CN1978651B

CN1978651B - 编码产黄青霉苯乙酸羟化酶的基因及其应用

Info

Publication number: CN1978651B
Application number: CN2005101261584A
Authority: CN
Inventors: 王富强; 任志红; 刘静; 戴梦; 郑桂珍; 王泽建; 赵颖; 王红怡; 贾茜; 贺建功
Original assignee: NCPC New Drug Research and Development Co Ltd
Current assignee: Huabei Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 2005-11-30
Filing date: 2005-11-30
Publication date: 2010-11-17
Anticipated expiration: 2025-11-30
Also published as: CN1978651A

Abstract

本发明涉及来自产黄青霉的新的编码苯乙酸羟化酶的基因(pahB)，该基因编码的多肽及含有该基因的表达载体，并证明了苯乙酸能显著诱导该基因的表达。本发明为利用基因工程手段改造产黄青霉菌从而提高青霉素产量提供了方向和靶点，对于青霉素的生产具有重要意义。

Description

编码产黄青霉苯乙酸羟化酶的基因及其应用

技术领域

本发明涉及新的分离的多核苷酸，具体地说涉及来自产黄青霉的新的编码苯乙酸羟化酶的基因(pahB)。

本发明还涉及该基因编码的多肽。

本发明还涉及含有该基因的表达载体。

本发明也提供了新基因在提高产黄青霉菌的青霉素产量中的应用。

背景技术

以青霉素和头孢菌素为代表的β-内酰胺类抗生素作为最重要的抗菌药物，占据了世界抗感染药物市场的2/3，是目前已知的抗生素中毒性最低，品种最多，临床应用最广的一类抗生素。

青霉素由丝状真菌产黄青霉(Penicillium chrysogenum)生产，由于广大的市场需求，人们对青霉素生产菌的改良投入了巨大的精力。基于传统的诱变筛选技术，现在的工业生产菌株的生产水平达到了相当高的水平。而分子生物学技术的发展为我们揭示β-内酰胺类抗生素的生物合成机制提供了帮助。

研究表明，青霉素的生物合成步骤由三个前体氨基酸，α-氨基己二酸、半胱氨酸、缬氨酸开始，经三肽合成酶(ACVS)催化缩合成LLD-ACV三肽，在异青霉素N合成酶作用下环化形成异青霉素N，最终在乙酰辅酶A：6-氨基青霉烷酸酰基转移酶(AAT)催化下侧链交换得到青霉素。生物合成相关的三个关键酶的编码基因都已克隆(Ingolia & Queener，Med.Res.Rev.9：245-264，1989；Aharonowitz，et al.，Ann.Rev.Microbiol.46：461-495，1992)。

在青霉素的工业生产中，苯乙酸(Phenylacetic acid，PA)被用来作为青霉素G的侧链前体。在发酵过程中，苯乙酸首先被活化为辅酶A硫脂，再在AAT作用下经转酰基作用，替代异青霉素N的L-α-氨基己二酰侧链，形成青霉素G。由于AAT具有较宽的底物范围，因此在发酵过程中添加苯乙酸可以促进青霉素G。由于AAT具有较宽的底物范围，因此在发酵过程中添加苯乙酸可以促进青霉素G的生物合成。作为青霉素G的侧链前体，其利用效率很大程度上取决于它的毒性以及青霉菌对其的氧化能力。苯乙酸在生产成本中占有相当的比重，提高苯乙酸的利用效率是青霉素菌种改良过程中非常重要的内容。

在Pseudomonas fluorescens(Kunita，N.，Med.J.Osaka Univ.3：703-708，1955)，Aspergillus niger(Kluyver，A.J.&J.C.M.van Zijp.，Antonie vanLeeuwenhoek17：47-55，1951)，Nocardia salmonicolor(Sariaslani，F.S.et al.Biochem.J.140：31-45，1974)，以及Aspergillus nidulans(Mingot，J.M.et al.J.Biol.Chem.274，14545 14550，1999)，Penicillium chrysogenum(Wisconsin Q-176(Isono，M.J.，Agric.Chem.Jpn.27：297-301，1953；Nishikida，T.，J.Antibiot.4：299-300，1951)等微生物中，苯乙酸的代谢是2位羟化形成2-OHPA，然后依次形成尿黑酸(homogentisic acid)、马来酰乙酰乙酸(maleylacetoacetic acid，)富马酰乙酰乙酸(fumarylacetoacetic acid)最后水解成延胡索酸和乙酰乙酸进入三羧酸循环。

