁。其他造成缺氧病狀或藉由其 他方法誘發可激發組織損傷的情形包括低血糖症，其可發 生在投藥不適當的胰島素劑量，或在生產胰島素的贅瘤（胰 . 島素瘤）中。 -- 各種被相信起源於可激發組織損傷的神經心理學的病 症可藉由本方法治療。有神經元傷害涉及其中的慢性病症 和提供藉由本發明方法之治療的慢性病症包括與中央神經 Φ系統和/或周圍神經系統相關的病症，包括與年齡有關的認 知功旎喪失和老年癡呆症、慢性發作型疾病、阿茲海莫氏 症、帕金森氏症、癡呆、記憶喪失、肌萎縮性脊髓側索硬 化症、多發性硬化症、結節性硬化症、威爾森氏症（冒…⑽，s Disease)、腦和漸進的腦核上麻痺、關島症（Guam Disease)、 路易氏（Lewy)體癡呆症、普恩蛋白（pri〇n)疾病’如海綿狀 月®病’例如庫賈氏症（Creutzfeldt-Jakob Disease)、亨丁頓 氏症（Huntington’s Disease)、肌強直營養不良症、查考特_ 瑪知牙病（Charcot-Marie-Tooth Disease)、弗列德氏運動失 24 1355275 一 ~ 調（Freidrich’s ataxia)及其他運動失調，以及妥瑞氏症 (Gilles de la Tourette Syndrome)，發作型病症如癲癇和慢 性發作型病症、中風、腦或脊索創傷、aids癡呆、酒精 上瘾、自閉症、視網膜局部缺血、青光眼，自律神經功能 疾病如高血壓和睡眠疾病，以及神經精神病症，其包括但 不限於精神分裂症、分裂情感精神病、注意力短础之過動 症、輕鬱症、重營症、瘋病、強迫症、使用精神活性物質 的病症、焦慮症、恐慌症、以及單極和雙極性情感精神病。 其他神經精神疾病和神經退化性疾病包括例如那些登錄在 ^精神醫學協會的《心理疾病的診斷與統計手冊》 料Γ?，目前最新的版本1V’其以完整的内容藉由參考資 枓倂在本說明書中。 型41:項具體實例中’包含本發明化合物的重組喪合 素〇可料醫療κ毒素幻 如癌症、戎佐主广产, 曰土丨王扪戾炳， 及病毋疾病，如亞急性硬化泛腦炎。 表1列出各種可藉由提到之本^ ^ ^ ^ ^ 和疾症夕计 +七明化合物治療的病狀 ，、他當作範例而非限制性的病徵。 ⑧ 25 1355275 表1

細胞、組織或器官 功能不良或病理學 病狀或疾病 種類 心臟 局部缺血 冠狀動脈疾病 急性、慢性、穩定、 不穩定 心肌梗塞 Dressier氏徵候群 心絞痛 先天性心臟病 瓣膜性心肌症 Prinzmetal氏心絞痛 心臟破裂 動脈瘤的 隔膜穿孔 血管炎 無節律 過速-、緩慢無節律 心室上方的 心室的 傳導異常 穩定的、不穩定的 高敏感性頸動脈竇 結節 充血性心臟衰竭 左、右、二室、 收縮的、舒張的 心肌病，如特發之 家族的、感染的、 代謝的、貯積的疾 病、不全、結締組 織疾病、浸润和肉 芽瘤、神經血管性 心肌炎 自體免疫、感染 的、特發的 肺原性心臟病 鈍頭的的和穿刺性的 創傷 毒素 古柯驗毒 26 1355275

血管 高血壓 原發的、繼發的 減壓不適 纖維肌過度增生 動脈瘤 切除、破裂、變大 肺 阻塞的 氣喘 慢性支氣管炎 氣腫與氣道阻塞 局部缺血性肺疾病 肺栓塞 肺動脈血栓形成 脂肪栓塞 環境造成的肺疾病 局部缺血性肺疾病 肺栓塞 肺動脈血栓形成 間質性肺疾病 特發的肺部纖維化 先天的 囊腫纖維化 肺原性心臟病 創傷 肺炎和 類似肺炎 (pneumoni tides) 感染的、寄生蟲 的、毒素的、創傷、 燒傷、抽吸 結節病 胰 内分泌 第一型和第二型糖 尿病 yS細胞衰竭、功能 不良、糖尿病引起 的神經病變 其他胰臟的内分泌 細胞衰竭 外分泌 外分泌胰衰竭 肤臟炎 27 ⑧ 1355275

骨 骨量減少 原發的 繼發的 性腺功能低下症 不動 更年期後 年齡相關的 副曱狀腺機能亢進 甲狀腺機能亢進 鈣、鎂磷和/或維生 素D缺乏 骨髓炎 無血管性壞死 創傷 柏哲德氏病(Paget’s disease) 皮膚 禿髮 斑禿 全禿 原發的 繼發的 男性形式禿髮 白斑病 區域化的 普遍化的 原發的 繼發的 糖尿病的潰瘍 周圍血管疾病 燒燙傷 自體免疫疾病 紅斑性狼瘡， Sjiogren · 風濕性關節炎， 腎小球腎炎， 血管炎 28 1355275

藍哲漢氏 (Langerhan ’ s)組織球 增生症 眼 / 視神經炎 鈍頭的的和穿刺性的 損傷、感染、類肉瘤、 鐮刀細胞疾病、視網 膜剝離、顳動脈炎 視網膜局部缺血、黃 斑變性、色素性視網 膜炎、動脈硬化性視 網膜病變、高血壓性 視網膜病變、視網膜 動脈阻塞、視網膜靜 脈阻塞、低血壓、糖 尿病性視網膜病變、 和黃斑部水腫。 胚胎與胎兒的疾病 窒息 局部缺血 CNS 慢性疲勞徵候群、急 性和慢性低滲性高滲 性徵候群、AIDS癡 呆、觸電 腦炎 腦膜炎 硬腦膜下血腫 尼古丁上癘 29 1355275

藥物濫用和=戒離 古柯驗、海洛英、 快克、大麻、LSD、 PCP、多重藥物濫 用、搖頭丸、類鸦 片、鎮靜安眠劑、 安非他命、咖_因 強迫症 脊椎管狹窄、橫向脊 髓炎、GuillianBarre 氏徵候群、創傷、神 經根壓迫、腫瘤壓迫、 熱中風 ENT 耳鳴 Meuniere氏徵候群 聽力喪失 創傷性損傷、 壓力傷害 腎 腎衰竭 急性、慢性 血管的/局部缺血 的，間質性疾病、 糖尿病性腎疾、腎 病徵候群、感染、 損傷、造影劑誘導 的、化學療法誘導 的、CPB誘導的、 或預防的 過敏性紫斑(Henoch S. )urpura) 30 ⑧ ^55275

橫紋肌 自體免疫病症 重症肌無力 皮肌炎 多發性肌炎 肌肉病變 遺傳之代謝性、内 分泌和毒性的 熱中風 擠壓傷 橫紋肌溶解 粒線體疾病 感染 壞死性筋膜炎 性功能不良 中央和周圍 (例如勃起功能障礙 症） 醫藥品，（糖尿病） 繼發的陽痿 肝 肝炎 病毒、細菌、寄生 蟲 局部缺血疾病 肝硬化、脂肪肝 浸潤性/代謝性疾病 胃腸的 腸局部缺血疾病 發炎性腸疾病 壞死性小腸結腸炎 器官移植 捐贈者與接受者的治 療 生殖道 不孕症 血管的 自體免疫的 子宮異常 植入性疾病 内分泌 腺體功能過盛或功能 低落 31 1355275 、上所提到的，&些疾病、病症或病狀僅只是說明 本發明化合物所提供的利益範圍…，本發明一般而古 提供機械性創傷或人類疾病之後果的治療性或預防性： 療”交佳者為CNS和/或周圍神經系統之疾病、病症或病 狀的治療或預防性治療。本發明提供具有精神病成分之疾 病、病症或病狀的治療或預防性治療。本發明提供包括但 於具有眼科、心血管 '心肺、呼吸、腎、泌尿、生殖、

