CN1982891A - 测定神经生长因子含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种新的高效液相凝胶色谱法测定制剂中神经生长因子含量的方法，色谱条件为：(1)凝胶色谱柱：分子量检测范围为10000～500000道尔顿，孔径为200～300埃的凝胶柱；(2)柱温：室温；(3)检测波长：205～220nm；(4)流速：0.6～1.0ml/min；(5)流动相：pH值为6.5～7.2，浓度为0.07～2.0mol/L盐溶液或缓冲液。该方法采用离子强度为0.07～2.0M的盐溶液或缓冲液为流动相。能够大大提高制剂中神经生长因子的检测限，同时排除了制剂中人血白蛋白等辅料的干扰。

Description

测定神经生长因子含量的方法
技术领域
本发明涉及一种新的高效液相凝胶色谱法测定制剂中的神经生长因子含量的方法。
背景技术
神经生长因子(NGF)是神经系统最主要的活性成分之一，它能维持交感神经和感觉神经细胞的生存，影响中枢神经元的存活，促进神经细胞的分化，对保护神经系统的正常功能具有重要的作用，我国已经批准神经生长因子制剂作为药物销售和使用。
现有的神经生长因子制剂中NGF的含量在4～30μg/支，采用人血白蛋白作为保护剂，由于人血白蛋白和NGF都是蛋白质，人血白蛋白在制剂中的含量大大高于NGF，影响了NGF的定量测定。为解决这个难题，人们尝试了多种检验方法，如Lowry法、紫外吸收法、Bradford法和ELISA法等，但都因无法排除人血白蛋白的干扰或受检测方法本身的灵敏度所限而失败。我们曾经申报过用凝胶色谱法分析NGF的含量，流动相为0.01～0.07M磷酸盐缓冲液，解决了NGF含量无法定量分析的问题。后来我们经过进一步大量实验发现，流动相的离子强度将在很大程度上影响NGF在色谱柱上的洗脱程度。已申报的专利中，流动相的离子强度为0.01～0.07M磷酸盐缓冲液，最低检测限为10μg/ml，我们将流动相的离子强度更优选为0.15～0.5M磷酸缓冲液时，最低检测限为2μg/ml，灵敏度提高了5倍，即使在制剂中NGF含量很低的情况下，也能准确定量检出，提高了分析的准确度。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的测定制剂中的神经生长因子含量的方法。
在高效液相凝胶色谱分析中选用盐溶液和缓冲液作为流动相，同时控制流动相中的离子强度可以达到准确定量分析的目的。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种测定制剂中神经生长因子含量的方法，该方法为凝胶色谱法，使用高效液相色谱仪检测，色谱条件为：
(1)凝胶色谱柱：分子量检测范围为10000～500000道尔顿，孔径为200～300埃的凝胶柱；
(2)柱温：室温；
(3)检测波长：205～220nm；
(4)流速：0.6～1.0ml/min；
(5)流动相：pH值为6.5～7.2，浓度为0.07～2.0mol/L盐溶液或缓冲液。
其中流动相优选是：磷酸二氢钠水溶液、醋酸铵水溶液、硫酸钠(钾)水溶液、柠檬酸钠(钾)盐缓冲液、甲酸铵水溶液、氯化钠(钾)水溶液、Tris-醋酸缓冲液、醋酸钠(钾)盐缓冲液或磷酸钠(钾)盐缓冲液；更优选磷酸钠(钾)盐缓冲液。
使用高效液相色谱法中的凝胶色谱法对制剂中NGF的含量进行测定，其基本原理是通过流经色谱柱的各种物质的分子量的差异将其分离，分子量越大，保留时间越短。由于每种物质在一定条件下具有特定的保留时间，因此可以通过色谱图上的保留时间获知目的峰的位置及相关参数，并通过上述参数计算出目的物的含量。选用凝胶柱的最基本原则是其检测范围包含待检物质的分子量。NGF单体的分子量为13.6kD，其二聚体的分子量为26kD，故本发明选用了分子量检测范围在10000～50000道尔顿的凝胶柱作为分析用色谱柱。波长选取的标准与待检物质的光吸收性质有关，对一种蛋白质或多肽来讲，其最大吸收波长是固定的。通过紫外扫描，发现NGF在205～220nm波长均有光吸收，可作为检测波长。
所述凝胶色谱柱优选TSK G3000 SW XL，7.8×300，5μ，(TOSOH，日本)、SHODEXProtein KW-804(SHODEX，日本)或BSA-7(MN，德国)，Phenomenex K3(Phenomenex，美国)。这些柱子的分子量范围均在10000～500000道尔顿，孔径为200～300埃。
通过实验，摸索出本发明的较佳实施方案，其中流动相的pH值为7.0，流速为0.6～1.0ml/min，检测波长为214nm。
以上凝胶色谱法可以使用外标法对制剂进行测定。
所述外标法包括如下步骤：
(1)作标准曲线：取含量已知的NGF纯品为标准品，梯度稀释，以磷酸缓冲液为流动相，过凝胶色谱柱，在检测波长下检测，记录色谱图，获取保留时间、峰高、峰面积等参数，得到标准曲线和线性范围；