作为青霉素产生菌之一的构巢曲霉(Aspergillus nidulans)能够在苯乙酸为唯一碳源的培养基上生长，其苯乙酸代谢的第一步2位羟化由一个P450单加氧酶催化，该酶由phacA基因编码，该基因的失活导致了青霉素产量提高了5倍，同时使苯乙酸的代谢能力部分丧失(Mingot，J.M.et al.J.Biol.Chem.274，14545 14550，1999)。在产黄青霉中，相应的P450单加氧酶由pahA基因编码。PahA与PhacA氨基酸序列的一致性为84％。研究表明，pahA基因的表达受苯乙酸诱导，而其表达水平则与菌种的青霉素生产能力成负相关。传统的诱变及分离筛选，造成高产产黄青霉中该酶的苯乙酸氧化能力显著下降，青霉素生产能力的提高。序列分析发现高产菌株PahA序列的181位发生的L→F突变是造成该酶功能降低的原因(-Sáiz，M. et al.J.Bacteriol.183，54655471，2001)。

尽管如此，在工业发酵条件下，发酵液中仍能够检测到相当数量的2-羟苯乙酸(2-OHPA)的存在，这表明即使在工业菌株中，仍有相当部分的侧链前体被代谢掉了。是非特异的氧化、PahA的突变仅部分丧失了其氧化活性、还是在产黄青霉中存在其他的氧化机制尚不得而知。深入研究苯乙酸的氧化机制，发现新的苯乙酸氧化关键基因，可为青霉菌生产菌种的选育提供基因改造的靶点，对提高产量、降低发酵成本意义重大。

发明内容

本发明的一个目的在于提供新的编码产黄青霉苯乙酸羟化酶的基因，定名为pahB。

本发明的另一个目的在于提供上述基因编码的多肽。

本发明的再一个目的在于提供含有上述基因序列的表达载体。

根据本发明的一方面，编码产黄青霉谷苯乙酸羟化酶的基因，来源于产黄青霉菌(Penicillin chrysogenum)，定名为pahB。该基因ORF长为1551bp，编码517个氨基酸的蛋白，与PahA(516aa，AAF21759)、PhacA(518aa，CAB43093)长度相近，推测分子量为57.7kDa。其氨基酸序列和PahA、PhacA的一致性分别为44％和42％。在其442-451位是P450蛋白家族保守的半胱氨酸血红素-铁配体信号序列-YGMGYRMCAG-([FW]-[SGNH]-x-[GD]-{F}-[RKHPT]-{P}-C-[LIVMFAP]-[GAD]，Prosite database entry PS00086)，与PahA(-YGAGSRMCAG-)、PhacA(-YGAGSRMCAG-)一样，苯丙氨酸残基(F)为酪氨酸(Y)所取代。基因表达研究表明，pahB的表达同样明显受到苯乙酸的诱导。

具体地说，本发明提供了新的分离的多核苷酸，其含有下述序列之一：

(1)序列表中的SEQ ID No：1所示的序列或SEQ ID NO：1的第43位～1593位核苷酸的序列；

(2)编码序列表中SEQ ID No：2所示蛋白质序列的多核苷酸序列。

上述涉及的多核苷酸还包括取代、缺失、和插入变体以及等位变体、剪接变体、片段、衍生物等，其中可以通过取代、缺失、插入或衍生一个或多个核苷酸。优选的这些多核苷酸是那些编码具有生物学活性的苯乙酸羟化酶的多核苷酸。

本领域技术人员可以理解的是，上述的分离的多核苷酸也包括那些与SEQID NO.1所示序列或SEQ ID NO：1的第43位～1593位核苷酸的序列具有较高同源性的序列，例如同源性大于90％、甚至95％、甚至98％的序列；还包括那些在严谨条件下可与SEQ ID NO.1所示序列或SEQ ID NO：1的第43位～1593位核苷酸的序列杂交的序列；或者可与上述序列互补的序列。