B内刀泌或代謝成分之疾病 '病症或病狀的治 預防性治痛^ X 在一項具體實例中，此種包含本發明化合物之醫藥組 成物可全身性投藥以保護和促進目標細胞、組織或器宫。 此種投藥可為非經腸的、藉由吸人作料，或者經黏膜的， 例如.口服、鼻的、直腸的、陰道内的、舌下的、黏膜下 的、或經皮的。較好是該投藥是非經腸的，例如經由靜脈 内或腹膜内注射’以及也包括但不限於動脈内、肌内、皮 内和皮下投藥。 對於其他投藥途徑而言，如利用灌流、注射到器宫或 其他局部投藥而言’醫藥組成物會以造成以上所說明知本 發明化合物的相似浪度來提供。較好的濃度是大約 0·01ρΜ-30ηΜ。 本發明的醫藥組成物可包括治療上有效量的化合物和 醫藥上可接受的載劑。在-項特定的具體實例中，「醫藥 上可接受的」一詞意指經過美國聯邦或州政府的管理局核 准或是登錄在美國藥典或其他一般所知的外國藥典中用‘ ⑧ 32 1355275 動物且更特別是用於人 「劑 劑一起π & 戰μ」一岡係指與該治療 要=稀釋劑、佐劑、賦形劑'或運輸劑。此種-2二载劑可為消毒過的液體，包括鹽的水溶液和油，包 油、動物、植物或人工合成來源的油，如花生油、黃 二：物油、芝麻油及類似者。當該醫藥組成物是以靜 右V糖k式投藥時，鹽水溶液是較佳的載劑。鹽水溶液和 疋水溶液及甘油溶液亦可採用作為

::可注射溶液。適當的醫藥賦形劑心葡:糖疋 =、嚴糖、明膠、麥芽糖、米、麵粉、白Η膠、硬 月曰酸鈉、單硬脂酸甘油酯、 月石氣化鈉、脫脂奶粉、甘 丙稀' 一酵、水、乙醇、及類似去 及頬似者。该組成物若需要 亦可包含少量的濕潤劑或乳化劑，或ΡΗ㈣劑。這此电 ί物可呈溶液、懸浮液、乳化物、藥片、藥丸、膠囊：粉 Μ持久釋放的調配物、及類似者。該组成物可用傳統的 ，·、口 σ劑和載劑如三酸甘油酷嘴 k甘油sa δ周配成栓劑。本發明的化合物 可調配成中性的或鹽的形式。醫藥上可接受的鹽包括與自 由胺基所形成者’如衍生自鹽醆、磷酸、乙酸、草酸 石酸等的鹽’以及與自由㈣所形成的者，如衍m 鉀、銨，、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2_乙胺基乙醇、 組胺酸、普魯卡因（procaine)等的鹽。適當之醫藥載劑 的實例說明在mMartin編著的《莱明敦氏醫藥科學》。 此種組成物包含治療上有效量化合物’較好是以其純化的 形式，與適當量之載劑一刼，，、，4β ^ 戰起以提供適於投藥給病患的形 式。該調配物應適合投藥的方式。 33 1355275 適用於口服的醫藥組成物可以呈膠囊或藥片；粉末戍 顆粒；溶液、糖漿或懸浮液（在水溶液或非水溶液的液體 中），可食性泡洙或攪打物；或是乳化物的形式提供◊藥片 或硬式的明膠膠囊可包含乳糖、澱粉、或其衍生物、硬脂 酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂、硬脂酸、或其鹽。軟式 明膠膠囊可包含植物油、蠟、脂肪、半固體、或液體多醇 等。溶液和糖漿可包含水、多醇與糖。 一種意圖用於口服的活性用劑可用延遲該活性成分在 腸胃道中分解和/或吸收的材質(例如可使用單硬脂酸甘油 酯或二硬脂酸甘油酯）將其包覆或與之混合。因此，活性成 分的持續釋放可經許多小時來達成，並且若需要該活性用 劑可經保護而免於在胃裡被分解。用於口服的醫藥組成物 可經調配以輔助活性用劑因特定@ PH或酵素條件而在特 別的胃腸道部位釋放。 適用於經皮投藥的醫藥組成物可以用分開的貼布來提 供，該貼布意圖與接受者的表皮層保持密切的接觸歷經延 長的期間°適用於局部投藥的醫藥組成物可以軟膏、乳霜、 懸浮液、乳液、粉末、受 . 1; — /液、β狀物、膠體、喷灑劑、氣 或油提供。對於局部投藥到皮膚、口、眼或其他外部 'Π而言，較好使用局部用途的軟膏或乳霜。在調配成軟 …该活性成分可與石蠟的或不與水混合的軟膏基底一 :::木用。f者’該活性成分可與油在水中或水在油中的 基底调配在乳霜中。纟商 、用在局部投藥於眼的醫藥組成物包 括眼滴劑。在這4b組成胳 —、且成物中，活性成分可溶解或懸浮在適

34 1355275 當的载劑中，例如在水溶液的溶劑令。適用於局部投藥於 口的醫藥組成物包括錠劑、菱形藥片和漱口水。 適用於鼻部和肺部投藥的醫藥組成物可包含藥物載劑 如私末（較好是具有範圍在2〇到5〇〇微米的顆粒大小）。粉 末可以用吸鼻煙的方式投藥，亦即藉由快速經鼻從靠近鼻 子的粉末容器吸入。或者，適用於鼻投藥的組成物可包括 液體載劑，例如鼻噴劑或鼻滴劑。或者，直接吸入肺可藉 由深的吸入來達成或通過吹管吸入到口咽。這些組成物^ 包括活性成分的水溶液或油溶液。藉由吸入法投藥的組成 物可以特殊修改而適用的裝置來提供，包括但不限於加壓 的嘴霧劑、喷霧器或吹氣機，其可經建構以提供預定之活 性成分的劑量。在一項較佳的且體 貝敉佺的具體貫例中，本發明的醫藥 組成物經直接投藥到鼻腔或經由鼻腔或口咽而進入肺。’、 =用：直腸投藥的醫藥組成物可用拴劑或灌腸劑的方 式k供。適用於陰道投藥的醫藥組成物可以子宮托 礼相 '膠體、膏狀物、泡沐、或噴灑用的調配物來提 ㈣腸的醫藥組成物包括水溶液的或非水溶液 的“之可注射溶液或懸浮液，其可包含抗氧化劑、 劑、抑菌劑' 和使組成物基 受者之血液等張之溶質W:二：圖對其投藥的接 分貝J孖在於此種組成物中的苴#士 分包括例如水、醇類、多醇、甘油和植物 ： 腸投藥的組成物可以單位劑或多劑容器=於， 航子1可貯存在冷决乾燥的條件下，只 35 1355275 需在使用之前立即添 的消毒鹽溶液即可1席=液體載劑，例如用於注射 毒過的粉末…'主射'容液和懸浮液可由消 供-種含有本發明化合物之可注射溶液==，可提 。隻車w救至、和戰場處境的緊急用途 裝設下自行投荜，十1 e a 赴主疋在豕庭 創傷切除發生時，例如因為輕 π卓機所造成者。切斷的腳和腳趾中細胞和組織於 再連接之後存活的可能性會因為盡實行上之可能，迅速將 本發明化合物投藥到切斷部分的多重部位，甚至在固定場 所的醫事人員抵達之前’或腳趾切斷之受苦個人抵達急： 室之前就投藥而增加。 ^ 在一項較佳的具體實例中，該組成物是依照例行的方 法調配成適用於經靜脈内投藥至人體的醫藥組成物。典型 上，靜脈内投藥的組成物是在消毒的等張緩衝水溶液中之 溶液。當需要時，該緩衝液亦可包括溶離劑和局部麻醉劑 如利多卡因（lidocaine)以緩解注射部位的疼痛。一般而言， 該成分是以分開或混合在一起的方式以單劑的形式供應， 例如呈冷凍乾燥的乾粉或是不含水的濃縮物裝在不透氣密 封的容器中’如指出活性劑用量之安瓶或藥囊（sachette) 中。當該組成物要以輸注方式投藥時，其可用含有消毒之 醫藥等級的水或鹽水之輸注瓶來施與。當該組成物要以注 射方式投藥時，可以提供含消毒鹽水的安瓿使成分可在投 藥前先混合好。 栓劑一般包含了重量在〇」％到10%範圍的活性成分； 36 1355275 口服調·配物較好是包含1 0。/〇到95%的活性成分。 ' 灌流劑組成物可以被提供以使用於移植器官浸洛、 位的灌流’或用於在器官取得前投藥至器官捐贈二 管。此種醫藥組成物可包含並不適用於急性或慢性 或全身投藥到個體之本發明化合物的濃度，但卻能提^ 說明書中所意圖之功能：在屍體、器官浸浴、或在移出、前 的原位灌流、或在被處理的器官或組織暴露或歸回一二 常循環前降低其中所含之本發明化合物濃度。 " 本發:月也提供包含一個或多個裝有本發明之—種 於τ種醫藥组成物成分之容器的醫藥組裝或套 :與此種容器關聯者可能是呈現管理醫藥品或 = 2、使用或銷售的政府機關之處方形式…：二 行為。 其使用於人體之投藥的製造、使用或銷售 於制^出ΐ另一項具體實例中，本發明的化合物可在經 :注=進行輸送。例如1多肽可利用靜脈内 投藥方式來::渗：幫=經皮的貼布、脂質體、或其他 考Lan '、在項具體實例中，使用一種幫浦（請參 之會Π:在前；Μ—’ 1987年，《CRC生物醫學工程 》’第14期：第201頁；Buchwald等人，198〇 t二科手術》，第88期：第5〇7頁—等人，1989 -項具體實例中，；：物;第放^ 其是脂質在—種運輸劑中輸送，尤 *考Langer，《科學》，第249期：第1527-1 533 37 1355275 頁（1990年）；Treat等人，《脂質體在傳染性疾病與癌症治 療中》，Lopez-Berestein和Fidler(編著），紐約Liss出版 公司，第353-3 65頁（1989年）；WO 91/04014 ;美國專利 案第 4,704,355 號；Lopez-Berestein，同前引述，第 317-327 頁；一般而言參考同前）。在另一項具體實例中，可以使用

