CN1985907A - 山楂核提取物对病毒的作用及抗病毒药物的应用 - Google Patents

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Abstract

山楂核为蔷薇科植物山里红Crataegus pinnatifida Bge.var majorN.E.Br、山楂C.pinnatifida Bge、野山楂C.cuneata Sieb.et Zucc、红果hawthorn等的成熟果核。本发明为首次发现山楂核的提取物对禽流感H9N2，H7N2，H6N2，H5N1和H5N2病毒以及新城疫(F4)病毒的抑制和攻毒保护作用。本发明的目的是发掘山楂核的新用途，研制山楂核及其提取物作为新的人、禽和兽病毒的预防和治疗药物。

Description

山楂核提取物对病毒的作用及抗病毒药物的应用
本发明为山楂核的提取物C对禽流感H9N2，H7N2，H6N2，H5N2和H5N1病毒以及新城疫(F4)病毒的抑制和攻毒保护作用，以及将提取物C用于对人、禽和兽病毒的预防治疗药物的新用途。
山楂为蔷薇科植物山里红Crataegus pinnatifida Bge.var major N.E.Br.、山楂C.pinnatifida Bge、野山楂C.cuneata Sieb.et Zucc和红果hawthorn等的成熟果实。均入中药，主要用于消食健胃、腹脘涨满、心腹刺痛和高血脂等症。山楂祛皮肉的种子部分即为山楂核，民间用于治疗食积、疝气和难产等疾病。有报道山楂核的提取物有抗细菌的作用。山楂核在我国和世界范围内有巨大的蕴藏量。
迄今为止，未见山楂核及其提取物对禽流感H9N2，H7N2，H6N2，H5N1和H5N2，以及新城疫病毒的抑制作用的报道，山楂核作为抗病毒的应用也同样没有见到报道。本发明从山楂核中分离得到了原儿茶酸、没食子酸、儿茶酚、对羟基苯甲酸、熊果酸、二十九烷醇-10、豆甾醇、槲皮素、金丝桃甙、酒石酸等，这些化合物同样没有见到关于对上述禽流感病毒及新城疫病毒的抑制作用的报道，这些提取物作为抗病毒的应用也同样没有见到报道。
本发明首次发现山楂核的提取物对H9N2，H7N2，H6N2，H5N2和H5N1病毒以及新城疫病毒的抑制作用。本发明的目的是发掘山楂核的新用途，研制山楂核及其提取物作为新的抗病毒或抗病毒疾病的药物。
发明过程：
一  化学部分
1提取分离将山楂核粉碎后，用有机溶剂、或含水的有机溶剂提取。这些溶剂可以是烷烃类(如：石油醚、己烷、丁烷等)；也可以是酯类(如乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸丙酯等)也可以是醇类(如：乙醇、丁醇或含水的上述醇类)，上述提取物经过减压低温浓缩，或喷雾干燥即得到的提取物A。将提取后的山楂核进行蒸馏得到提取物B。将A和B按一定的比例混合，得到提取物C。
2定性分析
三氯化铁反应：三氯化铁1.0g，用10％的乙醇定容于50ml，取提取物C约0.1g，用乙醇溶解，用毛细管点在滤纸上，用喷雾器喷洒三氯化铁试剂，然后用电吹风加热，显蓝黑色斑点。
硫酸——乙醇反应：配制成10％硫酸乙醇溶液。取提取物C(约0.1g)，用2.0ml蒸馏水溶解，用毛细管点在滤纸上，用喷雾器喷洒10％硫酸乙醇溶液试剂，然后用电吹风加热，即显红棕色。
薄层层析(TLC)检查：取提取物C少许，点在硅胶板上，显示出至少5～10个斑点.展开剂：石油醚∶乙酸乙酯＝55～5∶10～1；显色剂为10％硫酸乙醇溶液。
提取物C深褐色的固体，其水溶液的PH＝2～4
二  药学部分