根据本发明的另一方面，提供新的多肽，其含有上述核苷酸序列所编码的氨基酸序列，即含有SEQ ID NO.2所示的序列，编码蛋白为产黄青霉(Penicillium chrysogenum)的苯乙酸羟化酶，其具有序列表中SEQ ID No：2的氨基酸残基序列的蛋白质或将SEQ ID No：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID No：2相同活性的由SEQID No：2衍生的蛋白质。

根据本发明的另一方面，本发明亦提供包括一种或多种上述多核苷酸的重组载体，以及包含上述多核苷酸的载体的基因工程宿主细胞。在优选的实施方案中，这种重组载体包括上述的多核苷酸，它编码含SEQ ID NO：2的多肽，其含SEQ ID NO：1的序列或SEQ ID NO：1的第43位～1593位核苷酸的序列所示的多核苷酸。

本发明也涉及到包括任何一种上述重组载体的宿主细胞。在已经构建载体之后，可以插入全部或部分载体至适合的宿主细胞，以便扩增和/或多肽表达。宿主细胞可以是原核生物宿主细胞(例如E.coli)或者真核生物宿主细胞(例如丝状真菌细胞、酵母细胞，昆虫细胞，或脊椎动物细胞)。

本发明还提供了新的基因在提高产黄青霉青霉素产量上的应用，由于pahB为苯乙酸分解代谢途径的关键基因，因此可以通过降低pahB的表达来提高青霉素生产工艺中的苯乙酸的利用效率，从而提高青霉素的产量。

本发明从产黄青霉中成功地分离获得了新的编码产黄青霉苯乙酸羟化酶的基因，并证明了苯乙酸能显著诱导该基因的表达，本发明为利用基因工程手段改造产黄青霉菌从而提高青霉素产量提供了方向和靶点，对于青霉素的生产具有重要意义。

附图的简要说明

图1为pahB基因的结构图。

发明的具体实施方式

下面结合附图，通过对本发明较佳实施例的描述，详细说明本发明。

在下面使用的试剂材料如无特别说明，均为市售分析纯试剂，购自天津试剂公司。

【实施例1】：pahB基因克隆

将产黄青霉菌Wis54-1255(ATCC28089)在YPD(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)培养基中培养24h，过滤收菌丝，取0.1g湿菌丝液N₂研磨，加1ml Trizol试剂(Invitrogen公司，15596-026)抽提产黄青霉总RNA，将所得产黄青霉总RNA溶解于DEPC水中，-70℃下保存备用。

为去除可能的DNA污染，取产黄青霉总RNA 5μg，在100μl反应体系内，加入5μl RQ1 RNase-Free DNase(Promega公司，M6101)，10μl RQ1 RNase-FreeDNase反应缓冲液(10×)，37℃保温30分，用酚：氯仿抽提，乙醇沉淀，溶于10μl DEPC水。取5μl去除DNA的RNA样品，用随机引物(RandomHexamers，Promega公司，C1181)进行反转录，得到cDNA，所用反转录酶为SuperScriptTM II RNase H-(Invitrogen公司，18064-022)。

以5’-tatatatcaacgtcaagatctatc-3’和5’-taccccaaatagataccaccaatg-3’为引物，以cDNA为模板进行PCR扩增，PCR条件为：94℃，5分；94℃ 1分，60℃ 1分，72℃ 2分-40循环；72℃ 7分；4℃保存。将RT-PCR产物按常规方法克隆测序，测序结果表明RT-PCR产物具有序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列，长度为1629bp。通过序列分析和GenBank数据库检索，表明该序列的开放阅读框架(Open Reading Frame，ORF)为自5’端的第43到第1593位碱基，长度为1551bp。在ORF起始密码子ATG前15bp处，同相位有终止密码子TAA，由此说明我们得到了该基因的全长序列，定名为pahB。