聚合物的材質（請參考《控制性釋出的醫學應用》，Langer 和Wise(編著），CRC出版品：位於佛羅里達州的BocaRalton 市，1974年；《經控制的藥物可獲性，藥物產品設計與性 能》，Smolen和Ball(編著），紐約的Wiley公司出版（1984 年）；Ranger和peppas，《大分子科學評論與大分子化學》， 第23期：第61頁，1953年；亦請參考Levy等人’ 1985 年，《科學》’第228期：第190頁·，During等人，！989 年’《神經學年鑑》’第2S期：第351頁；H〇ward等人， 1989年，《神經手術雜誌》，第25期：第351頁；Howard 等人，1989年，《神經手術雜誌》，第71期：第ι〇5頁）。 在，有另一項具體實例中，經控制的釋出系統可以被 放置在靠近治療目標，亦即目標細胞、組織或器官處，因 此/、而要。卩伤的全身劑量（請參考例如G〇〇ds〇n，第丨15_ 138頁在《控制性釋出的醫學應用》，第二卷，同上，胸 年）。其他經控制的釋出系統由Langer在評論中做過討論 年’一《科學》’第249期：第i527_i533頁）。 —在另員具體實例中，正確調配的本發明的化合物可 1鼻白勺口服的、直腸的、陰道的或舌下的方式投藥。 在項特疋的具體實例中，吾人可能希望局部投藥本 38 1355275 發明的組成物到需要治療的部位，這可例如但卻非限制地 藉由手術期間局部輸注、局部施用，例如在手術之後與傷 處包紮連同在一起、藉由注射、經由導管、經由栓劑、或 經由植入，該植入物是多孔的，或像明膠似的物質，包括： 膜’如矽橡膠（silastic)膜，或纖維。 較佳有效劑量的挑選將由熟習本技藝者根據考慮數種 熟習本技藝者已知的因素來決定。此種因素包括本發明之 化合物的特殊形式，其藥物動力學的參數如生物可獲性、 代謝作用、半生期等’其在常見的研發過程中就已經被建 立了，該過程經採用以獲得管理方面對醫藥化合物的核 准。劑量考慮的更多因素包括待治療的病狀或病況或在正 吊個體中想達到的好處、病患的體重、投藥的途徑、該投 藥疋急性的還是慢性的、伴隨使用的醫藥品，和其他已知 會影響被投藥的醫藥用劑之效能的因素。因此詳細的劑量 應根據實打者和每一位病患的狀況，例如視個別病患的病 狀和免疫狀況而定，以及根據標準的臨床技術來決定。 在本發明的另一方面，灌流劑與灌流液被提供用於灌 流和貯存器官以供移植，該灌流溶液包含某量之本發明的 化σ物其有效於保護反應的細胞與關聯的細胞、組織或 器官。移植物包括但不限於異體移植，其中一項器官（包括 細胞組織或其他身體的部分）從捐贈者身上取得並且移植 到相異的接受者體内；和自體移植，纟中該器官從身體的 -個部分取出並且置換在另—處，包括在工作檯進行的外 科手術，纟t將器官移出，並且在體外切除、修補、或者 ⑧ 1355275 操作如對於腫瘤移除者，然後將其歸還原先的位置。在一 項具體實例中，該灌流液是威斯康辛大學（uw)溶液（美國 專利案第4,798,824號），其包含大約i到大約25U/毫升的 促紅血球生成素、5%羥乙基澱粉（具有從2〇〇,〇〇〇糾大約 300,000的分子量並且本質上不含有乙二醇、2氣乙醇 (ethylene chlorohydrin)、氯化鈉和丙酮）；25mM KH2p〇4 ; 3mM榖胱甘肽，5mM腺芽；i〇mM葡萄糖；i〇mM HEPES 緩衝液；5mM葡萄糖酸鎂；i 5mM葡萄糖 酸鈉；20.0,000單位的青黴素、4〇單位胰島素；16毫克地 塞米松（Dexamethasone) ; 12毫克酚紅；並且具有74·7 5 的pH以及大約320mOSmn的滲透壓。該溶液被使用以在 移植前維持屍體的腎臟和胰臟。利用該溶液，保存可延長 超過對屍體之腎保存所建議之30小時的限制。這項特殊 的灌流劑僅只是說明許多可以納入有效量之本發明化合物 而修改成本用途的溶液的例示。在還有一項具體實例中， 該灌流液包含從大約〇_〇lpg/ml到大約4〇〇ng/mi本發明的 化合物’或從大約40到大約30〇1^/1111之本發明的化合物。 雖然通貫本說明書用途中本發明之化合物的較佳接受 者是人類’但是本說明書中的方法同等的被投藥在其他哺 乳動物，尤其是、馴養的動物、家畜、寵物和動物園的動 物。然而’本發明並非那麼具限制性並且其好處可應用到 任何哺乳動物身上。 本發明化合物的治療和防護用途 如以下實施例1所提出的，在腦部毛細血管之人類内 40 1355275 皮中促紅血球生成素文體的存在指出本發明化合物的標乾 存在於人腦，並且對於這些本發明化合物進行的動物研究 可以直接翻譯成對於人類的治療或預防。 在本發明的另一方面’促進未藉由内皮細胞障礙從血 管分離出來的細胞、組織或器官的存活性之方法及組成物 乃藉由將細胞、組織或器官直接暴露於包含本發明化合物 之醫藥組成物中，或將包含本發明化合物的醫藥組成物投 藥或接觸該組織或器官的血管。被處理之組織或器官中反 應細胞的活性促進反應出其所施行的正面效應。 如以上說明，本發明部分根據促紅血球生成素分子可 從具有内皮細胞緊密接縫之器官（包括腦、視網膜和睪丸） 之微血管的内皮細胞腔表面運輸到基膜表面的發現。因 此，跨過該障礙的反應細胞是容易受本發明之化合物有利 作用的標靶，且包含和整體或部分依賴其中之反應細胞的 其他細胞型式或組織或器官是本發明方法的標的。雖不希 望被任何特殊的理論所束缚，但是在本發明化合物的轉移 胞飲之後’本發明的化合物可與例如神經元、視網膜、肌 肉、心臟、肺、肝、腎、小腸、腎上腺皮質、腎上腺髓質、 柄支血管内皮、睪丸、印巢、腺臟、骨頭、皮膚，或是子宮 内細胞之反應細胞上的促紅血球生成素受體交互作用，而 且受體、纟C» &可讓jg號轉導作用的級聯起始，造成反應細胞 或組織中基因表現程式的活化’使得細胞或組織、或器官 免於受到如毒素、化學治療劑、放射療法、缺氧等的損傷。 因此’保護反應細胞的組織免於受到損傷或缺氧壓力，並 41 1355275 且增進此種組織之功能的方法在以下本說明書中有說明： 如以上所提到的，本發明的方法同等地適用於人類2及其 他動物。 Z' 在本發明之一項具體實例的實行中，使哺乳動物病患 進仃用於癌症治療之全身性化學治療，包括放射療法，其 普遍的具有副作用如對神經、肺、心、卵巢、或筆丸的損 傷。包含以上所說明本發明化合物之醫藥組成物的投藥是 在化學療法和/或放射療法之前與進行期間實施的，以保蠖 各種組織和器官免於受到化學治療劑的損傷，如保镬睪 丸。治療可以繼續進行直到化學治療 於哺乳動物身體之可能有危險的濃度療Γ下循展濃度降到低 車事體㈣的實行f，吾人計劃從汽 复 i取付各種裔官用以移植到若干接受者 之二中某些接受者需要長途和長時段的運輸。在取得 。。吕之别，先將掁難者輸注以包含如本說 本發明化合物的醫藥組成物。為了運送而取；：：:： ::::::中所說明之本發明化合物的灌流劑灌流:並 灌本發明化合物的浸浴中。某些器官用脈衝式的 進行灌本發明利用含本發明化合物的灌流劑持續 行斤位的^功能變壞發生在運輪期間和器官進 仃原位植入和再灌流時。 在本發明的另一項具體實例中，一 科手術需要暫時的、、総r $ 項乜補心瓣膜的外 4微克"…重痺和動脈關I在手術之前，用 本發明化合物對病患進行輸注。此種處