1鸡胚SPF十日龄鸡胚和21日龄SPF公鸡购自北京梅里亚维通实验动物公司，实验动物许可证号为SCYK(京)2005-0001；SPF鸡饲养在空气滤菌、饮水和饲料经过消毒的生物安全三级实验室。
2毒株新城疫病毒为北京株强毒(F4)、购自中国兽药监察所，测定病毒对SPF鸡胚的半数感染量为107.0ELD50，对21日龄SPF鸡半数致死量(LD50)为104.0LD50。禽流感H9N1～3亚型、H5 N1～5亚型用前复壮，病毒对SPF鸡胚半数感染量分别为108.9ELD50和107.5ELD50。禽流感H9N1～3亚型对21日龄SPF鸡的半数感染量为106.9LD50。
3提取物C抑制鸡胚新城疫病毒试验提取物C按对照5～40mg/mL分别与等量的104ELD50的新城疫病毒液混合，在25±1℃条件下作用5～20min，分别接种10枚SPF鸡胚的尿囊腔，27～37℃下孵化至60～120小时，观察鸡胚情况，弃去死亡鸡胚，收集尿囊液，测定其血凝效价，并观察鸡胚的病理学变化[1]。
4提取物C抑制SPF鸡胚禽流感病毒试验将提取物C5～40mg/mL分别与一定量的H9N2，H7N2，H6N2，H5N2和H5N1病毒混合，接种10天的SPF鸡胚的尿囊腔，27～37℃下孵化至60～120小时，观察鸡胚的存活情况，收集尿囊液，测定血凝效价[2]。
5提取物C对SPF鸡禽流感H9N1和SPF鸡新城疫(F4)病毒的攻毒保护试验分别以每次5～200mg/只，经口给药，每日3次。第五天后注射病毒0.1～0.2mL/只，攻毒后继续给药，观察各项指标。
实施列：
实施例1提取与分离
取山楂核1KG粉碎过40目筛，筛过物用己烷提取，每次用己烷2升，提取三次。合并，减压蒸发干，得到己烷提取物50g；药渣用正丁醇提取，每次用乙醇3升，提三次，合并，减压蒸发干，得到正丁醇提取物30g；药渣用再3升乙醇提取，得到乙醇提取物，减压蒸发干，得到乙醇提取物43g；药渣加热挥发净溶剂，在60～300℃常压蒸馏，得到蒸馏物53g。将己烷、正丁醇、乙醇提取物与蒸馏物合并，即得到药用有效提取物。
上述氯仿、正丁醇、乙醇和水的4种提取物，均对三氯化铁和硫酸——苯酚反应成阳性。
薄层层析(TLC)检查：取提取物C少许，点在硅胶板上，显示出至少6个斑点(如下图)。展开剂：石油醚∶乙酸乙酯＝20∶6，显色剂为10％硫酸乙醇溶液。
实施例2提取物C的颗粒剂
将100g提取物C用水溶解，加入聚丙烯酸钠20g、羧甲基纤维素纳20g和糊精1200g。再加入药用淀粉660g，按照常规的方法制成颗粒剂2000g。
实施例3提取物C的口服液
将100g提取物C用水溶解，用100目滤布进行过滤，加入羧甲基纤维素纳100g，混合均匀，用水稀释至2000ML分装成100ML/瓶。
实施例4提取物C对SPF鸡胚新城疫病毒增殖的抑制
将提取物C用生理盐水分别稀释为30、20、10和5mg/mL，与新城疫病毒作用20分钟后接种鸡胚，SPF鸡胚全部存活。对照组鸡胚全部死亡，鸡胚的尿囊液存在血凝特性，血液凝集效价最高达Log27.50±1.1(表1)。
表1提取物C抑制鸡胚新城疫病毒增殖
    (mg/只)     鸡胚数   死亡数 存活数 病毒效价(Log2)
    3020105对照组     88888   00008 88880 00007.50±1.1
实施例5提取物C对SPF鸡新城疫病毒的预防效果
将提取物C分别给鸡口服80、40、20和10mg/只，接种新城疫强毒(F4)后，试验组SPF鸡全部存活，从10mg/只组鸡的气管和喉头中分离病毒呈阳性(表2)。表明提取物C能有效有效控制新城疫病毒对SPF鸡造成的死亡。