该基因ORF片段的读码框编码517个氨基酸，推测分子量为57.7kDa，如序列表中SEQ ID NO.2所示。该氨基酸序列与与产黄青霉苯乙酸羟化酶PahA(516aa，AAF21759)、构巢曲霉苯乙酸羟化酶PhacA(518aa，CAB43093)长度相近。其氨基酸序列和PahA、PhacA的一致性分别为44％和42％。。在其442-451位是P450蛋白家族保守的半胱氨酸血红素-铁配体信号序列-YGMGYRMCAG-([FW]-[SGNH]-x-[GD]-{F}-[RKHPT]-{P}-C-[LIVMFAP]-[GAD]，Prosite database entry PS00086)，与PahA(-YGAGSRMCAG-)、PhacA(-YGAGSRMCAG-)一样，苯丙氨酸残基(F)为酪氨酸(Y)所取代。

同时以提取的Wis54-1255菌株的基因组DNA为模版进行PCR扩增，引物及反应条件同上，得到1860bp的扩增产物，将其与RT-PCR产物序列比较，确认pahB基因有3个内含子，长度分别为97bp、67bp、67bp。

【实施例2】：pahB基因的表达受苯乙酸的诱导

将产黄青霉菌Wis54-1255(ATCC28089)按2×10⁶分生孢子/ml接种到种子培养基，在26℃下培养24小时，种子培养基配方为(g/l)：葡萄糖，30；乳糖，10；棉籽饼粉，10；酵母粉，10；玉米浆，10；(NH₄)₂SO₄，2；KH₂PO₄，1；CaCO₃，5；pH5.8。然后将种子培养物以5％接种量接种到发酵培养基，26℃下培养。发酵培养基为(g/l)：乳糖，120；棉籽饼粉，30；玉米浆，20；(NH₄)₂SO₄，5；KH₂PO₄，1；K₂SO₄，5；CaCO₃，10；pH6.5。

实验分为2组，一组每天正常补加苯乙酸前体，另一组为对照，不加苯乙酸，72小时后收取菌体提取总RNA，提取及处理方法见实施例1。

用SYBR Green试剂作实时定量PCR检测pahB基因的表达，仪器为ABIPRISM 7000定量PCR仪。根据pahB基因的cDNA序列，利用Primer Express软件设计定量PCR引物，AS006：5′-GCTGAACAGTGAGGAGTTGAC-3′

AA006：5′-CGCAAGAACCTTCGACAGAG-3′。以产黄青霉γ-actin基因(AF056975)为内标，act1：5′-CTCGCTGAGCGTGGTTACAC-3′

act2：5′-TTGATGTCACGGACGATTTCA-3′。引物由上海生工合成。定量PCR试剂为

Premix Ex Tag^TM试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司)。反应条件为：95℃，1分钟；95℃，15秒，60℃，1分钟，40循环。对定量PCR的结果C_T值进行换算，采用

法(Livak K.J.and T.D.SchmittgenMethods 25：402-408，2001)。结果，在不添加苯乙酸的情况下，pahB的表达水平非常低，苯乙酸能显著诱导pahB基因的表达，以不添加苯乙酸的表达量为1，则添加苯乙酸时pahB的表达提高了580倍(下表)。

以上对本发明的详细描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明做出各种改变和变形，只要未脱离本发明的精神，均应属于本发明权利要求所定义的范围。

SEQUENCE LISTING

<110>华北制药集团新药研究开发有限责任公司

<120>编码产黄青酶苯乙酸羟化酶的基因及其应用

<130>05P101406

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1629

<212>DNA

<213>产黄青霉菌(Penicillin chrysogenum)

<220>

<221>CDS

<222>(43)..(1593)