(D 42 1355275 理是要防止缺氧的局部缺血性的細胞損傷，尤其是在再灌 流之後。 在本發明的另一項具體實例中，任何外科手術過程， 如在心肺繞道手術中，可使用本發明的一種化合物。在一 項具體實例中，包含以上所說明本發明化合物之一種醫藥 組成物的技藥疋在繞道手術之前、期間、和/或接在其後進 行的’以保護腦、心和其他器官的功能。 在先前本發明的一種化合物被用於體外施用，或用於 治療反應細胞如神經元組織、視網膜組織、心、肺、肝、 小腸、腎上腺皮質、腎上腺髓質、微血管内皮、睪丸、卵 巢、或是子宮内細胞或組織的實例中，本發明提供一種呈 劑量單位形式的醫藥組成物，其適用於保護或促進遠離血 管網的反應細胞、組織或器官，該組成物每單位劑包含範 圍在大約 O.Olpg 到 5mg，lpg-5mg，500pg-5mg，lng-5mg , 500ng 5mg g_5mg ’ 5 00 " g-5mg ’ 或 lmg_5mg 有效之 非毒性用量之本發明化合物和一種醫藥上可接受的載劑。 在一項較佳的具體實例中，本發明化合物的用量是在大約 lng-5mg 範圍。 在本發明的還有一方面，EP〇的投藥被發現能回復受 到腦損傷之動物的認知功能。本發明的化合物被預期具有 和EPO相同的細胞保護作用。在5天或3〇天的延遲之後， 與偽治療的動物相比EP0仍能回復功能，指出Ep〇之再 生或回復腦活性的能力。因&，本發明亦導向本發明化合 物用於製備治療腦創傷和其他認知功能缺損之醫藥組成物 43 1355275 的用途’包括就在損傷發生後的治療（例如三天、五天、— 週、一個月或更長的時間)。本發明亦導向在損傷發生後藉 者投樂有效量的本發明化合物治療認知功能缺損的方法。 如本說明書中說明之本發明的杠 尽發明的任—化合物均可用於本發明 的此一方面。 而且’本發明的這種回指的古 J、裡U復的方面係導向任何本說明金 中之本發明化合物用於製備使細胞、組織或器官功能缺： 回復的醫樂組成物的用it，其中治療是在而且就在最初造 成該功能缺損的攻擊之後便開始。而i，利用本發明化合 物的治療可跨急性期以及慢性期間之疾病或病症的過程 在化合物具有促紅血球生成活性的情形之中，化合物 可以每次投藥介於大約i微克和大約1〇〇微克/公斤體；， 較好是大約5-50微克/公斤體重，最好是1〇_3〇微克/公斤 體重的劑量進行全身性地投藥。此種有效劑量應有效於在 投藥化合物之後達到大於大約1〇,〇〇〇、15,〇〇〇或 20,000mU/ml血清的血清濃度。此種血清濃度可在投藥後 大約1，2,3,4,5,6,7,8,9或1〇小時達到。此種劑量可依需要 重複。例如只要臨床上需要可以每日投藥，或在適當的間 隔之後，例如4 i到12週，但較好是每""週投藥。 有效的化合物量和醫藥上可接受的載劑可以包裝在單劑的 小瓶或其他容器中。然而本發明的化合物是非促紅血球生 成性的，亦、即其能產生本說明說所說明的活性而不會引起 紅血球濃度或血球比容增加。此種非紅血球生成性的化合 物在本發明的方法被意圖長期提供的情形之中尤佳。在另 1355275 一項具體實例中，本發明沾儿A 一 月的化合物是以比最大刺 球生成作用所需的對等天鈇 促，.工血 大的劑量施給的。如以上揾 ）逻 促紅血球生成活性，且因 八有 因此以上劑量以單位表示僅只是竹 為對等量天然促紅血球生出 硃生成素之範例；以上本說 了劑量的莫耳當量，直可镝田〜丄外 曰捉供 ，、了適用於本發明的任何化合物。 實施例

本發明可藉由參考以下非限制性的實例而得到較佳 瞭解，以下實例的提供是作為本發明的範例。以下實施例 的提供是為了更完全地說明本發明的較佳具體實例 '然而 其不應絲何方式被解讀最對本發明之廣泛範圍之限制、。 實施例1 胺曱醯化促紅血球生成素的生產 在此實施例中該方法的起始物質是純化的重組人類 EPO 〇 首先，该蛋白質濃度是藉由超過濾調整以達到保持低 操作體積的目的。該蛋白質濃度經調整為3毫克/毫升。超 過濾是利用具有5kDa MWCO之BioMax(Millip〇re公司出 品）實行的。 在完成濃縮步驟之後，將EPO溶液與〇.5M硼酸卸四 水合物0.5M氰酸鉀，ρΗ9·〇混合，該溶液在32^經培育24 小時。 將ΕΡΟ和氰酸鹽的反應混合物脫鹽是用膠體過遽法進 行的。該蛋白質經脫鹽至25mM Tris，50mM NaCl ρΗ8·5緩 45 丨1355275 v - 衝液。採用G-25細粒樹脂（Amersham Biosciences公司出 品）。 利用90公分/小時的流速在大約15公分高的管柱上施 加大約2〇%管柱容量的試樣裝載量。 . 收集脫鹽的胺曱醯化EPO以備進一步加工。 •在此時，聚合物/集結物的含量為7 3 %。 下一步驟是藉由利用陰離子交換作用的純化步驟移除 集結物和聚合物。採用SOURCE 30Q樹脂（Amersham ® Bl0sciences公司出品）進行純化。將大約4.5毫克/毫升胺 甲酿化的EP0施加在管柱上。 流動緩衝液 A 是：25mM Tris，50mM NaCl pH8.5，而 ‘ 洗提緩衝液 B : 25mM Tris，lM NaCl pH8.5。以 0-30%進行 梯度經過2〇倍的管柱容積，收集主要的胺甲醢化Epo尖 峰並將其匯集起來。 把得自純化步驟的匯集物調整到>〇·5毫克/毫升的濃 _ 度，並利用透析/超過濾的切線流動過濾單元將緩衝液改變 成20mM檸檬酸鹽，1 〇〇mM NaCl緩衝液。 濃度和緩衝液的改變是在具有5kDa MWC〇之〇丨爪2 BioMax(Millip〇re公司出品）上進行的。 最後利用Millipak濾器（MiUip〇re公司出品）對純化的 生"J·藥物進 亍0，2 2微米過遽'以減低病菌。 該方法產:生具有使其有用於作為生醫藥品性質之胺甲 醯化的EPO ; •以SEC.HPLC測定的聚合物/集結物的含量為〇 5% 46 1355275 •以胺基酸分析測定出胺甲醯化的離胺酸為1 00% •濃度是>0.5毫克/毫升 利用MALDI-TOF锻認特徵以測定PNGase處理的蛋 白質和有N-聚糖之蛋白質二者的完整質量變化。此外 MALDI-TOF §太質量指紋分析/LC-MS/MS分析進行如下： 1. CEPO 和 EPO 是在 PORPS R1 管柱（p〇R〇s R1 逆相 管柱材質，PerSeptive Biosystems 公司出品（1-1 259-06))上 進行純化的。使用前將管柱材質貯存在50%HiPerSolv中 以供 HPLC VWR 152525R。使 R1管柱在 5%甲酸 (3 3 105，Riedl de Haen出品）中平衡和沖洗。用 Agilent MALDI HCCA品質的基質溶液（G2037A)將試樣從管柱溶離 出來。完整的質量是利用Bruker ReFlex IV MALDI-TOF儀 器分析所測量出來的。 2. 用 1單位PNGase F和PNGaseF/O-糖苷酶處理 0.3pmol的CEPO和/或EPO。利用MALDI-TOF測定總質 量。