表2提取物C防治SPF鸡新城疫病毒效果
提取物C口服(mg/只) 数量(只)     死亡     胃、肠道出血性病变     病毒分离
80402010对照组 55555     00015     00135     ---+(5/5)+(5/5)
实施例6提取物C在SPF鸡胚上对禽流感病毒的抑制
将提取物C用生理盐水分别稀释为30、20、10和5mg/mL，分别与禽流感H9N2，H7N2，H6N2，H5N1和H5N2病毒混合后进行接种。对照组鸡胚全部死亡，H9N2，H7N2和H6N2全部存活，H5N1和H5N2和H5N1鸡胚大部存活，30、20和10mg可以全部保护鸡胚存活，5mg剂量组5/8～7/8被保护。接种各种亚型禽流感病毒后，对照组和部分死亡鸡胚的尿囊液存在血凝特性，(表3，4)。
表3提取物C抑制禽流感病毒的SPF鸡胚存活数
    mg/只   数量  鸡胚存活数
3020105对照 88888  H9N288882     H7N288881     H6N288880     H5N288850   H5N188870
表4提取物C抑制SPF鸡胚禽流感病毒效价
    mg/只 数量     鸡胚存活数
3020105对照 88888     H9N200009.3±1.2     H7N200009.2±1.3     H6N288888.3±1.50     H5N20006.2±1.39.9±2.1     H5N10006.3±1.79.3±2.5
实施例7提取物C对SPF鸡胚鸡禽流感病毒的防治效果
将提取物C分别给SPF鸡胚鸡口服100、50、25和17mg/只使用禽流感H9N1攻毒后，试验组和对照组均未出现死亡鸡，仅发现17mg/只组攻毒48小时后出现咳嗽流鼻液症状等症状。剖检发现鸡出现不同程度的气管淤血。对照组出现50％的气管环发红。(表5)。
表5提取物C抑制SPF鸡禽流感病毒H9N1效果
    提取物C(mg/只) 鸡数量(只)     死亡     气管发病   病毒分离
    100502517对照组 55555     00011     00125   ---+(5/5)+(5/5)
实施例8提取物C口服液对SPF鸡鸡新城疫病毒的防治效果
将提取物C分别给SPF鸡口服2、1和0.5ml/只，接种新城疫强毒(F4)后，对照组全部死亡，给药组SPF鸡全部存活(表6)。由此可见提取物C能有效降低病毒造成的胃肠道出血性病变，从而有效控制新城疫造成的死亡。
表6提取物C防治鸡新城疫病毒效果
提取物C口服(ml/只) 数量(只) 死亡 胃、肠道出血性病变     病毒分离
210.5对照组 5555 0005 0005     ---+(5/5)

Claims (6)

1、山楂核及其提取物作为抗病毒和抗病毒性疾病的预防和治疗药物。
2、根据权利1所述的山楂核经过水或有机溶剂或干蒸馏后所得的提取物。
3、权利要求1和2所述山楂核及其提取物抗病毒的用途。其特征是对禽流感H9N2，H7N2，H6N2，H5N1和H5N2以及新城疫病毒的抑制作用和攻毒保护作用。
4、山楂核及其提取物用于人、畜和禽病毒性疾病的预防和治疗药物。
5、山楂核及其提取物用于农作物、花卉的病毒性疾病的治疗药物
6、山楂核及其提取物的制剂，包括；液体制剂(口服液，滴鼻液)、固体制剂(片剂，胶囊剂和颗粒剂等)，气溶胶剂和涂布剂。
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