<223>ORF

<400>1

tatatatcaa cgtcaagatc tatcccataa ccatccagca cc atg gct atc gcc 54

Met Ala Ile Ala

1

gct gcc ctg gcg tcg cta caa ggc agt gtg atc gag tat ccc tac cac 102

Ala Ala Leu Ala Ser Leu Gln Gly Ser Val Ile Glu Tyr Pro Tyr His

5 10 15 20

tca cta gcc gcc gca gcc gtc ctc gcc ccc atc ctc tat gtc atc ctt 150

Ser Leu Ala Ala Ala Ala Val Leu Ala Pro Ile Leu Tyr Val Ile Leu

25 30 35

aat gag ttc att cgt gat gcc gcc cgc gtc aag ggt atg aag ggt ccg 198

Asn Glu Phe Ile Arg Asp Ala Ala Arg Val Lys Gly Met Lys Gly Pro

40 45 50

cgc gga ttg ccg ttg att gga aac ctg gcc cag att cgc aaa gat gcc 246

Arg Gly Leu Pro Leu Ile Gly Asn Leu Ala Gln Ile Arg Lys Asp Ala

55 60 65

gcg gag cag tat cgc ctc tgg tcg aaa aag cac ggc gct gtg tat cag 294

Ala Glu Gln Tyr Arg Leu Trp Ser Lys Lys His Gly Ala Val Tyr Gln

70 75 80

att cag ctg ggg aac atc ccc gtc gtt gtg gtc aac tct gct gcg tcg 342

Ile Gln Leu Gly Asn Ile Pro Val Val Val Val Asn Ser Ala Ala Ser

85 90 95 100

gca aaa gtg ctt ttc ggt cag aat gcg cag gct ttg agc tct agg ccc 390

Ala Lys Val Leu Phe Gly Gln Asn Ala Gln Ala Leu Ser Ser Arg Pro

105 110 115

gaa act tat act ttc cat aag att gtt tcc aat act ccc gga aca act 438

Glu Thr Tyr Thr Phe His Lys Ile Val Ser Asn Thr Pro Gly Thr Thr

120 125 130

atc ggc acc tcg cca tat agc gac tct ctg aag aga cgc aga aag ggc 486

Ile Gly Thr Ser Pro Tyr Ser Asp Ser Leu Lys Arg Arg Arg Lys Gly

135 140 145

gcc gcg tcg gct ctc aac cgg ccc tct gtc gat acg tac gtg tca cat 534

Ala Ala Ser Ala Leu Asn Arg Pro Ser Val Asp Thr Tyr Val Ser His

150 155 160

ttg gac gtc gag tca aag gcc ttc gtg gaa gag ctg tac aga tat gga 582

Leu Asp Val Glu Ser Lys Ala Phe Val Glu Glu Leu Tyr Arg Tyr Gly

165 170 175 180

aac cac ggg aag aca ccc gtc gat ccc atg gcc atg atc cag cgt ctg 630

Asn His Gly Lys Thr Pro Val Asp Pro Met Ala Met Ile Gln Arg Leu

185 190 195

agt ttg agt ttg gca ttg act ctg aac tgg ggc gtg cgt atc gct tca 678

Ser Leu Ser Leu Ala Leu Thr Leu Asn Trp Gly Val Arg Ile Ala Ser

200 205 210

cag gaa gag gaa ttg ttc gat gag atc acc gag gtg gag gaa gag atc 726

Gln Glu Glu Glu Leu Phe Asp Glu Ile Thr Glu Val Glu Glu Glu Ile

215 220 225

agt cgg ttc cga agc acc acc gga aac ctg cag gat tat atc cct ctt 774

Ser Arg Phe Arg Ser Thr Thr Gly Asn Leu Gln Asp Tyr Ile Pro Leu

230 235 240

ctg cgg ttg aac ccg ttt agc tcc aac tcg aag aaa gcc gcc gag atg 822

Leu Arg Leu Asn Pro Phe Ser Ser Asn Ser Lys Lys Ala Ala Glu Met

245 250 255 260