3. 用50微升10mM DTT、50mM NH4C03還原溶液中 的CEPO和EPO(1.5pmol)並緊接著在50微升55mM碘乙 醯胺、50mM NH4C03中進行烷基化作用。在胰蛋白酶消化 之前先使試樣在POROS R1管柱上進行純化。於MALDI-TOF分析之前取一部分經過消化的試樣在POROS R2管柱 上進行純化。POROS 50 R2 PerSeptive Biosystems(l-1159-05)。使R2管柱在0.1 %三氟乙酸（99+%光譜分析級，Aldrich 公司302031-100毫升）中平衡和沖洗。用 Agilent MALDI 47 1355275 HCCA品質的基質溶液（G2037A)將試樣從管柱洗提。 將得自胰蛋白酶消化作用的肽匯集物用PNGase F處 理且在POROS R2管柱上純化，並且用MALDI-TOF鑑認 ' 其特徵。 . 4.用DTT使CEPO和EPO在溶液中還原並且用碘乙醯 胺將其烷基化。在Glu-C消化作用之前將試樣在POROS R1 管柱上純化。在MALDI-TOF分析之前將一部份消化後的 試樣在POROS R2管柱上純化。把得自Glu-C消化作用之 • 肽的匯集物以PNGase F處理並且用POROS R2管柱純化。 5.為了排除有部分胺甲醯化的CEPO之可能性，因此 將完整的EPO和CEPO用Lys-C進行消化。利用MALDI-. TOF分析試樣。 參考文獻： 以MS進行蛋白質鑑認的一般方法

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消化物/grafit :

Larsen MR，Hojrup p，Roepstorff ρ·(2005 年），〈利用 兩步驟蛋白質分解消化作用併同一系列微管柱和質譜對膠 體分離的醣蛋白進行特徵鑑認〉，《分子細胞蛋白質體學》， 4(2)，第 107-19 頁。 結論是8個離胺酸和N_端被胺甲醯化。沒有其他胺甲 醯化的胺基酸被偵測到且沒有聚糖之修飾作用被偵測到。 吾人進行另外的研究以分析EP0胺甲醯化的均質程 度、胺甲醯化作用的特定性和胺曱醢化作用位置的性質、 以及由於胺甲醯化作用與純化方法之副反應之可能非特定 修飾的存在。試樣的分析係藉由去糖基化蛋白質試樣的總 質量分析和藉由利用蛋白質内切酶LysC和胰蛋白酶消化 及LC/MS分析之蛋白質作圖（mapping)所進行的肽作圖。 實施例2 總質量分析

利用實施例1的方法對三種胺甲醯化的Ep〇試樣進行 分析。在胺甲醯化反應之後所有的三個試樣都用陰離子交 換作用純化，如實施例1中所說明者。CEp〇試樣之一（以 CEP0-CMC標示）是利用CMC Biotech從1公克的生產規 模（濃度·· 0.82亳克/毫升；緩衝液：2〇mM檸檬酸納，〇 轉檬酸’ 0· m Naa，PH6.9-7·3)製備的。剩餘的兩個試樣， 以CEP0]和CEP0_2標示，則是從7G毫克實驗室生產規 模（濃度】.1毫克/毫升，緩衝液：25mM Tds，， ρΗ8·3-8·7)製傷的。將這些CEP0試樣與未經過修飾的或起 49 1355275 。的EP〇(/辰度·〇·82毫克/毫升；緩衝液：2福檸檬酸鈉， 0·3福擰檬酸，〇.1M NaC卜ρΗ6 9·7 3)和偽cEp〇(即經歷 未添加氰酸鉀之胺甲醯化過程的Ep〇)(濃度：〇 38毫克/毫 升，緩衝液_ 2〇mM擰檬酸鈉，〇.3mM檸檬酸，〇 m NaC1， PH6.9-7.3)比較。 ESI-質譜分析術 >在總質量分析之前，將試樣用酵素方式去糖基化。將 每—試樣與5〇微克N_糖苷酶F(購自Glyk〇公司之 Isozyme)、得自節桿菌（A ureafaciens)的重組神經胺酸苷 酶和〇-糖苷酶在0·5毫克/毫升的蛋白質濃度下一起培育至 隔夜。用SDS-PAGE藉著裝載3微克每種試樣到咖如· 甘胺酸膠體上以檢查去糖基化反應是否完成。每種試樣之 剩餘材料則用於質量分析。 藉著添加適當體積的鹽酸胍.貯存溶液使去糖基化的試 樣達到4-5M鹽酸胍的濃度，並且進接著脫鹽到含有甲 酸和40。/。乙腈（acenitril)的緩衝液中。添加鹽酸胍是為了確 保高度回收去糖基化的EP0和CEP〇以備進行質譜分析。 利用提供有ESI-奈米喷霧離子化源之Waters公司出品的 ESI-Q-Tof或Waters公司出品的ESI_LCt質譜儀進行質量 的測I。數據的評估是利用Mass Lynx 4.0軟體并由自動 反摺積（deconvolation)和藉由手動評估特定之有興趣的+ 峰來進行的。相異胺甲醯化CEP05種之相對比率的定量2 是根據紀錄在m/z譜中的信號強度藉由計算相對比率來達 成0 1355275 •試樣的去糖基作用造成N•連接的糖被完全移除掉。缺 而，〇-連接的糖卻不完全地釋出，尤其對CEp〇試樣而言 是如此。 如吾人所預期的，因為胺甲酿化作用，cEp〇試樣顯 示與ΕΡ0和偽CEP0試樣不同的質譜。如表2所示，對質 έ普進行反摺積產生如理論上對於久錄4 ^ ' 了於各種试樣所預期的主要尖 峰之質量。在所有的CEP0試樣中，0 '你1Τ ’ ^、有兩度胺曱醯化的 CEP0分子被發現’而其主要的異構形式是完全胺甲酿化 的異構形式’其具有完全胺甲酿化的8個離胺酸和ν端， 亦即有9個胺甲醯基殘基。CEP〇試樣顯示出其異質性’ 其含有另外的相對於8,10和11伽；查拉ζ丨^ 個連接到CEP0之胺曱醯 化殘基異構形式。含有8個胺甲^ 妝T酿基殘基的種類可經標示 為低度胺甲醯化的，至少有—個胺甲酿基殘基不見了。且 有1〇和11個胺甲醢基殘基的種類可標示為過度胺甲醯化 的，其中連接之過量的胺甲醯基殘基以非特定的方式结合 至離胺酸以㈣胺基酸。麵有試樣的請中有某些少數 信號’但沒有-者被認為是經非特定修飾之種類。在Ep〇 和CEPO試樣兩者之中發現某些少數信號並且被認為是已 經存在於起始ΕΡ0中的摻雜物。 51 1355275 表2 在總質量分析中所得到之去糖基化CEPO和EPO試樣的反摺積質量 試樣 理論上期望的質量 得到的質量 解釋 起始的EPO 18239 18237 一致 偽-CEPO 18239 18239 一致 CEPO-CMC 18626 (9x carb) 18583 8x carb 18626 9x carb 18669 1 Ox carb 18711 1 lx carb 18991 9x carb + 0-糖 CEPO-1 18626 (9x carb) 18583 8x carb 18626 9x carb 18669 1 Ox carb 18711 1 lx carb 18989 9x carb + 0-糖 CEPO-2 18626 (9x carb) 18584 8x carb 18626 9x carb 18669 1 Ox carb 18712 1 lx carb 18992 9x carb + 0-糖