(2)外标法测定NGF含量：在线性范围内选择合适的浓度，配制对照溶液和样品溶液，在选定的色谱条件下进行测定，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，即得。
实验表明：
(1)同一份样品溶液，进样量20μl，当流动相为0.05M磷酸盐缓冲液时，NGF峰面积为752103，峰高为28955，最低检测限为10μg/ml。当流动相为0.25M磷酸盐缓冲液时，NGF峰面积为3215088，峰高为128628，最低检测限为2μg/ml。检测限越低，则灵敏度越高，定量分析越准确。通过最低检测限可以算出本发明方法比对照方法灵敏度提高5倍。见附图1及附图2。
(2)离子强度为0.07～2.0M时，神经生长因子主峰与白蛋白主峰分离度大于1.5，不存在辅料峰干扰问题，制剂中神经生长因子主峰面积均可定量计算。见实施例1、实施例2。
(3)我们将流动相中离子强度优选为0.10M～0.75M时，制剂中神经生长因子主峰面积响应值增加，同样可以定量计算。见实施例3和实施例4。
(4)我们将流动相中离子强度更优选为0.15M～0.5M时，制剂中神经生长因子主峰面积响应值最大，灵敏度最高。见实施例5和实施例6。
本发明的优点是：采用离子强度为0.07～2.0M的盐溶液或缓冲液为流动相，能够大大提高制剂中神经生长因子的检测限，同时排除了制剂中人血白蛋白等辅料的干扰。
附图说明
图1显示了流动相为0.05M磷酸盐缓冲液时的HPLC色谱峰图谱，NGF峰保留时间：13min，NGF峰面积为752103，峰高为28955；
图2显示了流动相为0.25M磷酸盐缓冲液时的HPLC色谱峰图谱，NGF峰面积为3215088，峰高为128628，与图1结果相比可得：流动相的离子强度提高5倍后，NGF峰面积提高为原来的4.3倍，峰高提高为原来的4.4倍；
图3显示了流动相为0.07M磷酸二氢钠水溶液时的HPLC色谱峰图谱；
图4显示了流动相为2M醋酸铵水溶液时的HPLC色谱峰图谱，图3和图4的结果说明：当离子强度在0.07～2.0M时，神经生长因子主峰与白蛋白主峰分离度均大于1.5，不存在辅料峰干扰问题，制剂中神经生长因子主峰面积均可定量计算；
图5显示了流动相为0.10M硫酸钠水溶液时的HPLC色谱峰图谱；
图6显示了流动相为0.75M柠檬酸钠盐缓冲液时的HPLC色谱峰图谱，图5和图6的结果说明：将流动相中离子强度优选为0.10M～0.75M时，神经生长因子主峰与白蛋白主峰分离度均大于1.5，不存在辅料峰干扰问题，同时制剂中神经生长因子主峰面积响应值有所增加，同样可以定量计算；
图7显示了流动相为0.15M Tris-醋酸缓冲液时的HPLC色谱峰图谱；
图8显示了流动相为0.5M醋酸钠盐缓冲液时的HPLC色谱峰图谱；图7和图8的结果说明：将流动相中离子强度更优选为0.15M～0.5M时，制剂中神经生长因子主峰面积值最大。
具体实施方式
实施例1：采用0.07mol/L磷酸二氢钠水溶液流动相。
一色谱条件：
(1)仪器：使用日本岛津Shimadzu LC-10Avp高效液相色谱仪；
(2)凝胶色谱柱：TSK G3000SWXL 7.8×3.0mm，内径0.5μm(TOSOH日本)；
(3)柱温：室温；
(4)检测波长：214nm；
(5)流速：0.8ml/min；
(6)流动相pH值：7.0。
二实验步骤
(1)样品处理：取神经生长因子制剂一支，精密加入流动相0.5ml，轻摇使溶解，作为供试品溶液。
(2)对照品处理：精密量取鼠神经生长因子对照品(取小鼠颌下腺，经离子交换层析和分子筛分离纯化出NGF，按《中国生物制品规程2000版》要求方法检验纯度＞98％)适量，用流动相制成每1ml中约含20μg的溶液，作为对照品溶液。
(3)取对照品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。获取保留时间、峰高、峰面积等参数。
结果：神经生长因子主峰面积A＝914086，对照品面积A＝903234，用外标法以峰面积计算，样品含量为101.2％。神经生长因子主峰与白蛋白主峰分离度大于1.5，样品主峰保留时间与对照品保留时间一致。HPLC色谱峰图谱见附图3。
实施例2：采用2.0mol/L醋酸铵水溶液为流动相。
一色谱条件：同实施例1。
二实验步骤
(1)样品和对照品处理同实施例1。
(2)精密吸取供试品溶液和对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。获取保留时间、峰高、峰面积等参数。
结果：神经生长因子主峰面积A＝923186，对照品面积A＝921096，用外标法以峰面积计算，样品含量为100.2％。神经生长因子主峰与白蛋白主峰分离度大于1.5，样品主峰保留时间与对照品保留时间一致。HPLC色谱峰图谱见附图4。