aga agg cgt cgg gac aag tac ctc ggt gcg ctt aat agt gac ttg gat 870

Arg Arg Arg Arg Asp Lys Tyr Leu Gly Ala Leu Asn Ser Asp Leu Asp

265 270 275

gat cgc atg gca aag ggg aca cat aag cct tgt att cag gcc aac gtt 918

Asp Arg Met Ala Lys Gly Thr His Lys Pro Cys Ile Gln Ala Asn Val

280 285 290

att atg gat aag gaa gct aag ctg aac agt gag gag ttg acg tcg att 966

Ile Met Asp Lys Glu Ala Lys Leu Asn Ser Glu Glu Leu Thr Ser Ile

295 300 305

agc ttg acc atg ctt tct ggt ggc ctt gac act gtc acc act ttg gtt 1014

Ser Leu Thr Met Leu Ser Gly Gly Leu Asp Thr Val Thr Thr Leu Val

310 315 320

gcg tgg agt ttg ggt ttg ctg gct caa cgt cct gat att cag gat cgg 1062

Ala Trp Ser Leu Gly Leu Leu Ala Gln Arg Pro Asp Ile Gln Asp Arg

325 330 335 340

gcg gcc aag gct atc cag gag atg tat ggc gag gat gat ccc atg tgc 1110

Ala Ala Lys Ala Ile Gln Glu Met Tyr Gly Glu Asp Asp Pro Met Cys

345 350 355

tct cct gac gat gat cag agg tgt gcg tac att gca gct ctg gtc aag 1158

Ser Pro Asp Asp Asp Gln Arg Cys Ala Tyr Ile Ala Ala Leu Val Lys

360 365 370

gaa tgt ctt cga ttc ttc act gta ctg cga tta gca ctt cct cgc act 1206

Glu Cys Leu Arg Phe Phe Thr Val Leu Arg Leu Ala Leu Pro Arg Thr

375 380 385

tca atc aaa gat atc acc tat aag gga atc acc att ccc aag ggc aca 1254

Ser Ile Lys Asp Ile Thr Tyr Lys Gly Ile Thr Ile Pro Lys Gly Thr

390 395 400

gtg ttc ttt ttg aat gcc tgg gcc tgc aac atg gac ccc gac gtg tgg 1302

Val Phe Phe Leu Asn Ala Trp Ala Cys Asn Met Asp Pro Asp Val Trp

405 410 415 420

act gac ccg gat gac ttc cgt ccc gag cga tgg ctc gag cag ccc gac 1350

Thr Asp Pro Asp Asp Phe Arg Pro Glu Arg Trp Leu Glu Gln Pro Asp

425 430 435

gcg cct ctc ttt acg tat ggt atg ggt tac cgg atg tgc gcc ggg tea 1398

Ala Pro Leu Phe Thr Tyr Gly Met Gly Tyr Arg Met Cys Ala Gly Ser

440 445 450

ctg cta gcc aat cgt gag ctc tac ctg gtc ttc atc cgc acc ctc aac 1446

Leu Leu Ala Asn Arg Glu Leu Tyr Leu Val Phe Ile Arg Thr Leu Asn

455 460 465

agc ttc cgc ctc gaa cct cat gac aaa aca gac tgt cac cct ctc cgg 1494

Ser Phe Arg Leu Glu Pro His Asp Lys Thr Asp Cys His Pro Leu Arg

470 475 480

ggt aac tcg gat ccg act agt ctg gtg gcc att cct caa aaa tat aag 1542

Gly Asn Ser Asp Pro Thr Ser Leu Val Ala Ile Pro Gln Lys Tyr Lys

485 490 495 500

gtc cga ttt gtg ccg aag aat gaa aag gct ctg tcg aag gtt ctt gcg 1590

Val Arg Phe Val Pro Lys Asn Glu Lys Ala Leu Ser Lys Val Leu Ala

505 510 515

cag tgaatggtgc cacattggtg gtatctattt ggggta 1629

Gln

<210>2

<211>517

<212>PRT

<213>产黄青霉菌(Penicillin chrysogenum)