Carb表示「胺曱醯化」 表3顯示各種異構形式的相對比率。低度胺曱醯化 • CEPO的範圍視試樣而定是全部CEPO的大約1.5到5.5%， 且過度胺曱醯化CEPO的範圍視試樣而定是全部CEPO的 大約1 1到22%。CEP0-1和CEP0-2具有相似的異構形式 分布，而CEPO-CMC與其他兩種試樣相較則具有較少低度 胺曱醯化的種類。不同的生產規模會產生具有不同分布的 產物，但是如表3所示對實驗室的生產規模而言，該生產 可以相似的結果重複進行。如本文件之別處所說明的，在 一個給定的生產規模下，該分布將會受到調整得自陰離子 交換管柱的匯聚情形而有所調整。 52 1355275 在表3之中的數字代表低度和過度胺曱醯化CEPO的 最小比率。所以這麼表示的理由是胺甲醯化作用的程度（8 倍到1 1倍）可能不會特定指出低度、完全和過度胺曱醯化 • CEPO的確切程度。例如，一個以質量分析測量含有8個 • 胺甲醯基殘基的CEPO分子可能只具有7個特定連接至離 胺酸的胺曱醯基殘基，且剩餘的胺甲醯基殘基則可能非特 定的連接至其他胺基酸。這種情形僅會被認為是低度胺曱 醯化，即使有非特定結合的胺甲醯基。反過來說，含有1 0 • 個胺甲醯基殘基的CEPO分子可能僅有8個殘基是特定連 接的而有兩個殘基則是非特定結合的。在這種情形中，CEPO 的異構形式僅被認為是過度胺甲醯化，雖然並非所有的離 . 胺酸都被胺曱醯化。 表3 胺甲醯化作用的程度與異質性：不同之經胺甲醯化CEPO種類的相對比率 編號 相對含量 胺曱醯化的 CEPO-MCM* CEP0-1* CEPO-2** 程度 1 8x carb 1.5% 5.1% 5.5% 2 9x carb 77% 83.3% 83.6% 3 1 Ox carb 19.8% 10.9% 10.2% 4 1 lx carb 1.7% 0.7% 0.7% 5 Σ No. 2-4 (>9x) 98.5% 94.9% 94.5% 6 Σ No. 3+4 (過度胺曱醯化） 21.5% 11.6% 10.9%

Carb表示「胺甲醯化」 *n=2 **n=l 53 1355275 i 實施例3

LysC 狀作圖（mappjng) ㈣和CEPO之肽作圖分析是利用蛋白質内切酶 和膜蛋白酶予以片段化來實行的。所有峨作圖分析是用 去糖基化_進行的。_酵素錄基化作以與使用蛋 白質内切酶的消化作用同時進行的。 將EPO和CEP〇試樣（每一者大約 和DTT —起培育以使其變性和還原。用

1 5〇微克）與鹽酸胍 破乙酸使自由的氫 硫基烷基化。使烷基化的試樣去鹽並使緩衝液利用一次拋 的膠體過濾管柱交換成適當的緩衝液β 同時將蛋白質内切酶、Ν_糖苷醃和神經胺酸苷酶添加 到烷基化的ΕΡΟ和CEPO試樣中。把試樣在37t：培育到隔 仪培月之後，將大約5微克的每一種消化產物施用到 RP HPLC/MS分析’使用購自ph〇monemjx公司的c 1 gRp

管柱併以購自Water公司的ESI-LCT來進行。把220nm的 uv信號和質譜儀中的總離子計數（TIC)記錄下來。為了鑑 認和定量所得到的肽，因此評估TIc。 因為LysC無法切斷胺甲醯化的離胺酸，所以吾人預 期若是所有的離胺酸都被胺甲醯化則以LySC所進行的消 化作用不會形成任何片段’這指明胺甲醯化作用的特定 性。在低度胺曱醯化作用的情形中，應會形成CEPO的特 定片段。表4列出理論上會從LysC對EPO、完整的和過 度胺甲醯化CEPO、和低度胺曱醯化的CEPO的消化作用 形成之片段。 54 1355275 表4

LysC肽作圖：理論上會從LysC對EPO、完整的和過 度胺甲醯化的的CEP〇和低度胺甲醯化的CEPO的消化作 用形成之肽/片段

EPO

肽的名稱 胺基酸 ^ 質量 胺基酸序列 起始-到 K1 1-20 2399.3 APPR LIDSR VLER YLLEAK K2 21-45 2804.2 EANITTGCAEHCSLN ENEITVPDDTK K3 46-52 _ 926.5 VNFYAWK K4 53-97 5022.7 RMEVGQQAVEVWQ GLALLSEAVLRGQA LLVNSSQPWEPLQL HVDK K5 98-116 ' 1954.2 AVSGLR SLTTLLR ALGAQK K6 (+ 0-糖） 117-140 ~~~ 2863.3 EAISPPDAASAAPLR TITADTFR K K7 141-152' 1498.8 LFR VYSNFLR GK K8 153-154~~' 259.2 LK K9 155-165 1242.5 LYTGEACRTGD

CEPO(完全胺甲醯化與過度胺曱醯化的) 片段名稱 胺基酸起始-到 質量 CEPO (9x carb) 1-165 19227 CEPO (ΙΟχ carb) 1-165 19270 CEPO (1 lx carb) 1-165 19313 低度胺曱醯化的CEP0(8x胺曱醯化) 非胺甲醯化的胺基 Ν-端片段的預期質量 〇端片段的預期質量 無(9χ胺甲醯化） 19227 — Ν-端 19184 55 1355275

Lys20 2443.9 16755.9 Lys45 5274.9 13924.8 Lys52 6227.0 12972.7 Lys97 11276.8 7923.0 Lys 116 13257.1 5942.6 Lysl40 16147.2 3052.4 Lys152 17672.0 1527.5 Lys154 17956.4 1244.3 如吾人所預期的，得自以LysC消化之EPO和CEPO 試樣的LysC肽式樣完全相異。用LysC消化起始的EPO 和偽CEPO會得到預期的肽式樣。在兩種試樣之中，K1至 K9之所有肽都可被鑑認到。肽K5和K1部分被非特定的 ® 方式所切割，在EPO和偽CEPO之中均如此。沒有顯著的 其他尖峰被鑑認到且與起始EPO比較在偽CEPO之LysC 圖譜中也並未短少任何尖峰。從這些數據，無人可以下結 論：在胺甲醯化作和純化過程當中，沒有顯著的EPO之非 特定共價修飾作用發生。 " CEPO試樣的肽圖譜與起始EPO有不同的肽式樣。其 有單一的主要尖峰和一些微小的尖峰。如表5所示，得自 該尖峰的質量與吾人對於未經切割的CEPO或對於得自 φ LysC切割低度胺甲醯化CEPO所得片段所預期的質量有良 好的關聯性。該主要尖峰（A)含有完整的、去糖基化的、胺 甲醯化的CEPO(9x胺曱醯基）和過度胺曱醯化的CEPO(10x 胺曱醯基）。四個微小的尖峰（Β·Ε)含有低度胺曱醯化的 CEP0(8x胺甲醯基），其包含有未在特定離胺酸上被胺甲醯 化之低度胺甲醯化CEPO的相異尖峰。尖峰B和C即包含 特定在Lys45上缺少胺曱醯化之低度胺曱醯化的CEPO， 而尖峰D和E則包含特定在Lys97上缺少胺曱醯化之低度 胺曱醯化的CEPO(表5)。 56 1355275 表5

LysC肽作圖：將實驗所得質量指派給理論上得自低度 胺曱酉Μ匕CEPO之CEPO片段 尖峰的編號 所得到的質量 解釋 預期的質量 A 19228 CEPO (9x carb + 0-糖） 19227 19271 CEPO (10x carb + 0·糖） 19270 B 18867 CEPO (9x carb w/o 0-糖） 18862 13926 CEPO-» 段（aa46-165) 13924.3 C 5276 CEPO-片段（aal-45) 5274.8 D 7924 CEPO-片段（aa98-165) 7922.4 E 11279 CEPO-片段（aal-97) 11276.6