实施例3：采用0.10mol/L硫酸钠水溶液为流动相。
一色谱条件：同实施例1。
二实验步骤
(1)样品和对照品处理同实施例1。
(2)精密吸取供试品溶液和对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。获取保留时间、峰高、峰面积等参数。
结果：神经生长因子主峰面积A＝3147076，对照品面积A＝3098921，用外标法以峰面积计算，样品含量为101.6％。神经生长因子主峰与白蛋白主峰分离度大于1.5，样品主峰保留时间与对照品保留时间一致。HPLC色谱峰图谱见附图5。
实施例4：采用0.75mol/L柠檬酸钠盐缓冲液为流动相。
一色谱条件：同实施例1。
二实验步骤
(1)品和对照品处理同实施例1。
(2)精密吸取供试品溶液和对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。获取保留时间、峰高、峰面积等参数。
结果：神经生长因子主峰面积A＝3044833，对照品面积A＝3001632，用外标法以峰面积计算，样品含量为101.4％。神经生长因子主峰与白蛋白主峰分离度大于1.5，样品主峰保留时间与对照品保留时间一致。HPLC色谱峰图谱见附图6。
实施例5：采用0.15mol/LTris-醋酸缓冲液为流动相。
一色谱条件：同实施例1。
二实验步骤
(1)品和对照品处理同实施例1。
(2)精密吸取供试品溶液和对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。获取保留时间、峰高、峰面积等参数。
结果：神经生长因子主峰面积A＝3444833，对照品面积A＝3405687，用外标法以峰面积计算，样品含量为101.1％。神经生长因子主峰与白蛋白主峰分离度大于1.5，样品主峰保留时间与对照品保留时间一致。HPLC色谱峰图谱见附图7。
实施例6：采用0.5mol/L醋酸钠盐缓冲液为流动相。
一色谱条件：同实施例1。
二实验步骤
(1)品和对照品处理同实施例1。
(2)精密吸取供试品溶液和对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。获取保留时间、峰高、峰面积等参数。
结果：神经生长因子主峰面积A＝3463376，对照品面积A＝3410533，用外标法以峰面积计算，样品含量为101.5％。神经生长因子主峰与白蛋白主峰分离度大于1.5，样品主峰保留时间与对照品保留时间一致。HPLC色谱峰图谱见附图8。

Claims (9)

1、一种高效液相凝胶色谱法测定制剂中的神经生长因子含量的方法，色谱条件为：(1)凝胶色谱柱：分子量检测范围为10000～500000道尔顿，孔径为200～300埃的凝胶柱；(2)柱温：室温；(3)检测波长：205～220nm；(4)流速：0.6～1.0ml/min；(5)流动相：pH值为6.5～7.2的盐溶液或缓冲液；其特征在于：流动相的离子强度为0.07～2.0M。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述凝胶色谱柱是TSKG3000 SW XL、SHODEX Protein KW-804、BSA-7或Phenomenex K3。
3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述流动相的pH值为7.0。
4、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述流速为0.8ml/min。
5、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述检测波长为214nm。
6、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：流动相中离子强度范围是：0.10～0.75M盐溶液和缓冲液。
7、根据权利要求2所述的方法，其特征在于：流动相中离子强度范围是：0.15～0.5M盐溶液和缓冲液。
8、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：流动相选自磷酸钠盐或钾盐缓冲液、Tris-醋酸缓冲液、醋酸钠盐或钾盐缓冲液、柠檬酸钠盐或钾盐缓冲液、硫酸钠盐或钾水溶液、氯化钠盐或钾水溶液、醋酸铵水溶液、甲酸铵水溶液中的一种。
9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于：流动相是磷酸钠缓冲液。
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