<400>2

Met Ala Ile Ala Ala Ala Leu Ala Ser Leu Gln Gly Ser Val Ile Glu

1 5 10 15

Tyr Pro Tyr His Ser Leu Ala Ala Ala Ala Val Leu Ala Pro Ile Leu

20 25 30

Tyr Val Ile Leu Ash Glu Phe Ile Arg Asp Ala Ala Arg Val Lys Gly

35 40 45

Met Lys Gly Pro Arg Gly Leu Pro Leu Ile Gly Asn Leu Ala Gln Ile

50 55 60

Arg Lys Asp Ala Ala Glu Gln Tyr Arg Leu Trp Ser Lys Lys His Gly

65 70 75 80

Ala Val Tyr Gln Ile Gln Leu Gly Asn Ile Pro Val Val Val Val Asn

85 90 95

Ser Ala Ala Ser Ala Lys Val Leu Phe Gly Gln Asn Ala Gln Ala Leu

100 105 110

Ser Ser Arg Pro Glu Thr Tyr Thr Phe His Lys Ile Val Ser Asn Thr

115 120 125

Pro Gly Thr Thr Ile Gly Thr Ser Pro Tyr Ser Asp Ser Leu Lys Arg

130 135 140

Arg Arg Lys Gly Ala Ala Ser Ala Leu Asn Arg Pro Ser Val Asp Thr

145 150 155 160

Tyr Val Ser His Leu Asp Val Glu Ser Lys Ala Phe Val Glu Glu Leu

165 170 175

Tyr Arg Tyr Gly Asn His Gly Lys Thr Pro Val Asp Pro Met Ala Met

180 185 190

Ile Gln Arg Leu Ser Leu Ser Leu Ala Leu Thr Leu Asn Trp Gly Val

195 200 205

Arg Ile Ala Ser Gln Glu Glu Glu Leu Phe Asp Glu Ile Thr Glu Val

210 215 220

Glu Glu Glu Ile Ser Arg Phe Arg Ser Thr Thr Gly Asn Leu Gln Asp

225 230 235 240

Tyr Ile Pro Leu Leu Arg Leu Asn Pro Phe Ser Ser Asn Ser Lys Lys

245 250 255

Ala Ala Glu Met Arg Arg Arg Arg Asp Lys Tyr Leu Gly Ala Leu Asn

260 265 270

Ser Asp Leu Asp Asp Arg Met Ala Lys Gly Thr His Lys Pro Cys Ile

275 280 285

Gln Ala Asn Val Ile Met Asp Lys Glu Ala Lys Leu Asn Ser Glu Glu

290 295 300

Leu Thr Ser Ile Ser Leu Thr Met Leu Ser Gly Gly Leu Asp Thr Val

305 310 315 320

Thr Thr Leu Val Ala Trp Ser Leu Gly Leu Leu Ala Gln Arg Pro Asp

325 330 335

Ile Gln Asp Arg Ala Ala Lys Ala Ile Gln Glu Met Tyr Gly Glu Asp

340 345 350

Asp Pro Met Cys Ser Pro Asp Asp Asp Gln Arg Cys Ala Tyr Ile Ala

355 360 365

Ala Leu Val Lys Glu Cys Leu Arg Phe Phe Thr Val Leu Arg Leu Ala

370 375 380

Leu Pro Arg Thr Ser Ile Lys Asp Ile Thr Tyr Lys Gly Ile Thr Ile

385 390 395 400

Pro Lys Gly Thr Val Phe Phe Leu Asn Ala Trp Ala Cys Asn Met Asp

405 410 415

Pro Asp Val Trp Thr Asp Pro Asp Asp Phe Arg Pro Glu Arg Trp Leu

420 425 430

Glu Gln Pro Asp Ala Pro Leu Phe Thr Tyr Gly Met Gly Tyr Arg Met

435 440 445

Cys Ala Gly Ser Leu Leu Ala Asn Arg Glu Leu Tyr Leu Val Phe Ile

450 455 460

Arg Thr Leu Asn Ser Phe Arg Leu Glu Pro His Asp Lys Thr Asp Cys

465 470 475 480

His Pro Leu Arg Gly Asn Ser Asp Pro Thr Ser Leu Val Ala Ile Pro

485 490 495

Gln Lys Tyr Lys Val Arg Phe Val Pro Lys Asn Glu Lys Ala Leu Ser

500 505 510

Lys Val Leu Ala Gln

515

Claims

1.一种分离的多核苷酸，其为编码SEQ ID No：2所示的蛋白质序列的多核苷酸序列。

2.权利要求1所述的多核苷酸，其为SEQ ID No：1所示的序列或SEQ IDNO：1的第43位～1593位核苷酸的序列。

3.一种分离的多核苷酸，其为与权利要求1或2所述的多核苷酸完全互补的核苷酸序列。

4.由权利要求1或2所述的多核苷酸编码的多肽。

5.权利要求4所述的多肽，其具有SEQ ID NO.2所示的序列，具有苯乙酸羟化酶活性。

6.含有权利要求1或2所述的多核苷酸的表达载体。

7.含有权利要求6所述的表达载体的宿主细胞。

8.权利要求1或2所述的分离的多核苷酸在提高产黄青霉菌的青霉素产量中的应用。