在不同 CEPO試樣中尖峰的相對比率有某些差異。 φ CEPO試樣1和2和要比CEPO CMC具有更顯著的尖峰D 和E，指出其包含更多胺甲醯化的CEPO種類。 要定量與主要尖峰相關的微小尖峰由於技術上的限 制，因此是困難的。然而利用得自 UV偵測的尖峰面積作 為對各種種類之相對比率的粗略指標，可以估算出低度胺 曱醯化CEPO能佔試樣中少於10%的CEPO異構形式，而 CEPO-1和CEPO-2要比CEPO-CMC具有雙倍量的低度胺 曱醯化異構形式。利用使用在總質量分析之相同方法，定 量位在尖峰A之過度胺曱醯化種類，對CEPO-CMC而言 57 ⑧ 1355275 大約羌21%，而對CEP0-1和CEP0-2而言大約是12%。 總之，得自LysC肽作圖的數據與實施例2中說明的 總質量分析間有良好的吻合。CEPO-CMC包含較少低度胺 • 甲醯化的CEPO異構形式而CEPCM和CEP0-2則包含較 . 多過度胺甲醯化的CEPO異構形式。此項肽作圖也指出了 離胺酸45和離胺酸97可代表低度胺曱醯化的部位。 實施例4 胰蛋白酶肽作圖 _ 利用胰蛋白酶之試樣的消化作用說明在實施例3中。 用胰蛋白酶消化EPO和偽CEPO會產生如吾人所與預 期的肽式樣。在兩種試樣之中，大多數吾人對胰蛋白酶消 -化作用所預期的肽（T1到T2 1)可被鑑認出來，除了某些小 的一 _和二狀（如T2 1)之外。凊參考表6。如使用LysC進行 消化作用的情形中’和起始的EPO相比，偽CEPO沒有顯 著的其他尖峄也沒有消失的尖峰。從這些數據，吾人的結 論是在胺甲醯化和純化的過程中EP〇蛋白質未發生非特定 _ 的共價修飾6 CEPO試樣的肽式樣不同於未經過修飾的Epc^騰蛋 白酶一般會切在離胺酸和精胺酸，因此吾人期望在完全胺 甲醯化之EPO的情形中，只有藉由切割精胺酸的片段化作 用會發生。因此，在以胰蛋白酶取得肽式樣之後，可鑑認 出特定的胺甲醯化作用部位與非特定胺曱醯化的肽。假設 只被切在精胺酸（R)之吾人預期得自CEp〇之胰蛋白酶消化 作用所得的目太列示在表6之中。 58 1355275 表6 以胰蛋白酶消KEPO*CEPO所預期之肽的列表

EPO

肽的名稱 胺基酸 質量(MH) 胺基酸序列 起始-到 T1____ 1-4 439.3 APPR T? 5-10 763.4 LICDSR T1, 11-14 513.3 VLER T4 15-20 735.4 YLLEAK T5 21-45 2806.2 EANITTGCAEHCSLN ENITVPDDTK T6 46-52 926.5 VNFYAWK 丁7 53-53 174.1 R T8 54-76 2525.3 MEVGQQAVEVWQG LALLSEAVLR T9 77-97 2359.2 GQALLVNSSQPWEP LQLHVDK T10 98-103 601.4 AVSGLR T11 104-110 802.5 SLTTLLR T11 _ 111-116 娜.3 ALGAQK T13 (+0-糖） 117-131 m9^ EAISPPDAASAAPLR T14 132-139 923.5 TTTADTFR T15 140-140 146.1 K T16 141-143 4343~ LFR T17 144-150 89λ5 VYSNFLR T18 151-152 203J GK T19 153-154 — 259.2 LK T20 155-162 T YTGFAPR T21 163-165 §ΕΓ~- TGD CEPO(假設因為完全的胺甲醯化作用只切在Arg⑽ 肽的名稱 胺基酸 起始-到 ----- 真量(MH) 7：---- 胺基酸序列 R1 (lx carb) 1-4 4823 APPR R2 5-10 跑 LICDR R3 11-14 ~~~~ VLER R4 (3x carb) 15-53 ' 4717.2 --- YLLEAKEANITTGC AEHCSLNENITVPDD TKVNFYAWKR R5 54-76 2525.3 ---- MEVGQAVEVWQGL ALLSEAVLR -------- 59 1355275

R6 (lx carb) 77-103 2985.3 GQALLVNSSQPWEP LQLHVDKAVSGLR R7 104-110 802.5 SLTTLLR R8 (lx carb) (+ 0-糖） 111-131 2441.1 ALGAQKEAISPPDA ASAAPLR R9 132-139 923.5 TITADTFR RIO (lx carb) 140-143 605.4 KLFR Rll 144-150 897.5 VYSNFLR R12 (2x carb) 151-162 1481.7 GKLKLYTGEACR R13 163-165 291.1 TGD 在所有CEPO試樣中，所有預期得自胰蛋白酶切割的 肽均被鑑認為主要尖峰，而C端的肽R1 3除外。此肽也未 φ 在起始EPO或偽CEPO中發現。從只在精胺酸之特定切割 所得到的R1到R12尖峰佔CEPO試樣中所偵測到之大多 數的肽。而且所有含離胺酸的肽幾乎獨呈完全胺曱醯化的 形式。這些數據指出在離胺酸和N-端有高度特定的胺曱醯 4匕作用。 在所有CEPO試樣中，除了主要的肽以外，有六個少 數的肽也被偵測到。少數肽中有三個經由質譜分析鑑認為 胰蛋白酶切割過度胺曱醯化之CEPO之結果，而其餘的三 φ 個則得自低度胺甲醯化的CEPO。 表7列出在被分析之三種CEPO試樣的胰蛋白酶圖譜 中的所有肽。從完全和特定胺甲醯化的EPO所形成之高而 大量的肽R1到R12以一般字母表示，而正硝胺甲醯化的 EPO則另外的用粗體型式標示出來。最可能藉由切割低度 胺曱醯化的CEPO所形成之肽用斜體的型式標示出來，而 藉由切割過度胺曱醯化CEPO所形成之肽則用劃底線的型 式標示出來。 60 1355275 表7 胰蛋白酶肽圖譜：在CEPO之胰蛋白酶肽圖譜中鑑認出來的肽之列表 肽 質量 相對離子計 相對離子計 相對離子計 數(％)* 數(％)* 數(％)* CEPO-1 CEPO-2 CEPO-CMC R1 lxcarb 482.25 1.28 1.09 1.15 R2 763.35 7.87 8.49 8.15 R3 515.31 2.78 2.58 2.66 R4_bl_lxcarb (T6+T7 lxcarb 1125.6 0.17 0.2 0.15 R4 3xcarb 4717.2 1.5 0.80 1.32 R5 2525.34 11.44 9.56 9.54 R5 ox 2541.34 0.15 0.15 0.21 R5 Na 2547.32 0.15 0.13 0.14 R5 al 1869.97 0.17 0.17 0.16 R5 bl 673.38 0.29 0.27 0.25 T9=R6 al 2359.24 0.62 0.54 0.26 T10=R6_bl 602.35 0.95 0.8 0.65 R6 lxcarb 2985.60 15.36 14.48 15.78 R7 802.49 7.16 7.28 7.05 R7 lxcarb 845.49 ±1 ±1 ±! R8 lxcarb 2076.10 0.16 0.15 0.16 R8 lxcarb 2076.10 0.5 0.44 0.63 R8 SAO lxcar b " 2441.1 9.19 9.34 9.20 R9 923.47 9.85 11.11 10.58 RIO lxcarb 605.37 5.17 5.40 5.43 TRIO 2xcarb 648.^7 0.02 0.03 0.03 Rll 897.47 9.82 10.70 10.30 R12 al 2xcar b ~ _ 806.46 0.20 0.22 0.17 R12_2xcarb 1481.73 7.91 7.90 7.84 R12 3xcarb 1524.74 0.28 0.26 0.59 R13 291.11 — — — *-相對於TIC中計數的總數目之強度

1 -以人工手動評估所發現；確定其信號具特定性 參考表7，個別含有肽R6_al和R6_bl的微小尖峄之 61 ⑧ 1355275 T9和T10最可能得自未在Lys97被胺甲醯化的低度胺曱醯 化CEPO分子之切割。若是Lys45未被胺甲醯化，則會形 成肽 R4_bl + lxcarb» 狀 R6_al(尖峰 T9)在 CEPO-1 和 CEPO-2 試樣中要比在CEPO-CMC中大量，這指出前者可能具有雙 倍量之低度胺曱醯化的CEPO。在所有的CEPO試樣中R6_bl 和R4_b 1 + 1 xcarb以等量存在。 從這些數據計算低度胺甲醢化CEPO的相對含量由於 技術上的限制因此是困難的。然而，把所有所觀察到者放 在一起’從總質量分析與LysC肽作圖估算出低度胺甲醯 化的種類大約為10%。 其他三種與其他狀共同洗提出的少量.狀以質量解釋係 為包含一個多出的胺甲醯基殘基，亦即過度胺甲醯化的 CEPO。肽Ri〇—2xcarb和R7_lxcarb以微量被偵測到，而 R12一3xcarb被發現具有顯著的信號強度。CEPO-CMC具有 的過度胺甲醯化CEPO種之含量是CEPO-1和CEPO-2的 兩倍高。這與得自總質量分析的結果相符合。吾人亦可從 這些結果得到結論：EPO的15 1 -62胺基酸序列是進行非特 定胺曱醯化的部位。 再者’基於和定量低度胺甲醯化作用相同的理由，定 置過度胺曱酿化的種類是有困難的。然而，假設僅在胺甲 酿化的程度上有差異之肽的離子化效率相似，則由R1 2衍 生物的相對離子計數計算出大約3-7〇/〇的CEPO是過度胺曱 醯化的種類。這低於藉由總質量分析所計算出來之過度胺 曱醯化之異構形式的量。 62 1355275

一般而言，可從EPO和CEP〇的總質量分析與肽作圖 數據做出以下的結論。 從總質量分析，CEPO試樣顯然被胺曱醯化至相當高 的耘度。大約95-98%的所有分子被完全胺曱醯化並且含有 至>、9個胺曱醯基殘基（s青參考表3)。LysC與騰蛋白酶作 圖確認在特定部位有高度的胺甲醯化，並且最可能超過95% 的CEPO分子在8個離胺酸與N端上完全被胺甲醯化。 數據亦顯示有四種CEPO的異構形式被發現。在被分 析的CEPO試樣中偵測到具有8、9、1〇、和丨丨個胺曱醯 基殘基的種類，而具有9個胺曱醯基之異構形式為主要的 種類。微少部分的CEPO分子包含8個而非9個胺平醯基 殘基，並且被認為是低度胺甲醯化的。對於CEp〇 i和 CEPO-2而吕，廷些異構形式大約是全部的，而對於 CEPO-CMC而言’這些異構形式組成總CEp〇分子的大約 1.5%。 CEPO分子之一個較顯著的部分是過度曱醯化的，亦 即包3 ί 0或11個胺曱醯基殘基者。過度胺曱醯化的 範圍是從對CEP0-1和CEP〇_2而言之大約n%到對 CEPO-CMC而言之大約22%。 攸肽作圖所得到的數據顯示發生在8個離胺酸和n端 之胺甲醯化作用的高度特定性。而且，肽作圖一般而言確 〇心了〜質里刀析的結果。至少大約9〇_95%的cEp〇分子顯 Μ所㈣_酸與N端上被胺甲醯基殘基特定的修 然而以些數據也顯不低度的和過度的胺曱醯化作用之 1355275 CEP〇種卖員。因為某些技術上的限制，低度胺甲酿化種類 的確切比率很難被測定，但其經估算是在高達大約㈣的 範圍’這與總質量分析中發現的數目相符合。然而，在Ep〇 的兩個不同的位置，Lys45和Lys97被鑑認出缺少胺曱醯 化作用的情形是最可能發生的。 a 叼、·且肪作圖中。叉奴τ日姐儿叼徑頰。#

次，因為技術上的限制，因此確切量之過度胺甲醯化的毛 類很難被定量出來。從吾人所得到的數據，可推想在_ 圖中極少過度胺曱醯化的種類被偵測到。與總質量分析才 比^有二分之一到二分之一過度胺甲醯化的種類藉由 作圖被鑑認出來。對於這項差異的—種合判解釋:= :有過度胺甲酿化的肽都被鑑認或以整確的量被鑑認过 “在LySC：圖譜中，偵測到顯著大量之未經過切割的自 :〇個胺甲醯基殘基之CEp〇種類，並且在胰蛋白酶作圖 f測到有二種肽包含一個多出的胺甲醯基殘基。這些片 段當中有兩者僅以微量被偵測到。第三種肽—接近c端之 CEPO狀胺基酸152_162，顯然佔三分之—的過度胺甲酿化 作用’並且可能是EPQ中非特定胺甲醯化作用的部位。 一在CEPO試樣和偽CEp〇試樣中未有顯著量之其他非 特定（不是與胺甲醯基相關的）修飾作用被所進行的其他任 何分析偵測到。 、 【圖式簡單說明j (無） 【主要元件符號說明】 (無） 64

Claims (1)

1355275

十、申請專利範圍：

100年9月日修正替換頁

1.一種用於生產—種藉由ESI質譜分析法測量時具有 少於大約40 /。集結的蛋白質與少於佔重量大約之過度 和低度胺曱醯化蛋白質之胺甲醯化促紅血球生成素蛋白質 的方法’言亥方法包括使一量之促紅血球生成素與一量之氰 知·鹽在足以使該促紅血球生成素上之離胺酸和Ν·端的胺基 酸的胺基有至少大約90%被胺曱醯化之溫度、pH與時間下 接觸，其中該與氰酸鹽接觸之促紅血球生成素蛋白質的濃 度是從大約2毫克/毫升到大約5毫克/毫升，該氰酸鹽的濃 度是從大約0.05M到大約2M，該溫度的範圍是從大約3(rc 到大約34°C ,該pH的範圍是從大約8到大約1〇 ,且該時 間是從大約1小時至5天。 2. 根據申凊專利範圍第1項的方法，其中該胺甲醯化促 紅血球生成素是人類促紅血球生成素。

3. 根據申請專利範圍第丨項的方法，其中該促紅血球生 成素是與該氰酸鹽在緩衝液存在下接觸的。 4. 根據申請專利範圍第3項的方法，其中該緩衝液是硼 酸鹽。 5. 根據申請專利範圍第3項的方法，其中該緩衝液的濃 度是從大約0.05M到大約2M。 6. 根據申請專利範圍第3項的方法，其中該緩衝液的濃 度大約是0.5M。 7. 根據申請專利範圍第丨項的方法，其中該與氰酸鹽接 觸之促紅血球生成素蛋白質的濃度大約為3毫克/毫升，該 65 1355275 100年9月if日修正替換頁 氰酸鹽的濃度大約為〇.5M ’該溫度大約為饥，該pH大 約為9.0，且該時間大約為24小時。 8.-種用於生產一種藉由ES][質譜分析法測量時具有 少於大約3%集結的蛋白質與少於佔重量大約術。之過度和 低度胺甲酿化蛋白暂# &田姑A , i 夂曰貝之胺甲醯化促紅血球.生成素蛋白質 方法’該方法包括： 、 ^ (a)使一量之促紅血球生成素與一量之氰酸鹽在足以使 该促紅血球生成素上之離胺酸和N-端的胺基酸的胺基有至 少大約9〇%被胺尹醯化之溫度、pH與時間下接觸；以及 (b)利用陰離子交換·、陽離子交換、厭水性交互作用色 層分析術、逆相色層分析術、親和性色層分析術或分子大 小排除法色層分析術來純化該胺曱醯化促紅血球生成素， 其中5亥與氰酸鹽接觸之促紅血球生成素蛋白質的濃度 疋從大約2毫克/毫升到大約5毫克/毫升，該氰酸鹽的濃度 是從大約0.05M到大約2M，該溫度的範圍是從大約30°C到 大約34°C ’該PH的範圍是從大約8到大約1〇，且該時間 是從大約1小時至5天。 9·根據申請專利範圍第8項的方法，其中該胺甲醯化促 紅血球生成素是人類促紅血球生成素。 10. 根據申請專利範圍第8項的方法，其中該促紅血球 生成音是與該氰酸鹽在緩衝液存在下接觸的。 11. 根據申請專利範圍第1 〇項的方法，其中該緩衝液是 硼酸鹽。 12. 根據申請專利範圍第1〇項的方法，其中該緩衝液的 66 I3552々5 '農度疋從大約〇·〇5Μ到大約2M。 13·根據申請專利範圍第10項的方法 濃度大約是0.5Μ。 1〇〇年9月、％ 其中該緩 修正替換頁 衝液的 14.根據申請專利範圍第8項的方法，直中 -甲孩與氰酸鹽 接觸之促紅血球生成素蛋白質的濃度大約為3毫克/毫升， 該氰酸鹽的濃度大約為0.5Μ，該溫度大約為32t：，該ρΗ 大約為9.0，且該時間大約為24小時。

十一、圖式： (無）

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